（食品科学专业论文）两株乳酸乳球菌凝集淀粉性质及沉淀条件的研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 本文研究了酸浆中一株淀粉凝集菌和工业菌株a s j 9 在养浆过程中的性质的变化，两菌株表 面凝集淀粉物质的本质，以及影响两菌株沉淀淀耪的外界因素，找到两菌株沉淀淀粉的最佳条件， 为科学总结和改进传统的酸浆法工艺，进一步开发酸浆法生产绿豆淀粉提供科学方面的理论依 据。 试验结果表明：酸浆中的一株淀粉凝集菌和工业菌株a s l 9 在养浆的过程中，两者的产酸能 力，沉淀淀粉的能力都相接近，没有显著性差异。推断出：两菌株表面凝集淀粉的物质可能为蛋 白类物质，并且糖基对菌体的凝集能力也有影响，脂肪类物质没有影响。这种淀粉凝集物质在强 酸强碱的条件下，会受到不可逆的破螺，煮沸也会破坏其凝集活性两菌株在沉淀淀粉过程需要 金属离子的参加，钠离子、钾离子都具有促进菌体沉淀淀粉的能力钙离子、镁离子不具有促进 菌体沉淀淀粉的能力。除了金属离子外，添加的菌量、淀粉乳液的p h 值、淀粉乳液的温度、沉 淀的时间对于菌体沉淀淀粉的能力都有影响。两菌沉淀淀粉的优化条件是：菌量为3 0m lf 菌体 终浓度约为1 5 0 x 1 0 sc 鲥m l ) ，钠离子浓度为0 0 3 3 扎，淀粉乳液p h 为6 9 ，沉淀对问4h 关键词： 酸浆，乳酸乳球菌，淀粉，凝集，金属离子 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a e t i nt h i sp a p e r , w ef o u n dt h a tt h es t r a i ni s o l a t e df r o ms o w l i q u i d w h i c hh a ds t a r c ha g g l u t i n a t i n ga b i l i t y , b e l o n gt ol a c t o c o c c u s a c t i ss u b s pl a c t a t e l a c t o c o c c u sl a c t i sa s l 9w a st h eo t h e rs t r a i nm s t u d i e di n t h i sp a p e r i n t e r r e l a t e df a c t o r si ns i m u l a t i o nf l u r r yo ft h et w os t r a i n sw e r ec o m p a r e d , s u c ha s p hv a l u e ， s t a r e l aw e i g h to b t a i n e d , d e l a m i n a t i n gl i m e t h em e c h a n i s mo ft h ea g g l u t i n a t i n ga c t i o no ft w o $ 1 1 a i mi n s t a r c hp r o d u c t i o nw 勰s t u d i e d w ea l s or e s e a r c h e dt h ei n f l u e n c eo fj o r l ，s t r a i nv o l u m e p h , t e m p e r a t u r e , t i m e f a c t o r s d u r i n g a g g l u t i n a t i n g a c t i o n o f t w o s t r a i n s 1 1 l cm a i nr e s u l t sw e r e 笛f o l l o w s ：p hv a l u e ，s t a r c hw e i g h t ，d e l a m i n a t i n gt i m eo fs i m u l a t i o ns l u r r yo f t h et w os t r a i n sw e 犯a l m o s tt i l es a m e t h ee x p e r i m e n ta l s os u g g e s t e dt h a tt h eb a c t e r i a l 目u f a c op r o t e i n w e mr d e v a n ta n de s s e n t i a lf o rs t a r c hp r e c i p i t a t i o na c t i o n t h eb a c t e r i a ls t n l c t u r eo fs t r a i na a n ds t r a i n bi n v o l v e dt ns t a s hp r c e i p i t a t l n ga b i l i t yw a sm o s tl i k e l yo fp r o t e i n t h es u r f a c ee a r b o b y c l r a t co ft w o s t a a i n sw a sa l s ot n v o l v c di n , b u tf a th a dn or c l a t l o u s h i pw i t l ai t ms l r u e t u r i n v o l v e di ns t a l e h p r e c i p i t a t i n ga b i l i t yw e r es e n s i t i v et oh e a t 咖t 埘姆 a c i da n da l k a l i t h ea g g l u t i n a t i n ga c t i o no ft w o s t r a i n si ns t a r c hp r o c l t t e t i o an e e d e di o n 1 q a + , k + i m p r o v e dt h es t a r c ha g g l u t i n a t i n ga b i l i 哆o ft b et w o s t r a i n s b e s i d ei o n s ，t h es t a r c hv o l u m t ：, p hv a l u e ，t e m p e r a t u r e ，t i m ef a c t o r sa l s oa f f e c t e dt h es t a r c h a g g l u t i n a t i n ga b i l i t yo ft h et w os t r a i n s t h eo p t i m a ls t a r c ha g g l u t i n a t i n gc o n d i t i o no la s l 9i s ：s t a r e l a v o l u m e3 0m l _ ( a p p r o x i m a t e l y1 5 0 x l 旷, x l i n a n a + c o n c e n t r a t i o n0 0 3 3m o l l , p h6 9 ，t i m e4l a 1 n b c o p t h n a ls t a r c ha g g l u t i n a t i n gc o n d i t i o no lt h es t r a i ni s o l a t e df r o ms o u rl i q u i di s ：s t a r c hv o l u m e3 0m l ( a p p r o x i m a t e l y1 5 0 x l 矿e f t t m l ) , l k l a + c o n c e n t r a t i o n0 0 3 3m o l l , p h6 9 ，t i m e41 1 k e yw o r d s ；s o u rl i q u i d , _ a c t o c o c c u s a c t 缸jm u n gb e 龃s t a r c h a g g l u t i n a t i n g , i o n 独创i 生声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 对玮时间：矽矿年月垆日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅；学校可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：。坪午 时闻： 砷年月f 垆日 导师魏孢碎 帆矽7 年易川日 中国农业大学硕士学位论文 。 第一章绪论 1 1 绿豆简介 第一章绪论 绿豆( p h a s e o l u sa u r e u s ) ，又名莱豆植豆文豆，是豆科脚i n o s a 曲菜豆族( p l m s e o l e a e ) 虹豆属( 1 4 9 n a ) 植物中的一个栽培品种绿豆在温带亚热带热带地区广泛种植，以亚洲的印 度中国，泰国缅甸印度尼西亚巴基斯坦菲律宾斯里兰卡孟加拉尼泊尔等国栽 培最多我国是原产地，已有2 0 0 0 年以上的栽培史，且资源丰富。主产区集中在黄河、淮河流 域的平原地区，河南、山东，河北、陕西，安徽等省。近年来在美国、巴西澳大利亚及其他一 些非洲，欧洲，美洲等国家，绿豆的种植面积也在不断扩大【”。 1 1 1 绿豆起源 绿豆原产中国在我国已有2 0 0 0 年的栽培历史，早在吕氏春秋 齐民要术 等古农 书上就有关于绿豆栽培技术的记载德国学者布特施耐德( e b r e t s c h n e i d e r , 1 8 9 8 ) 也认为绿豆起源 于广州中国科学院汪发，唐进曾把在云南、广西等地发现的野生绿豆，定名为滇绿豆( p h a s e o l u s y u n n a n e n s i sw a n ge tt a n g ) 。1 9 7 9 年中国农业科学院作物品种资源研究所等单位，在滇西北考察时， 也在丽江，金沙江边及山坡海拔1 3 0 0 - 1 8 0 0 米的热河谷等地发现野生绿豆，并有不同的变异类 型。最近几年，在河南山东湖北辽宁，北京等地也采集到不同类型的野生绿豆标本i 习。 1 1 2 绿豆在我国的种植面积、产量以及品种 绿豆在我国各地都有种植，主要集中在黄淮河流域及华北平原，以河南山东，山西河北 ，安徽四川，陕西，湖北辽宁等省较多。5 0 年代初，我国绿豆栽培面积达到2 5 0 0 万亩，总 产量和出i = 1 量曾居世界首位。5 0 年代末开始减少，以后只有零星种植。1 9 7 9 年以后，种植面积 逐年恢复，据不完全统计，1 9 8 6 年以后绿豆种植面积已经达8 2 0 万亩以上近年来，随着人们饮 食蕊念的改变和耕作制度的发展，绿豆的种植面积和产量不断增加，出口量也越来越多，到1 9 9 2 年，仅日本就从中国进口3 1 4 万吨绿豆，占日本全年总消费量的5 4 6 口1 我国绿豆资源丰富，种类繁多，有不少品种驰名中外，如安徽明光绿豆，河北张家口鹦哥绿 豆以及山东绿豆等目前，世界上绿豆品种资源搜集保存最多的是亚洲蔬菜研究与发展中心 ( a v r d c ) 【 j ，绿豆品种改良工作也主要是在该中心进行近年来，他们在改造绿豆株型，早熟性。 成熟一致、不炸荚、抗倒伏、抗叶斑病和白粉病，提高绿豆产量及品质等方面作了大量工作，现 已见成效。随着国内外市场的需要和科研生产的发展，绿豆的重要性愈来愈被人们所认识，与之 有关的各项工作也逐渐收到各级政府和广大农民的重视和支持。1 9 7 8 年以后，我国绿豆品种资源 研究工作正式列入国家重点研究课题和攻关内容，由中国农科院作物品种资源研究所牵头，组织 2 0 多个省( 市自治区) ，开展绿豆品种资源搜集保存鉴定和利用的研究。据不完全统计， 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 目前全国搜集到4 7 2 8 份绿豆资源，并对其进行了农艺性状综合评价，还完成了部分品种的品质 分析和抗主要病虫害，耐盐碱性鉴定周时筛选出中绿1 号中绿2 号，鄂绿2 号，苏绿1 号等 优良品种在生产上推广应用例。到1 9 8 9 年仅中绿1 号年种植面积就达4 0 0 多万亩，占全国绿豆总 面积的4 5 左右，实现了建国以来第一次全国性绿豆品种的更新换代，并在农业生产中不断发展， 社会经济效益及其显著 1 1 3 绿豆营养和功能 绿豆营养丰富，其籽粒中含有蛋白质2 2 - - 2 6 ，是小麦面粉的2 3 倍，小米的2 7 倍。玉 米面的3 0 倍，大米的3 2 倍，甘薯面的4 6 倍。其中球蛋白5 3 5 ，清蛋白1 5 3 ，谷蛋白1 3 7 ，醇溶蛋白1 0 。在绿豆蛋白中，人体所必需的8 种氨基酸的含量在o 2 49 弛0 之间，是 禾谷类的2 - 5 倍。绿豆籽粒中含淀粉5 0 左右，仅次于禾谷类的，其中直链淀粉2 9 ，支链淀 粉7 1 。绿豆中的纤维素含量较高，一般39 5 4 ，而禾谷类只有1 - - 2 ，水产和畜禽类则不 舍纤维素绿豆中脂肪含量较低。一般在1 以下，主要是软脂酸，亚油酸和亚麻酸。另外绿豆 还含有丰富的维生素，矿物质等营养素，每1 0 0g 绿豆含钙4 9m g 磷2 6 8m g 铁3 3 2i 避、磷 1 6 8m g 以及粗纤维、氨基酸、胡萝h 素、磷脂、硫胺素、核黄素等丰富的微量元素其中维生 素b 1 是鸡肉的1 7 5 倍；维生素b 2 是禾谷类的2 4 倍，而且高于猪肉，牛奶鸡肉，鱼；钙是禾 谷类的4 倍，是鸡肉的7 倍；铁是鸡肉的4 倍【6 l 。其氨基酸组成中赖氨酸含量丰富，而蛋氨酸、 色氨酸和酪氨酸较少。绿豆的脂肪多属不饱和脂肪酸。干绿豆虽然不含维生素c ，但发芽以后则 含有丰富的抗坏血酸。 绿豆用途广泛，既是调节饮食的佳品，又是食品工业的重要原料，也是防病治病的电药自 古以来，人们就有熬绿豆汤防暑降温的习惯，绿豆汤不仅清凉解渴，还有清热解毒的功效。绿豆 不仅可做成粥，饭。还可以制成花色多，风味独特的绿豆糕、绿豆饴、粉丝、粉皮、豆芽菜以及 绿豆淀粉、绿豆沙等制品最近市场上还出现的绿豆酸奶、绿豆芽火棘复合饮料、速溶绿豆粉、 绿豆酸奶粉、速食绿豆、全皮原汁速食绿豆、绿豆s o d 口服液等等，也颇受好评同。绿豆的药用 价值也很高，中医认为绿豆及其花，叶、种皮、豆芽和淀粉均可入药，其味甘性寒，内服有清热 解毒、消肿利尿，明目降压等功效，对治疗动脉粥样硬化，减少血液中的胆固醇及保肝等也有明 显的作甩。外敷可治疗烫伤、创伤等症。中医学认为：绿豆性味甘寒、无毒，有清热解毒、祛署 止渴、利水消肿、明且之功效。可根治很多的常见病症，例如下肢慢性溃疡、湿疹痱子、治皮炎、 治皮肤瘙痒、浓疱疮、治血小板减少、治疮痈疖肿、治急性眼部炎症等。近几十年来，人们用现 代科学技术对绿豆进行了多方面的研究，现从化学成分、现代药理对绿豆的药用研究概述如下： 绿豆具有抗菌抑菌作用、降血脂作用、抗肿瘤作用、解毒作用。另外，高温出汗可使机体因丢失 大量的矿物质和维生紊而导致内环境紊乱，绿豆含有丰富无机盐、维生素在高温环境中以绿豆 汤为饮料，可以及时补充丢失的营养物质，以达到清热解暑的治疗效果阿 1 2 绿豆淀粉生产概述 1 2 1 国内外主要淀粉产量 2 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 2 0 0 3 年，世界淀粉总产量为4 9 0 0 万吨。其中，以粮食为原料生产出的淀粉达到4 3 5 0 万吨 ( 3 9 4 0 万吨来自玉米，4 1 0 万吨来自小麦) ，以木薯为原料生产出的淀粉约为3 0 0 万吨，以土豆为 原料生产出的淀粉为2 6 0 万吨。美国和欧盟垄断着世界淀粉生产业，美国的淀粉产量达到世界生 产总量的5 0 以上2 0 0 3 年，美国的淀粉产量为2 4 9 0 万吨到2 0 0 4 年，全世界每年共生产淀 粉5 5 0 0 - 6 0 0 0 万吨，其中美国占5 0 世界各地的淀粉生产情况差异悬殊，原料供应程度也不 一样，北美洲地区生产淀粉主要以玉米为原料，美国生产的淀粉中有9 0 是玉米淀粉。欧洲主要 以小麦和玉米为原料，亚洲则主要以木薯为原料唧 绿豆淀粉市场占有率与玉米淀粉和马铃薯淀粉相比逐年下降。其主要原因是：绿豆产量相对 较低，绿豆淀粉提取率低，蛋白和纤维素等其他成分得不到充分利用或尚未利用造成资源浪费， 从而导致淀粉成本过高。所以。尽管绿豆淀粉的品质较好，但在国际市场上一直没有较大的竞争 力。 1 2 2 绿豆淀粉生产方法简介 目前，国际上淀粉的生产工艺主要可分为五种，即酸浆分离法、流槽分离法、离心分离法、 离心机旋流器配套分离法和全旋流器分离法。淀粉工业发达的国家，以第三四种方法为主。少 数几个国家已经应用最先进的全旋流器分离法 国内绿豆淀粉生产的方法主要有三种，即酸浆法，机械分离法和土法酸浆法生产绿豆淀 粉是把豆浆放置一些时候，经过自然发酵，逐渐变酸，就成了能沉淀淀粉的酸浆。豆浆中除淀粉 外，还含有蛋白质、细纤维等为了使淀粉与蛋白质、细纤维较快地分开，传统工艺加入酸浆， 酸浆中含有大量乳酸乳球菌，具有凝集淀粉颗粒的能力，这样，淀粉颗粒不仅脱离了渣子中的大 部分蛋白质、细纤维的吸附作用，而且使其沉降速度大大加快。从而淀粉与蛋白质和细纤维分离 开。主要工艺流程如下： 部分二合浆 绿豆- 清理 浸泡+ 捞豆磨浆 搅拌均匀，静置+ 一打入二合浆的大缸+ 筛分。去渣 第一次沉淀。去上清液，加豆浆。搅拌均匀，静置 挖粉，吊包第三次沉淀加水过2 0 0 日筛 去上清液 ， 图! - 1 工厂中馥浆法生产绿豆淀粉工艺流程围 v 醯i - 卫l 口- 咖o f t l k p r o d 删椎蚰o f 哪n g b 啪m r 曲w i t hs o u r h q 岫i d i n i 瓤o i y 注：此工艺来潭于山东诸城好佳宣食品有限责任公司 3 中甲农廿大学硕七学位论文第一章绪论 用机械分离法生产绿豆淀粉的泡豆、磨浆等工艺与酸浆法相同，只是在分离豆浆中淀粉、蛋 白质和纫纤维的时候采用碟片式离心机分离工艺，也可用5 级旋流洗涤工艺，或者二者合用。此 法工艺先进，适合大规模连续化生产，但要求生产设备投入大，而且生产的淀粉制出的粉丝口感、 外观都不甚理想。土法作坊式生产绿豆淀粉，步骤同酸浆法生产绿豆淀粉相差不大，只是在分离 豆浆中的淀粉、蛋白质和细纤维的时候不加酸浆。而是利用淀粉、蛋白质、细纤维的大小和密度 的不周，采用自然沉降法获得淀粉 现在，我国对绿豆淀粉的提取主要停留在传统的加工方法上。即用酸浆法生产绿豆淀粉。因 为对同一品种的绿豆来说，酸浆法提取的淀粉的质量，纯度都高于机械提取的。这主要是因为酸 浆法提取绿豆淀粉时，酸浆水中含有的乳酸乳球菌对淀粉颗粒有很好的凝聚作用，还能将大分子 的蛋白质分解成小分子的多肽，从而使蛋白质和淀粉粒很快分开，加大了淀粉粒和蛋白质分子间 的比重差，淀粉粒便迅速沉淀下来。而蛋白质和多肽等存在于上层浆水中被除去。而利用其他方 法，如机离心法和水洗法制得淀粉的得率，提取率及纯度均低于酸浆法，且其成品中蛋白质灰 分等杂质的含量均高于酸浆法，淀粉的色泽，制出粉丝的性质也远不如酸浆法所以长期以来至 今，在我国绿豆淀粉的生产绝大多数还停留在传统的绿豆淀粉租加工上，加工车间一般也是纯手 工的小作坊或者半手工半机械化生产，很少有大型的机械加工车间 但是传统的酸浆法生产淀粉主要是依靠老师傅的经验，受约束因素太多。例如，车间的温度 空气中苗群种类和菌数，酸浆的p h 值加工用水的硬度和含金属的种类不同工人操作时的 人为误差等等。因此，在加工过程中也就常常出现“倒缸q 现象，整批的绿豆淀粉不能沉淀，生产 不出来，而找不出原因。而且，不同批次的产品的质量也不同。 1 。2 3 绿豆淀粉的应用 绿豆淀粉中含有相当数量的低聚糖( 戊聚糖、半乳聚糖等) 【1 0 j ，这些低聚糖因人体胃肠道没 有相应的水解酶系统而很难被消化吸收，所以绿豆提供的能量值比其他谷物低，对于肥胖者和稽 尿病患者有辅助治疗的作用。而且低聚糖是人体肠道内有益菌双歧杆菌的增殖因子，经常食用 绿豆淀粉可改善肠道菌群，减少有害物质吸收，预防某些癌症绿豆淀粉具有热黏度高，凝胶强 度弱，凝胶透明度大等优良性能。在食品上是制备粉丝粉皮绿豆馅等良好原料用于肉食品 加工时制作小肚火腿肠香肠，粉肠等添加料或主料此外也可以用于雪糕冰点心，冰淇淋 等的生产【1 ”。 1 3 酸浆法生产绿豆淀粉研究现状 1 3 1 绿豆淀粉研究的主要内容 北魏贾思勰所著齐民要术中对淀粉的描述为“圆如钵形，酷似鸭子白，光润者名日粉英”。 这是我国对淀粉颗粒的最早研究了 随着现代科学的发展，人们已经认识到，淀耪及淀粉化学品是可再生资源对淀粉的开发和 利用，已经引起许多国家的重视。由于淀粉是绿色植物光合作用的最终产物，是廉价的有机原料， 4 中用彳 业，：学硕仁学位论文第一章绪论 因此，在国内外，淀粉已经广泛用于很多行业。现代科学对淀粉的研究主要集中在以淀粉为原料 的化学工业方面，尤其是其用在食品、医药、日用化学品、生物降解材料方厦州，以及淀粉化学、 豆类淀粉的理化性质等方面，国内外相关资料很多但是，对于绿豆淀粉的研究的系统资料却很 少。在国外，有关绿豆淀粉生产的报道很少。究其原因，可能一方面是因为饮食习惯和地区差异 的问题，再者，绿豆产量相对较低，绿豆淀粉提取率低，蛋白和纤维素等其他成分得不到充分利 用或尚未利用，造成资源浪费，淀粉成本过高，从而导致绿豆淀粉产量一直很低。而在国内，尽 管绿豆淀粉的生产有很长的历史，但由于研究技术的局限，相关的资料，特别是机理研究方面的 也很少。 1 3 2 国内外对酸浆法沉淀淀粉机理的研究 粉丝是我国的传统食品，其特点是洁白光亮、透明、软硬适口、口感爽滑。目前我国生产粉 丝主要是沿用传统的酸浆法生产制得由于国外没有这种生产方法，所以至今国外关于这方面的 研究报道不多，研究大多集中在淀粉生产出来的粉丝性质方面。1 9 9 4 年，美国的e c e 和a v 丸 研究了加工工艺、淀粉的胶凝特性和湿度对绿豆粉丝物理性质的影响。指出：加工过程湿度不应 超过5 5 ，煮制时间不超过加s ，用5 的预糊化淀粉，冷却温度3 ，冷却时问不超过3 6hi “ c m e s h e s l ”1 描述了米粉和绿豆粉丝的网状结构。最近c a r d a r “】等报道，菲律宾用独特的加工方式 使淀粉完全糊化，制得玉米和绿豆粉丝。我国关于酸浆生产出来的淀粉的性质以及生产机理有过 一些报道。酸浆法获得的淀粉与离心法获得的淀粉相比，淀粉透光率较好，凝沉速度较慢，凝沉 体积小、直链淀粉含量高、淀粉黏度随温度变化大。除此之外，淀粉中脂肪、灰分、蛋白质含量 及色泽、得率等方面与离心法获得的淀粉也存在一定的差异，但两种淀粉在颗粒大小、偏光十字 和x 一衍射实验中没有显著差异【1 2 酸浆法获得的淀粉生产出的粉丝更加透亮、且煮熟后淀粉溶 出较少、韧性好，因此更适合做粉丝。我国关于酸浆法沉淀淀粉机理的研究状况如下：1 9 7 4 年， 北京市粉丝厂和北京大学生物系j 对传统的酸浆法生产绿豆淀粉进行研究，研究发现在整个淀粉沉 淀过程中，起主要作用的是乳酸乳球菌1 1 6 j 。1 9 7 9 年吴衍庸指出，酸浆在发酵过程中，由于乳酸 细菌的活动，使浆汁中所含糖份发酵产生有机酸( 乳酸、醋酸等) ，酸度随时间增长而增加；舍 糖量逐渐减少；乳酸含量增加；乳酸细菌则由增加到减少；氧化还原电位从高电位到低电位。酸 浆所起的分离作用，不仅与p h 值有关，而且与酸浆中微生物酶活性有关f l ”。1 9 8 0 年中科院微生 物所徐浩等进一步进行研究，确认了乳酸乳球菌具有凝集沉淀淀粉的能力，且通过电镜对淀粉切 片观察，发现乳酸乳球菌凝集淀粉的活性物质存在于细胞壁上，并通过蛋白酶处理证明凝集因子 是附在细胞壁上的一种具有辨识和特异结合能力的功能蛋白n q 。1 9 8 0 年北京大学的曹宗巽等提 出，酸浆凝集淀粉粒，不是由于其中的酸度或其它发酵产物，而是由于微生物菌体的作用。其中 起作用的菌经鉴定为乳酸乳球菌的菜一交种，它能使豆耪中原来分散着的淀粉粒形成十几粒乃至 几百粒凝集而成的大小不等的团块并且这种凝集作用只有在p i l s 5 8 5 的范围内才能出现凝集 现象，以p h 6 0 - - 6 2 为最适；凝集的速度也在一定范围内随着温度的升高而增加；对淀粉粒的凝 集起作用的是菌体表面上的某种蛋白质类物质，很可能是某种凝集素，还报道了菌体、淀粉粒和 阳离子三者之问量的正相关关系。表明，在凝集作用中，三者可能是以某种方式结合在一起f ”。 1 9 8 7 年山东省微生物研究所魏凤呜等研究了淀粉生产过程酸浆中乳酸乳球菌的分离和鉴定及淀 5 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 粉的提取与金属阳离子的关系等，指出乳酸乳球菌对淀粉沉淀起重要作用，但条件是存在某些金 属阳离子刚。1 9 8 8 年北京大学生物系的卢光莹等对酸浆中分离出来的淀粉粒凝集菌的生长条件 和营养要求等性质进行了研究，同时指出在凝集淀粉中起主要作用的是乳酸乳球菌( s t f e p t o c o c c u s l a c t i s ) 中的一个菌株，并称之为淀粉粒凝集菌【z 1 j 。张聚茂则指出在菌量足够并固定不变的条件 下，阳离子需要量随沉淀淀粉的数量增加而增加 2 2 1 。这更进一步说明了菌体中的凝集素与淀粉结 合时需要一定量的阳离子参加。1 9 9 6 年刘绍军等人对酸浆法生长甘薯淀粉进行研究，表明乳酸乳 球菌不是沉淀淀粉的唯一因素，并对生长中乳酸乳球菌的来源进行了分析例。1 9 9 7 年秦礼康等 人对酸浆法生产马铃薯淀粉进行研究，发现乳酸乳球菌生产的淀粉具有褐变程度小，并且发现乳 酸乳球菌壁同样具有沉淀淀粉的作用，且生产出来的淀粉褐变程度小阱明。2 0 0 5 年刘杰等人研究 发现，泡豆的程度、泡豆水中微量元素的含量、豆浆的浓度和酸度等都会影响淀粉沉淀。不同的 酸对淀粉沉淀也有影响，乳酸可以使淀粉沉淀，但硫酸就不能使淀粉沉淀。乳酸乳球菌数量在l o s 左右、酸浆p h 在5 5 左右的条件下，可以沉淀较多的淀粉。同时研究发现工业菌株乳酸乳球菌 a s l 9 和酸浆中的菌一样具有凝集淀粉的效果嗍。2 0 0 6 年刘文菊，沈群等研究发现乳酸乳球菌在 凝集淀粉中起到主要作用，p h 起次要作用，酸浆中的酶系起辅助作用同时对酸浆酶系进行了 分析，发现酸浆培养过程中蛋白酶的活性一直在上升，而淀粉酶活性却没有较大的变化，培养1 0 天左右时蛋白酶话性达到最高，之后维持在一个较为稳定的范围1 1 5 】 酸浆是一个很复杂的体系，根据前人的研究成果可以认为：1 乳酸乳球菌在凝集淀粉中起到 主要作用，但不是唯一因素，它受到很多因素的影响。2 乳酸乳球菌沉淀淀粉的物质位于细胞壁 上，可能是一种蛋白类物质，很可能是菌体表面的凝集素但是，目前对于乳酸乳球菌沉淀淀粉 的影响因素的系统研究并没有展开，没有找到可以尽量模拟酸浆，沉淀淀粉的最佳条件。同时对 于乳酸乳球菌能够沉淀淀粉的凝集因子的深入研究也尚缺乏。 1 4 国内外对凝集素的研究 1 4 1 凝集素简介 凝集素l e c i i n 一词，来源于拉丁文t o l e g e r e ，本意为选择，a g g l u t i n i n 是它的同义词凝集素是 一种非免疫来源、对糖以及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子。凝集素广泛分布千植物、动物 和微生物中田j 。1 9 1 9 年s u 删l e r 从豌豆c a n a v a l i a e n s f f o r m 中分离出结晶蛋白，命名为伴刀豆凝集素 ( c o n c a n a v a l i a a ，c o n a ) ，并用此方法第一次获得了纯的凝集素。1 9 3 6 年s u m 埘和h ，w 础道 了c o n a 可以凝集血细胞和酵母细胞，也可以在溶液中沉淀糖原进一步研究显示，c o n a 的凝集 作用可以被蔗糖抑制，第一次揭示了凝集素的糖特异性。s 咖e r 和h e r 大胆推测了c o n a 的 凝集作用是由于植物蛋白与血细胞表面的糖链，发生了一系列反应所引起的。在此之前，s t i b m a r k 已经发现由蓖麻毒素引起的对不同动物的血细胞的凝集作用有选择性。这个发现被k a r l l a n d s t e i n e r 证实，他在1 9 0 0 年发现了人类a 、b 、o 血型近1 睥后l a n d s t e i n e 报道了不同种子提取 物的凝血活性因不同动物血细胞而不同。根据这些特性，l a n d s t e i n e 总结了植物凝集素的作用“本 质是类似抗体的反应”网。到2 0 世纪7 0 年代早期，人们在很多有机体中都发现了凝集素，这些凝 集素主要存在于植物体中，如大豆、绿豆、小麦胚和蘑菇；也有在动物中提取的凝集素：鳗鱼， 6 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 蛇和马蹄蟹1 2 9 1 g o l d s t 咖和a i 驴、 i 发明了用亲和层析的方法分离凝集素。他们最初用固定化葡 聚檄s c p h a d e x ) f r 离纯化7 c o na 。随后分离纯化凝集素的步伐大幅加快，人们获得了大量的凝 集素，到现在大概有5 0 0 多种嘲。 1 4 2 微生物凝集素 关于微生物表面的凝集素研究状况如下：微生物凝集素最先发现时间是1 9 0 8 年，c - u g o t 从 大肠杆菌中找到了能凝集血细胞的凝集素刚。2 0 世纪8 0 年代初，就已发现了1 8 8 种的微生物 凝集素。近十几年来的研究，又进步扩充了其范围，其总数约为2 0 8 种1 3 0 l 。微生物凝集素来源 生物大都是高等生物潜在的致病菌或与哺乳动物相关的种类。来源生物类别按多少顺序为：细菌 真菌 病毒 原生动物，细胞粘霉菌微生物凝集素在微生物体内存在的部位以细胞表面为常见， 如特定的表面细胞器上，包括细菌荫毛或纤毛、病毒的刺突、真菌的子实体、分生孢子、菌丝等。 这些物质有时被称为粘附素，具有凝集能力删对病原菌感染机制研究表明，病原微生物的致病 过程需要首先在致病区域的活细胞上附着，而这一附着过程主要通过其表面的凝集素特异性识别 活细胞上的糖或含糖的蛋白质完成1 3 1 捌凝集素是存在于包括微生物在内的各种生物活细胞表面 的非免疫原性含糖蛋白或糖蛋白，具有凝集活细胞和沉淀糖类及糖结合物特性田l 。凝集素作为识 别分子的理论兴起于2 0 世纪年代刚。几乎所有的生物细胞表面均携有糖，这些单糖或寡糖 以一定的形式结合在细胞膜蛋白或磷脂上，犹如细胞的触角，识别外来的各种信息。蓿在编码生 物信息中具有潜势，凝集素与相关糖之间的关系好比钥匙与锁的关系，两者之间的反应即为识别 作用识别作用具有糖依赖性，微生物所具有的凝集素专一识别宿主细胞膜的糖链，继而感染宿 主州国外关于乳酸菌表面凝集素已经进行了很多的研究，乳酸菌菌体表面凝集素是由一层呈类 似于晶体排列的蛋白质亚单位组成，是很多乳酸杆菌菌体最外层表面的组成成分之一瞬卿删。 它在菌体表面形成一个具有保护作用的外膜1 4 0 , 4 ”。乳酸菌表面的凝集素具有凝血活性。e l i n a 等 人曾经对乳酸乳球菌体进行各种物理、化学，以及酶处理，发现菌体经过一些能够破坏蛋白质的 常见化学试剂，酶试剂，例如：酸碱、氯化锂、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后，苗体的凝血活性丧 失。表明菌体表面的凝集物质是蛋白旧还有研究表明，菌体的凝血活性，会被一些糖专一性抑 制，表明菌体表面的凝集素是和一些糖类专一性结合旧。 1 4 。2 凝集素的性质 凝集素具有和稽结合识别的特性。凝集素与糖的结合是通过其分子肽链中的活性部位，即专 一结合糖的区域实现的【辩】构成凝集素的蛋白质和耱两个部分中，蛋白质占的百分比大，糖的含 量较少。- 殷都是几个单糖构成寡耱链，寡糖链再与蛋白质肤链相连降i 。微生物凝集素对某些糖 具有结合性能，并且是可逆的，且有的结合能力专一性很强，只结合某一种单糖或寡糖经分析 发现，微生物凝集素所结合的糖有6 0 多种，如：d 甘露糖；d 一葡萄糖结合；2 乙酰氨基2 脱氧d 葡萄糖：2 乙酰氨基2 脱氧d 半乳塘；d 乳糖；l 岩藻糖等。以甘露耱最常 见，其次是半乳糖旧不同凝集素专一结合的糖不相同。凝集素的凝集活性对金属离子的依赖性 不同，有的需要金属离子的参加，有的不需要。不同的凝集素，所需的金属离子也不一样。余萍 7 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 等人研究发现，铁线蕨凝集素经过e d t a 处理后失去了凝血活性，而m n 2 + 、c 矿可以激活其凝集 活性，m j 尹不具有激活作用l 舳j 。曹建香等研究发现，虾中的凝集素经过e d t a 盟：理后的凝集素失 去了凝血活性，但m n 2 、q p 、m 矿不具有激活作用m 赵曦发现，野花生豆凝集素在p h 7 0 和 p h 5 o 缓冲体系中，用e d t a - 去除其金属离子，凝血活性下降。c a 、m 矿、m n v , 、z n 2 + 可使去除 金属离子的凝集素活性基本恢复到天然水平，表明这些二价金属离子为凝集素活性所必需1 4 8 】。戴 聪杰发现，锯缘青蟹体内含有不止一种凝集素，因为它们凝集的细胞类型有差异前者能凝集鲫 鱼红细胞，前者凝集活性不依赖于c a v , ，后者依赖于c a 删李多川等人研究发2 0 琨e l r r a 和一些金 属离子不影响串珠镰刀菌孢子表面的一种凝集素的凝集活性i ，哪凝集素的活性还会受到温度、口h 的影响曹剑香发现，虾血清凝集素热稳定性较差，温度高于5 0 c 时，活性呈明显减弱至无活性， 其最适温度为2 5 4 5 ；最适p h 为8 9 ；盐度为2 4 4 8 时，凝集活性最强肛“。 1 5 本课题研究的意义 目前，世界淀粉总产量近5 0 0 0 万吨，其中以上是由玉米加工的，薯类淀粉大约占1 2 以上，绿豆淀粉的生产量只在世界淀粉的总生产量中占有很小的比例口习。我国是生产绿豆淀粉的 大国，而以酸浆法生产得到的绿豆淀粉为原料制取的粉丝具有优异的性质从国际市场来看，龙 口粉丝在国际市场上已享有盛名，供不应求，国内也有很好的市场。所以，研究酸浆法生产淀耪 是非常有意义的以前的研究表明乳酸乳球菌是酸浆中沉淀淀粉的主要因素，但是对于乳酸乳球 菌沉淀淀粉的机理的深入研究却没有。本实验希望通过对乳酸乳球菌的表面凝集因子的深入研 究，确定这种凝集因子的一些理化性质，使得酸浆法沉淀淀粉的机理更加深入。虽然用酸浆法获 得淀粉制造出来的粉丝具有更好的性质，但是以这种方法生产淀粉，1 吨绿豆需要3 0 - 4 0 吨泡豆 水和酸浆，会产生很多的工业废水这些废水中含有淀粉，糖类以及小于o 1 的蛋白质，回收这 些蛋白质，成本很高目前企业大多数将废水存入露天水池中，靠日晒蒸发水分，进行废水处理。 这使得企业周边的空气恶臭难闻，环境受到污染希望通过对乳酸乳球菌以及影响其淀粉沉淀各 因素的研究，找到它们之间的协同关系，确定乳酸乳球菌沉淀淀粉得最佳工艺条件，尽可能得模 拟酸浆，从而接近酸浆沉淀淀粉的效果使得工业上代替酸浆成为可能，减少工业废水污染 所以，本课题主要研究以下四个方面： 1 酸浆中的一株淀粉凝集菌的菌种鉴定，以及该菌和工业菌株乳酸乳球菌乳脂亚种a s l 9 l a c t o c o c c u s l a c t i s s u b s p c r e m o r i s ( o r l a o e n s e n ) s c h l e i f e 娃a 在养浆过程中的性质比较 2 酸浆中盼一株淀粉凝集菌和工业菌株乳酸乳球菌乳脂亚种a s l 9l a c l o c o c c u $ l a c a a s u b 明c r e m o r i s ( o r l a - - # e n s e n ) s c h l e i f ee t a l 沉淀淀粉物质的本性的研究 3 找到酸浆中一株淀粉凝集菌以及工业菌株乳酸乳球菌乳脂亚种a s l 9l a c t o c o c c u sl a c t 矗 s u b s p c r e m o r i s ( o r l a - - - , l e n a e n ) s c h l e i f e e t a l 生产绿豆淀粉的影响园素 4 找到酸浆中一株淀粉凝集菌以及工业菌株乳酸乳球菌乳脂亚种a s l 9 l a c t o c o c c u sl a c t i a s u b s p c r e m o r i s ( o r l a - - - , l e n s e n ) s c h l e i f ee t a l 生产绿豆淀粉的最佳条件。 8 中国农业大学硕士学位论文第二章两株乳酸乳球菌养浆性质的比较 2 1 引言 第二章两株乳酸乳球菌养浆性质的比较 目前，我国传统生产淀粉的方法是酸浆法经过前人的研究发现，酸浆中沉淀淀粉起主要作 用的是乳酸乳球菌，而其它菌和代谢产物，都没有使淀粉凝集成团作用。刘杰等发现工业菌株乳 酸乳球菌乳脂亚种a s l 9 也能起到沉淀淀粉的作用闭。本章的研究内容包括两方面：1 对酸浆中 分离出来的一株具有沉淀淀粉性质的菌株进行菌种鉴定：2 对工业菌株乳酸乳球菌乳腊亚种 a s l 9 和酸浆中分离出来的淀粉凝集菌在养浆过程中的性质进行研究和比较，这两株菌在以下章 节中分别简称a 菌、b 菌。 2 2 材料与方法 2 2 ，实验材料 绿豆：黑龙江绿豆品种，市售，颗粒饱满，无病虫害，无霉烂变质。 乳酸乳球菌乳脂亚种a s l 9 l a c t o c o c c u s l a c 6 ss u b s p c r e m o r l s ( o r l a - - - j e n s e n ) s c h l e i f ee l a l ，购于 中科院微生物研究所。( a 菌) 酸浆：山东桃林食品有限公司提供。 酸浆菌：从新鲜酸浆中分离得到的具有凝集淀粉能力的一株萤菌) 。 m r s 液体培养基：酪蛋白胨1 0 0g ，牛肉提取物1 0 0g ，酵母提取物5 0g ，葡萄糖5 0g ， 乙酸钠5 0g ，柠檬酸二胺2 0g ，t w e e n s 01 0g ，k 2 h p 0 42 0g ，m g s 0 4 * 7 h 2 00 2g ，m n s 0 4 h 2 0 0 0 5 9 ，蒸馏水1 l 调p h6 8 左右，1 2 1 蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 m r s 半固体培养基；原料同加陋液体培养基，调p h6 8 左右，加琼脂7 d g ，煮沸，1 2 1 ( 2 蒸汽灭菌2 0 m i n 。 m r s 固体培养基：原料同m r s 液体培养基。调p h6 8 左右，加琼脂1 5 0g ，煮沸，1 2 1 c 蒸汽灭菌2 0r a i n 。 m r s + c a c 0 3 固体培养基；原科同m r s 固体培养基，加3 c a c 0 3 ，调p h 6 8 左右，煮沸， 1 2 1 蒸汽灭菌2 0r a i n 。 p y 培养基：蛋白胨o 5 9 ，胰酶解酪朊0 5 9 ，酵母提取物1 0 9 ，盐溶液4 o n 】i 一蒸馏水1 0 0 m l 盐溶液成分：无水c a c l 2 0 2 9 ，m g s 0 4 - 7 h 2 0 0 4 8 9 ，k 挪p 0 4 1 0 9 ， 舶1 0 9 ，n a h c 0 3 1 0 0 g ，n a c l 2 0 9 。将c a a 2 和m g s 0 4 7 h 2 0 混合溶解到3 0 0 m l 的蒸馏水中，再加入5 0 0 m l 的蒸馏 水，一边搅拌一边加入其它盐类直到全部溶解，加入2 0 0m l 蒸馏水，混合置于冰箱冷藏。1 2 1 蒸汽灭菌2 0r a i n 。 p y g 培养基：在p y 培养基中加入1 0g 的葡萄塘。 精氨酸实验培养基：蛋白胨5 0 9 ，牛肉提取物5 0g ，葡萄糖0 5g ，吡哆醛5m g ，l - 精氨酸 9 中国农业大学硕士学位论文第二章两株乳酸乳球菌养浆性质的比较 1 0 og ，蒸馏水1 l 1 6g 1 0 0m l 的溴甲酚紫乙醇溶液z 5m l ，p h 为6 0 - 6 5 ，分装3m u 试管， 1 2 1 灭菌1 0 r a i n 。 2 2 2 试剂 酪蛋白胨：北京奥博星生物技术责任有限公司 牛肉膏：北京奥博星生物技术责任有限公司 酵母膏：北京奥博星生物技术责任有限公司 葡萄糖：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 乙酸钠：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 柠檬酸二胺：天津市科密欧化学试剂 t w e e n s 0 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 k 2 h p 0 4 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 k h 2 p 0 4 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 n a h c 0 3 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 n a c i ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 c a c 0 3 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 无水c a c l 2 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 m g s o , 7 h 2 0 ：北京益利精细化学品有限公司，分析纯 m g s o , t h 2 0 ：北京得茂生物化工厂，分析纯 m n