（农产品加工及贮藏工程专业论文）桑黄保健口服液的研制.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位t 毕业) 论文，是在指导教师的指导下，通过 我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和 致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成 果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示 了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：气孝岛众日期：渺占、j 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定， 即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文 的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。日 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 转速 温度 接种量 种子菌龄磕始p h 值，总相关系数为r = o 9 8 8 0 ，调整后的 相关系数r a = o 9 3 8 2 ，其回归方程为： y = _ 4 7 2 8 1 9 + 0 0 2 1 9 5 x + 0 0 0 4 1 3 x 1 2 0 0 1 7 5 2 x s 2 + o 0 0 6 5 6 x 6 2 33 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 以菌丝多糖为指标进行逐步回归分析可知，各因素对菌丝多糖的影响大小顺序为： 起始p h 值= 种子菌龄 转速 装液量 接种量 温度，总相关系数为r = o 9 6 8 4 ，调整后的 相关系数r a = o 8 3 0 2 ，：其回归方程为： y = 8 7 0 1 0 9 5 2 一i 7 1 7 9 5 x 3 - 2 4 3 2 0 4 7 6 x 。+ o 0 0 5 6 8 x 3 2 + 2 0 9 0 0 0 0 x s 。 当菌丝产量最高或菌丝多糖含量展多时，各因素的最优水平可由数据处理软件分 析获得，如表2 5 中的y ，和y z ，但两者的水平并不一致。依据各因素相关系数的大小及 其正负效应，结合实际情况经权衡考虑选取其适宜的因素水平为：接种最为1 5 ( v v ) ， 种子蘑龄为5 d ，摇床转速为1 4 0 r p m ，三角瓶装液量为】6 0 m l 5 0 0 m l ，培养基起始p h 值 为7 ，培养温度为2 8 。 2 3 桑黄液体发酵动力学的研究 本研究是在上述营养因素和发酵参数试验的基础上进行的，选用配方3 为液体发 酵培养基并在优选出的发酵参数条件f 进行试验。在动力学研究过程中，测量总糖 和还原糖含量是用d n s 法，其标准曲线如图3 所示，可得回归方程为：y = o 2 3 3 3 x 一0 0 9 2 7 相关系数r 2 = o 9 9 2 9 。 2 5 2 1 5 l o 5 0 0 f i g 3 51 0 葡萄糖浓度( m g m 1 ) 图3 葡萄糖标准曲线 t h ec r e t e r i o nc u r v eo f g l u c o s e 经隔4 8 h 取出3 个样品进行平行测定，绘制成液体发酵代谢曲线如图4 所示。从 图4 中可以看出，桑黄菌液体发酵的代谢规律与大多数微生物液体发酵的代谢规律相 似，可大致分为三个时期，即发酵前期或延迟期( 培养o - l d ) 、发酵中期或对数期( 培 养卜9 d ) 、发酵后期或衰亡期( 培养9 - 1 3 d ) 。 34 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 1 2 1 0 塞器e 总糖 r ( m g m 1 ) 。 菌丝多糖 ( g 1 0 0 9 ) 4 2 0 0l35791 11 3 培养时间( d ) 45 4 35 3 氨基氮( ) 25 菌丝干重 2 ( g 1 0 0 m ) 1 5 1 0 5 0 丘i 面i 二j 葫磊= = 面i ；j 醺吾i j j 藕i 丽砑 圈4 桑黄菌液体发酵代谢曲线图 f i g 4 t h em e t a b o l i cc u r v eo f p h e l l i n u ai g n i a r i u sl i q u i df e r m e n t a t i o n 2 3 1 基质消耗动力学特征 对于总糖、还原糖和氨基氮等基质的消耗，在发酵前期均变化不大，略有下降，而 p h 值不变，说明培养基质只被少量消耗：在发酵中期，前三者急剧下降，p h 值是先f 降后又慢慢上升，说明基质被大量消耗，用于菌丝生长需要；在发酵培养9 d 以后，总 糖、还原糖和p h 值的曲线变得平缓，说明基质被消耗的速度变慢，菌丝生长缓慢而 氨基氮的曲线反而上升，这是否与菌丝自溶后释放出内容物引起氨基氮含量增加有关， 有待进一步证实。 2 3 2 菌丝生长动力学特征 在液体发酵过程中，醪液性状及菌丝形态和产量均有较大变化( 表2 6 ) 。从表2 6 可以看出，随着培养时间的增加，培养基质由浓厚变稀，颜色由灰黄色变为咖啡色，气 味由豆香味变为特有的药香味，滤过性由难到易又到难；菌丝球则由少变多，由稀少到 浓厚，菌丝分枝也由少变多，由粗壮变为衰老而自溶。在培养前3 天，醪液无法过滤， 未进行测定；从第3 天开始，可见菌丝产量持续增长，这正好与基质的大量消耗相应， 到培养9 天，菌丝产量最高，达4 0 5 3 9 l g l o o m l ，若此时结束发酵，可得到展多的菌丝； 在发酵后期，菌丝产量有所下降，说明其生长变缓而且有部分菌丝开始自溶，这可能是 由于基质中养分太少，或者是其某些代谢产物浓度的增加抑制了菌丝的生长。 35 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 表2 6 发酵过程中醪液特征及菌丝的变化 里尘! ! 堑! 堕堑垫! 鱼婴篓! 塑堕堡垫2 1 1 业塑壁! 型里z ! ! ! ! 竺垫塑婴! ! 塑! ! ! 薯d 罟醪液特征 菌丝形态 黑g 丝l o 干o m 丢l 鼍m 丝g 多g 尹 ( )()() 2 3 3 产物形成动力学特征 菌丝多糖是药食用菌液体发酵最重要的产物之一。由图4 可以看出，随着培养时 间的增加，菌丝多糖从发酵中期开始持续上升，培养7 d 时达9 8 9f n g g 干菌丝，后又 缓慢下降，这与菌丝的产最有一定的相关性，在发酵后期，菌丝开始自溶故菌丝中的 多糖开始下降；若要获得较多的菌丝多糖，则应以培养7 d 时结束发酵为宜。 由此可见，发酵动力学的研究可以明了发酵过程中基质、菌体和产物的变化情况， 从而可以根据需要更好地判断发酵的终点。 2 4菌丝多糖提取工艺研究 在研究菌丝多糖提取工艺时，测量多糖含量是用苯酚硫酸法，其标准曲线如图5 所示，其回归方程为：y = o 0 1 2 9 x 一0 0 2 1 2 ，相关系数r 2 = o 9 9 0 8 。 36 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 葡萄糖( u g m 1 ) 图5 多糖测定标准曲线 f i g ，5 t h ec r e t e r i o nc u r v eo f p o l y s a c c h a r i d e 2 4 1 不同前处理方法对提取菌丝多糖的影响 据资料显示，超声波处理对提取菌丝多糖有较大的影响。本试验采用不同功率超 声波处理2 0 m i n 和相同功率( 1 2 0 w ) 超声波处理不同时间，其结果如图6 。图6 表明， 超声波的功率和时间都具有正向作用。其最佳参数有待于作进步的探讨。 6 0 5 8 銎醵 嫡童5 0 4 8 4 6 8 0 w1 2 0 w1 6 0 w1 0 m i n2 0 m i n3 0 m i n 功率与时间 图6 超声波对提取菌丝多糖的影响 f i g 6 e f f e c t so f u l t r a s o n i cw a v eo ne x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d e 为了解菌丝的不同前处理对多糖提取量的影响，进行了表2 7 的前处理试验，其中 超声波处理是选用1 6 0 w 、2 0 m i n ，结果如表2 7 所示。从表2 7 可知，用未加处理的干 菌丝球提取多糖的效果最差，用超声波处理的效果最好，其它方法处理的效果都比未加 处理有不同程度的提高，这可能与不同的处理方法对菡丝细胞壁所造成的破坏程度不同 37 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5j 桑黄保健口服液的研制 有关，其中超声波的“空化作用”对菌丝多糖的溶出具有很好的效果，值得进一步研究。 表2 7 不同前处理方法对提取菌丝多糖的影响 t a b l e2 7 _ 些c t so f f o r m e rd i s p o s a l so ne x t r a c t i n gm y e e l i u mp o l y s a c e h a r i d e 2 4 2 热水没提参数研究 2 4 2 1 科水比对热水浸提菌丝多糖的影响 以菌丝干粉为试验材料，添加不同量的水进行热浸提试验，其菌丝多糖含量见图7 。 由图7 可以看出，加大料水比有利于菌丝多糖的提取，但在3 0 倍以上时，提取效果趋 缓，从经济角度及后续工序考虑应选3 0 倍为宜。 8 0 7 0 麟 蚺爸3 0 2 0 1 0 0 2 02 53 03 54 0 料水比( 倍) 图7 不同料水比对热水浸提菌丝多糖的影响 f i g 7 e f f e c t so f r a t i oo f m a t e r i a lt ow a t e ro ne x t r a c t i n g m y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d ei nh o tw a t e r 2 4 2 2 提取时间对热水浸提菌丝多糖的影响 以菌丝干粉为试验材料，用3 0 倍热水浸提不同的时间，其多糖浸出量如图8 所示。 由图8 可知，提取1 5 h 能得到最高的产量，随着时间的进一步延长，多糖产量反而降 低，这可能是由于受到长时间较高温度的影响使多糖部分降解。 38 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 一1 5 0 熟1 0 0 、0 0 511 522 5 33 54 提取时间( h ) 图8 提取时间对热水浸提菌丝多糖的影响 f i g ，8 e f f e c t so f t i m eo ne x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d ei nh o tw a t e r 2 4 2 3 提取次数对热水浸提菌丝多糖的影响 以菌丝干粉为试验材料，用热水浸提不同次数，其每次浸出百分率如图9 所示。 由图9 可以看出第1 次就可提出约3 4 的多糖，而第4 次只有2 5 9 的多糖；提取前 两次就有9 3 5 2 的多糖，故从经济角度及简化工序考虑只需提取2 次就够了。 图9 提取次数对热水浸提菌丝多糖的影响 f i g 9 e f f e c t so f e x t r a c t i n gt i m e so i le x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d ei nh o tw a t e r 2 4 2 4浸提温度对菌丝多糖浸提量的影响 据资料显示”，真菌多糖多数是由8 0 c 以上的热水提取而得的。由图1 0 可以看出， 凿丝多糖量随提取温度的升高而增多，并以9 0 。c 以上为好。本研究的其它试验中，多是 在9 5 c 进行浸提试验。 载 一 0 1 0 0 浸提温度( ) 图1 0 浸提温度对菌丝多糖浸提量的影响 f i g 1 0 e f f e c t so f t e m p e r a t u r eo ne x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d ei nh o tw a t e r 39 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 综上所述，在用热水浸提法提取桑黄菌丝多糖时，应先将菌丝球干颗粒粉碎成菌丝 粉，过1 5 0 目筛后按重量加入3 0 倍的蒸馏水，并用超声波在1 6 0 w 功率下处理2 0 r a i n 后，置9 0 以上的水浴中浸提1 5 h ，滤出提取液后，再加入3 0 倍的蒸馏水置水浴中 提取一次合并两次的提取液，可得到较多的菌丝多糖。 2 4 3 酸或碱提取法对菌丝多糖浸提量的影响 以菌丝千粉为试验材料，分别用不同浓度的酸或碱溶液在9 5 c 进行浸提试验，结 果见图l l 所示。由图1 1 可以看出，菌丝多糖产量均随酸或碱浓度的升高而增加；若用 相同的酸、碱浓度浸提菌丝，酸提法的多糖产量普遍要比碱提法的产量高。但据资料报 道”，酸碱溶液对多耱的特性和活性有定的影响，特别是较浓的酸性溶液影响更大， 因而很少人加以应用。 + 碱提法 + 酸提法 0 10 30 50 70 9 浓度( o l l ) 图1 1酸碱溶液对热水浸提菌丝多糖的影响 f i g 1 1 e f f e c t so f a c i do ra l k a l is o l u t i o n o ne x t r a c t i n g m y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d ei nh o tw a t e r 2 4 4酶法提取菌丝多糖工艺研究 药食用菌的组成成分复杂，除了含有我们所需的多糖外，还含有蛋白质、纤维素、 半纤维素和果胶等物质，这些物质和我们所需要的多糖成分纠缠在一起影响多糖的浸 出，因此在菌丝浸提中加入适当的酶制剂能提高多糖的浸出率。 2 4 4 1 单酶酶解对提取菌丝多糖的影响 选用3 种酶处理桑黄菌丝干粉，与未经酶处理的对照相比，其结果如图1 2 所示。 从图1 2 可以看出，多糖提取量以纤维素酶为最高，而蛋白酶和果胶酶均不理想。这可 能与桑黄菌丝细胞壁主要含有大量的纤维素有关，当受到纤维素酶作用时，细胞壁被破 坏，使内部的物质更易溶出。 40 0 0 o 0 0 0 黔 加 坫 加 5 一划粗窘善 蛹如豁嫡 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶对照 图1 2 单酶酶解对提取菌丝多糖的影响 f i g 1 2 e f f e c t so fs i n g l ee n z y m eo ne x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d e 2 4 4 2 不同p h 对纤维素酶酶解菌丝提取多糖的影响 王璋“指出，纤维素酶的最适p h 一般在4 5 - 6 5 范围内，但最适的p h 将随着底 物的改变而变化。本试验研究结果表明，纤维素酶在p h 4 1 0 内均较适合，但以p t l 4 时 效果最好( 图1 3 ) 。 一1 0 0 载 0 4681 0 图1 3 不同p h 对纤维素酶酶解菌丝提取多糖的影响 f i g 1 3 e f f e c t so f p h so ne x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d eb yc e l l u l a s e 2 4 4 3 酶解时间对纤维素酶提取菌丝多糖的影响 以桑黄菌丝干粉为实验材料，用一定最的纤维素酶作用不同的时间，测定最后所得 的多糖含量如图1 4 所示。由图1 4 可知，多糖浸提量随纤维素酶酶解时间的延长而提高， 但在酶作用4 5 m i n 以后，提取效果趋缓，故选4 5 m i n 较节约时间和能量。 一1 0 0 醵 夸2 。0 1 53 04 56 07 59 0 时间( r a i n ) 圈1 4 酶解时间对提取多糖的影响 f i g 1 4 e f f e c t so f t i m eo be x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d eb yc e l l u l a s e 41 o一刈粗巾5 捌如张蚺 螂舡帮掩 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 2 4 4 4 酶解温度对纤维素酶提取菌丝多糖的影响 资料显示“，多数纤维索酶具有很高的热稳定性。本试验研究结果表明酶解温 度在3 0 6 0 0 之间对多糖浸提量均无显著差异( 表2 8 、2 9 ) 。 表2 8 酶解温度对纤维素酶酶解菌丝提取多糖的影响 t a b 1 e 2 8 e f f e c t so f t e m p e r a t u r e o ne x t r a c t i n g m y c e l i u m p o l y s a c c b a r i d e b y c e l l u l a s e 24 09 2 2 8 6 59 0 9 35 09 4 6 9 2 18 8 2 8 9 9 9 1 6 46 08 0 01 0 3 8 1 0 1 49 5 1 2 4 4 5 用酶量对纤维素酶提取菌丝多糖的影响 用酶量对酶解速度和酶解程度有重要影响，酶量太少，底物未能被完全酶解：酶量 较多时，酶解速度较快：酶量过多，叉会提高成本，并增加后处理的难度。本试验研究 结果显示( 图1 5 ) ，用酶越多，提取的多糖也越多，当酶量高于l o o u g 时，菌丝多糖 的增加量趋缓，故试验应以每克底物加入i o o u 酶活单位的纤维素酶为宜。 器器：黧5 鬻毫5 0 占0 1 0 01 5 0 2 0 0 酶活( o g ) 图1 5 用酶量对提取多糖的影响 f i g 1 5 e f f e c t so f c e l l u l a s eq u a n t i t yo ne x t r a c t i n gm y c e l i u mp o l y s a c c h a r i d e 42 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 综上所述，使用纤维素酶来酶解桑黄菌丝效果较好，以每克菌丝干粉加入l o o u 酶 活单位的纤维索酶为宜，按重量的3 0 倍加入蒸馏水，并调节水的p h 到4 先在3 0 6 0 的水中酶解4 5 m i n ，再迅速升温至9 0 灭酶，并在( 9 5 1 ) 水浴中再漫提l h ，可得 较多的菌丝多糖。 2 5桑黄口服液的调制 采用上述研究分析所得的最佳配方，在最适发酵参数条件下进行小批量发酵，并用 热水提取法得到富含多糖的原液。此原液带有特殊的、令人不舒服的气味和口感，为了 进一步改善它的风味，使其滋味更加协调，增加其适口性，将此原液与蛋白糖、磷酸、 乙基麦芽酚进行调配，即选用l g ( 3 ) 正交表安排实验，配制的口服液由1 0 人进行感官 综合评价其结果及方差分析如表3 0 、3 1 所示。 表3 0b ( 3 ) 正交调配试验结果及其分析 t a b l e3 0t h er e s u l t sa n da n a l y s i so fl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a lm i x i n ge x p e r i m e n t 试验号 一 sc俐 鼍嘉瓣产 表3 1桑黄口服液调配试验的方差分析表 t a b l e31 s q u a r ed i f f e r e n c ea n a l y s i so fo r t b o g o n a lm i x i n g ! 苎p 竺塑! 堕堕! 垒! ! 皇翌丝! 星竺! ! 型丝! 型! 1 9 堂皇一 43 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 由极差分析可知，蛋白糖对指标的影响最大，乙基麦芽酚居其次，磷酸的影响最小； 方差分析表明，因素a 、c 对产品口感的影响均达极显著水平而因素b 不显著。从指 标值中，以第8 试验号的水平为最好。此时口服液的p h 值为4 4 0 ，属于酸性食品，用 常压杀菌法即可。 2 6 产品中主要营养成分分析测试 经测定，桑黄口服液中的粗多糖含量较高达7 0 m g m l ，这对于产品的增强免疫 功能具有重要意义。产品中含有丰富的氨基酸，总量达2 8 5 4 2m g l o o m l ( 表3 2 ) ，测 出其种类有1 7 种氨基酸( 色氨酸来测定) 包括人类所要的7 种必需氨基酸( e t = 0 2 6 5 4 ) 和2 种半必需氦基酸，其中赖氨酸、亮氮酸、苏氨酸、缬草氨酸、精氨酸等( 半) 必需 氨基酸较为丰富。这有利于增强机体的免疫功能。 表3 2 桑黄口服液氨基酸分析结果 t a b l e3 2t h er e s u l t so f t h ea m i n oa c i da n a l y s i so f p h e l l i n u si g n i a r i u so r a ll i q u i d 垒垒 宣量! 堡型! ! ! 璺垦!垒垒鱼量! 婴型! ! ! 坚生! a s d3 8 5 4l l e1 0 6 4 t h r1 2 7 0l e u1 4 4 7 s e r1 6 ，2 3t v r7 4 5 g l u7 5 8 5p h e6 7 2 g l y 1 5 3 1 l y s 1 7 5 4 a l a1 6 1 8h i s8 6 4 c y s 5 4 0 a r g 1 6 5 6 v a l1 1 9 5p r o9 2 5 m e t1 7 2 t r y一 总量2 8 5 4 2 3 结论与讨论 3 1 结论 本实验首先探讨了桑黄菌液体发酵培养基中碳氮比对菌丝产量的影响，结果表明， 其适宜的比值约为1 8 2 9 ，而最适c n 比为2 4 ；然后研究了不同的碳氮源对菌丝产量 的影响，从实验结果看，其最适的碳源为黄豆粉和玉米粉，最适的氮源为小麦麸粉，但 从有利于菌丝生长的角度出发，还选了酵母浸出汁作为氮源；同时还筛选出f e s 0 。、 z n s 0 。、k 2 s o 。、c a s o 。、n a z h p o 。、v b 等对菌丝生长发育有显著影响的无机盐和维生素b 。 再用正交设计研究了碳氮源的最佳浓度并优化了发酵配方，得到适合桑黄液体发酵的培 养基配方是( g l ) ：黄豆粉4 0 ，玉米粉3 0 ，小麦麸粉5 酵母浸出汁4 ，c a s o t1 0 ，k z s o 】，n 赴h p m1 ，5 ，z n s o 。7 m o0 1 ，f e s 0 。7 h 2 00 5 ，v bj 0 ，1 。 44 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 本实验还采用均匀设计法对桑黄菌液体发酵所需的6 种环境参数进行了研究得到 其最适发酵参数为：接种量为1 5 种子菌龄为5 d ，摇床转速为1 4 0 r p m ，用5 0 0 m l 三 角瓶的装液量为1 6 0 m 培养基起始p h 值为7 ，培养温度为2 8 c 。液体发酵动力学的 研究表明，在上述条件下发酵7 9 d ，可获得较高的菌丝产量和较多的菌丝多糖分别 可达4 0 5 9 l o o i n l 和9 8 9 m g ( g 干菌丝) ，分别是报道”中产量的2 3 倍和2 6 倍。 从菌丝多糖提取工艺的研究表明，在用热水浸提法提取桑黄菌丝多糖时，应先将菌 丝球干颗粒粉碎成菌丝粉，过1 5 0 目筛后按重量加入3 0 倍的蒸馏水，并用超声波在1 6 0 w 功率下处理2 0 m i n 后，置9 0 以上的水浴中浸提1 5 h 滤出提取液后，再加入3 0 倍的 蒸馏水，置水浴中提取一次，台并两次的提取液可得到较多的菌丝多糖；若用酶解法 提取菌丝多糖时，应使用纤维素酶来酶解，以每克菌丝干粉加入i o o u 酶活单位的纤维 素酶为宜，按重量的3 0 倍加入蒸馏水，井调节水的d h 到4 ，先在3 0 6 0 c 的水中酶解 4 5 m i n ，再迅速升温至9 0 c 灭酶，并在9 5 c 水浴中再浸提l h 可得较多的菌丝多糖。 当然，用酸碱提取法所得的多糖产量是最高的，但可能会对多糖的结构和活性有较大的 影响。 本实验还采用了上述所得的最佳配方，在最适发酵参数条件下进行小批量生产，用 热水提取法得到富含多糖的原液，并用正交设计法以蛋白糖、磷酸和乙基麦芽酚进行口 感的调配试验，制成了适口性较好的口服液。产品中，粗多糖含量高达7 o g l ，氨基 酸总量达2 8 5 4 2 9 l ，富含7 种必需氨基酸和2 种半必需氯基酸，营养上较为丰富，并且 这些物质有利于增强人体的免疫功能。 3 ，2 讨论 桑黄是一种珍稀药用菌，其在固体培养基上生长非常缓慢，研究以液体发酵的方 式快速、大量地获得菌丝体和菌丝多糖具有重要的现实意义，这就要求从液体发酵的多 方面着手，比如最适碳氮比、最适碳氮源、最适无机盐和维生素、最适生长条件等，从 而达到目标。 相比其它已经工业化生产的药食用菌，桑黄的液体发酵速度还是较慢，特别是在 前期研究过程中，其所用的培养基和培养条件都不是最佳的，发酵时间可长达十儿天， 因而极易污染，给试验带来麻烦。笔者经过大量摸索，总结出要严格操作、改善操作环 境和培养用具是十分关键的。此外，采用本试验的二级菌种接种法不仅可以缩短发酵时 间，进一步减少污染机会，而且还能使试验中各处理具有较好的平行性。 本试验在进行碳氮源筛选时，只各选了9 种成分进行试验选出黄豆粉、玉米粉、 小麦麸粉和酵母浸出汁作为碳氮源若扩大筛选范围，增加其它农副产品或工业下脚料 为原料，可能会出现不同的结果，选得更加有效而廉价的原料。 本试验过程中，在碳氮源及无机盐和维生素b 筛选时，是以菌丝产量为指标将 45 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 )桑黄保健口服液的研制 对菌丝生长有显著影响的成分选出来；在碳氮源浓度正交试验和发酵参数试验时，是在 菌丝产量为指标的基础上，再引入菌丝多糖作为指标之一，进行双指标分析筛选。这旨 在所得的配方能在获得较高的菌丝产量基础上还能产生较为丰富的多糖，这对于今后 的产品开发并加以应用具有重要的现实意义。 在药食用菌的液体发酵中，所需无机盐和维生素的量很少，但对菌丝生长具有重 要作用。本试验参考了其它药食用菌的液体发酵配方，选取常用的无机盐和维生素及 其常用量进行试验，以探讨各种无机盐和维生素对菌丝生长的影响程度，至于其量效 关系有待于作进一步研究。 对于菌丝多糖的提取其前处理是很重要的。试验表明，用超声波的处理方法能 得到较好的效果，其最佳参数有待于作进一步研究。 本试验所探讨的酶法提取菌丝多糖丁艺，平u 酸碱法相比，条件温和、对多糖的结 构影响小、浸出液颜色较浅、不需以酸碱中和浸出液、对设备的腐蚀少、对环境的影 响也较小，因此以酶法提高菌丝多糖的浸出率应该是一种非常好的方法，但其是否会 对桑黄多糖的结构特性及其免疫功能产生多大程度的影响需作进一步的研究。 本试验在进行口服液的调制时，只迸行了口味的调整，还可以加入其它具有协同 增强免疫功能的原料，以进一步提高产品的应用效果。 本试验的结果表明，利用液体发酵工程技术生产桑黄菌丝和桑黄多糖，不仅生产 周期短、产量高，而且不受季节等环境限制，能为桑黄的进一步研究开发奠定基础。 46 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 第三章桑黄口服液对小鼠免疫功能的影响 桑黄是目前国际公认的生物治癌领域中有效率排在最前列的药用菌”7 ”1 。现代研究 表明，桑黄除了具有我国传统的治疗淋病、崩漏、带下、排毒、和胃止泻等药用作用外， 还具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、保肝和抗肝硬化、抗脂质过氧化、抗诱变等功能。在 增强免疫功能方面，张万国等”“研究表明，桑黄子实体热水提取物能诱导人外周血单 核细胞产生y 一干扰素( i f n y ) ，这有利于其发挥调节机体免疫力，从而起到抑制肿瘤 细胞增殖的作用。可见桑黄增强免疫功能的重要性。本试验研究了桑黄口服液对小鼠的 免疫器官重量、碳粒廓清率、巨噬细胞吞噬功能等的影响，这些方面目前尚未见到报道。 1 材料与方法 1 1 试剂葡萄糖、氯化钠、枸橼酸、枸橼酸三钠、丙酮、甲醇等均为国产分析纯。 1 2 材料 由桑黄发酵液和菌丝体提取液制成的桑黄保健口服液；虫草菌丝体口服液( 作为阳 性对照) 为厦门金日制药有限公司产品( 批号：0 4 1 卜1 0 - 1 ) ：鸡红细胞，自制。 1 3 实验动物 昆明种小白鼠，雌雄兼用，体重1 9 1 9 ，由福建医科大学动物中心提供，合格证 号：闽实动质准第0 0 2 - - 0 4 号。 1 4 主要仪器 t g 7 2 9 c 型单盘电光分析天平( 上海天平仪器厂) ；l d 4 2 a 离心机( 北京医用离心机 厂) ；u v 一2 5 0 1 p c 分光光度计( 岛津公司) ；b x 5 0 显微镜( o l y m p u s ) 等。 1 5 方法 1 5 1 桑黄口服液对小鼠免疫器官重量的影响“1 小鼠5 0 只，雌雄兼用禁食1 2 h ，不禁水，称重后随机均分成5 组，以桑黄口服 液l o 、2 0 和4 0 m l k g 、虫草菌丝体口服液5 0 m l k g 和生理盐水( n s ) 2 0 m l k g ，每天灌胃 1 次。共2 周，各组动物于末次给药后l h 颈椎脱臼处死，解剖取脾、胸腺，称重。以 动物处死前的体重校正脏器的重量单位为m g l o g 体重。用统计学方法比较各给药组 的脏器重量与生理盐水组的差异。 1 5 2 桑黄口服液对小鼠碳粒廓清率的影响“”3 小鼠5 0 只，雌雄兼用，禁食1 2 h 不禁水称重后随机均分成5 组，以桑黄口服 液1 0 、2 0 和4 0 m l k g 、虫草菌丝体口服液5 0 m l k g 和生理盐水2 0 m l k g ，每天灌胃1 次，共2 周，各组动物于末次给药后1 h ，按0 1 m l l o g 体重尾静脉注射1 ：3 稀释的印 47 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 度墨汁，在注射完后2 、l o m i n 分别从小鼠眼眶取血0 0 2 m l ，加入到盛有2 m l o 1 n a ：c 如 溶液的试管中，混匀后，测定5 7 6 n m 处的光密度值，按公式( 1 ) ( 2 ) 分别计算碳廓清 指数k 值和吞噬指数a 值。以统计学方法比较各给药组的k 值与生理盐水组的差异。 k = ( l o g ( x 2 ) 一l o g ( x - o ) ) ( 1 0 - 2 )( 1 ) 注：k 、x ”为2 、l o m i n 取的血样的光密度值。 a = 刮后体重( 肝重+ 脾重)( 2 ) 1 5 3 桑黄口服液对巨噬细胞吞噬功能的影喃 用半体内法进行小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的实验“”1 。 1 5 3 1 鸡红细胞悬液的制各 于无菌操作下，自鸡翼下静脉采血，置l o o m l 血清瓶中，加入相当于鸡血体积5 倍的a l s e v e r s 溶液( 枸橼酸三钠2 1 z 08 o g 、枸橼酸0 5 9 、无水葡萄糖1 8 7 9 、 氯化钠4 2 9 ，蒸馏水加至1 0 0 0 m l ：过滤，分装，1 0 磅高压2 0 m i n ，4 。c 保存备用) ，混 匀，4 保存备用。临用时，生理盐水洗涤3 次，前两次1 5 0 0 r m p 离心5 m i n ，弃上清液 和界面的白细胞层。最后一次离心3 0 0 0 r m p ，l o m i n 至红细胞压积值恒定。按此值用生 理盐水配成2 ( v v ) 红细胞悬液。 1 5 3 2 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 小鼠5 0 只，雌雄兼用，禁食1 2 h ，不禁水，称重后随机均分成5 组，以桑黄口服 液i 0 、2 0 和4 0 m l k g 、虫草菌丝体口服液5 0 m l k g 和生理盐水2 0 m l k g ，每天灌胃1 次，共2 周，各组动物于末次给药后1 h ，每鼠腹腔注射2 鸡红细胞悬液l m l ，间隔3 0 m i n 之后，颈椎脱臼处死动物，将其仰位| 古】定于鼠板上正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生 理盐水2 m l ，转动鼠板l mj n 。然后吸出腹腔洗液l m l ，平均分滴于2 片载玻片上，放入 垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置3 7 c 孵箱温育3 0 m i n 。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去 未贴片细胞。晾干，以1 ：1 丙酮一甲醇溶液固定，4 ( v v ) g i e m s a 一磷酸缓冲液染色 3 m i n ，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数1 0 0 个，按公式( 3 ) 计算吞噬百分率。 吞噬百分率= ( 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数1 0 0 个巨噬细胞) x1 0 0( 3 ) 在计数时，同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能。 通常分为4 级： i 级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完接，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核心浅紫色。 i r 级：轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩，呈紫蓝色。 i i i 级：重度消化。胞质淡染，胞核淡浅灰黄色。 级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约 可见。 1 6 数据的处理 数据采用均数加减标准差( x s ) ，统计学检验采用t 检验。 48 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 2 结果与分析 2 1 桑黄口服液对小鼠免疫罂官重量的影响 分别以不同剂量的桑黄口服液、虫草菌丝体口服液和生理盐水( n s ) 饲喂小鼠，研究 其对脾脏、胸腺等免疫器官的影响，结果如表3 3 所示。 表3 3 桑黄口服液对小鼠免疫器官重量的影响( m g 1 0 9 体重，n = 1 0 ) t a b l e 3 3e f f e c t so f p h e l l i n u si g n i a r i u so r a ll i q u i do i lt h ew e i 曲to f 翌! ! ! ! ! 竺竺! ! ! 望! 堡竺! ! 堡型! ! g ! ! ! ! 型! 巴堡：! 三! ! ! 组别 剂量( m l k g )脚腺脾脏 十：p o 0 5 ，料：p 0 0 1 ，与生理盐水组比较( 下同) 。 由表3 3 可以看出，桑黄1 2 1 服液对小鼠胸腺器官重量无明显影响：大剂量( 4 0 m l k g ) 桑黄口服液使小鼠脾脏重量显著增加，说明桑黄口服液具有提高网状内皮系统功能的作 用。 2 2 桑黄口服液对小鼠碳粒廓清率的影响 将各实验组动物的血样在5 7 6 n m 处洲得的光密度值，按公式( 1 ) ( 2 ) 分别计算碳 廓清指数k 值和吞噬指数a 值如表3 4 所示。 表3 4 桑黄口服液对小鼠碳粒廓清率的影响( n = l o ) t a b l e3 4e f f e c t so f p h e l l i n u si g n i a r i u so r a ll i q u i do nt h er a t eo f m i c e sc a r b o nc l e a r a n c e 组别剂量( m l k g )廓清指数k吞噬指数a 49 福建农林大学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 从表3 4 中可以看出，以桑黄口服液2 0 m l k g 和4 0 m l k g 小鼠灌胃给药，可显著提 高小鼠碳粒廓清能力，使廓清指数k 和吞噬指数a 明显高于生理盐水组，差异极显著。 雨阳性对照药( c t t ) 只能显著提高吞噬指数a 。 2 3 桑黄口服液对小自鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 经用半体内法研究小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的功能，结果如表3 5 所示。 表3 5 桑黄1 3 服液对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响( n = 6 ) t a b l e3 5 e f f e c t so f p h e l l i n u si g n i a r i u so r a ll i q u i do i lt h ef u n c t i o n ! ! 坐! 塑：! 鳇! ! ! ! ! ! ! ! ! 堡婴塑翌p ! ! 鳇! ! 望! 组别 剂量( m l k g )吞噬百分率( ) 从表3 5 中可以看出，以桑黄口服液2 0 m l k g 和4 0 m l k g 小鼠灌胃给药，能明显提 高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，使巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率由对 照组的1 3 7 分别提高到2 2 2 和3 4 7 ，差异分别达显著和极显著水平，说明桑黄 口服液具有提高巨噬细胞吞噬能力的作用。金日公司生产的虫草菌丝体口服液也达极显 著水平。 3 结论与讨论 3 1 结论 实验表明桑黄口服液大剂量( 4 0 m l k g ) 使小鼠脾脏重量显著增加；桑黄口服液 2 0 m l k g 和4 0 m l k g 剂量组能明显提高碳廓清指数k 和吞噬指数a ，并能明显提高小鼠 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，使巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率由对照组的 1 3 7 分别提高到2 2 2o a d3 4 7 。这些说明桑黄口服液具有提高网状内皮系统功 能的作用，可显著提高小鼠碳粒廓清能力，并具有提高巨噬细胞吞噬能力的作用，即具 有提高小鼠的免疫功能的作用。 3 2 讨论 本试验所用的桑黄口服液是由纯发酵醪经提取制成的保健品，其中有效成分含量较 低，可考虑将它制成浓缩液或提取其中的有效成分进行试验，则可减少剂量提高效果。 本试验仅就桑黄口服液能否提高小鼠的免疫功能作了初步探索，表现出桑黄口服液 具有很好的应用前景；至于其是否具有其它免疫功能以及桑黄口服液中增强免疫功能的 具体因子和机制，均有待于作进一步的研究。 福建农林天学硕士学位论文( 2 0 0 5 ) 桑黄保健口服液的研制 参考文献 1 刘波中国药用真菌 m 3 太原：山西人民出版社，1 9 7 4 7 1 7 3 2 应建浙，卯晓岚，马启明，等中国药用真菌图鉴 m 北京：科学出版社， 1 9 8 7 1 8 1 3 卯晓岚中国大型真菌 m 河南：河南科技出版社，2 0 0 0 4 7 7 4 。 陈艳秋，武红，傅伟杰，等桑黄菌的人工驯化培养试验初报 j 食用菌，1 9 9 7 1 9 ( 1 ) ：1 7 5 林树钱中国药用菌生产与产品开发 m 北京：中国农业出版社， 2 0 0 0 3 5 3 7 ，6 7 7 3 ，1 6 1 6 。 阔磊食物中增强免疫功能有效成分的研究进展 j 食品工业，2 0 0 0 ( 4 ) ，3 8 3 9 7 王玉萍李翔太，王静真菌深层发酵一生物技术为东方食品添异彩 j 菌 物系统，2 0 0 3 2 0 ( 2 ) ，3 9 5 - - 3 9 6 8 李师鹏，安利国真菌多糖免疫活性的研究进展 j 菌物系统，2 0 0 1 2 0 ( 4 ) ， 5 8 1 5 8 7 9 凌关庭保健食品功能评价( 七) j 粮食与油脂2 0 0 1 ( 1 2 ) ，4 5 - - 4 6 1 0 李小定，荣建华，吴谋成真菌多糖生物活性研究进展 j 食用菌学报， 2 0 0 2 9 ( 4 ) ：5 0 一5 8 1 1 郭春沅真菌多糖免疫调节作用 j 中国食用菌，2 0 0 0 1 9 ( 3 ) ：6 7 1 2 s a s a k it ，t a n k a s u k an ，c h i h a r age ta 1 a n t i t u m o ra c t i v i t yo f d e g r a d e d p r o d u c t so f l e n t i n a ni t sc o r r e l a t i o nw i t hm o l e c u l a rw e i g h t j g a n n ，1 9 7 6 6 7 ( 2 ) ：1 9 1 - 1 9 5 1 3 k u r a s h i g es ，a k u z a w ay ，e n d or e f l e c t so f l e m i n u se d o d e s ，g r i f o i a f r o n d o s a a n d p l e u r o t u so s t r e a t u sa d m i n i s t r a t i o no nc a n c e ro u t b r e a ka n da c t i v i t i c so fm a c r o p h a g e s a n dl y m p h o c y t e si nm i c et r e a t e dw i t hac a r c i n o g e n ，n b u t y l n - b u t a n o l n i t r o s o a m i n e j j i m m u n o p h a r m a c o l i m m