（应用化学专业论文）大豆蛋白酶解物制备Maillard反应肉味香精的研究.pdf

北京工商大学硕士学位论文 摘要 水解植物蛋白含有丰富的肽和氨基酸源，作为前体物质通过m a i l l a r d 反应制 备肉味香精已有1 0 0 多年的历史，但酸法生产的水解植物蛋白会产生具有致癌作 用的氯丙醇，对人体健康造成危害，而酶法水解制备h v p 的产物只有短肽和氨 基酸，符合食品卫生的要求。本文对大豆蛋白的酶解、酶解物成分分析以及以大 豆蛋白酶解物为基料，通过m a i l l a r d 反应制备肉味香精都进行了详细的研究。 通过均匀设计和回归分析，确定各种常用蛋白酶对大豆蛋白的最佳酶解条 件，并以水解度为参考标准，选择f l a v o r z y m e 和p r o t a m e x 组合酶对大豆蛋白进 行酶解，其最佳工艺条件为：酶解温度5 1 、p h 值为6 9 ，底物浓度为1 5 ， f ：p = 2 ：1 ，在酶和底物之比为4 ，酶解时间为8 h 的条件下，得到的水解度是 3 0 4 5 。 以凝胶层析法对大豆蛋白酶解液的组分进行分析，将大豆蛋白酶解液大致分 为5 个组分，这5 个组分分别是组分1 ( m r 大于12 2 0 ) ：组分2 ( m r 为7 5 0 12 2 0 ) ； 组分3 ( m r 为4 2 0 7 5 0 ) ；组分4 ( m r 为1 2 0 4 2 0 ) 和组分5 ( m r 为5 0 1 2 0 ) 。 组分4 和组分5 是酶解液的主要成分，包括氨基酸残基在5 个以下的短肽和小肽， 以及一部分的游离氨基酸，通过高效液相色谱进一步分离分析出分子量为4 6 2 0 、 4 1 5 4 、4 1 8 4 、3 9 7 0 和3 】9 4 五种的短肽，这些肽在大豆蛋白酶解液中的相对含 量较高。通过氨基酸自动分析仪分析出1 6 种游离氨基酸，其中亮氨酸含量最高， 为1 8 7 6 、其次为苯丙氨酸1 2 7 8 、精氨酸为1 2 0 8 位居第三。它们和短肽一 起都是m a i l l a r d 反应形成肉香味的重要前体物质。 m a i l l a r d 反应能够产生丰富的香味物质，通过大豆蛋白酶解液与氨基酸和还 原糖的m a i l l a r d 反应制备肉昧香精，以正交设计安排实验，对结果进行方差分析， 得到风味、口感俱佳的肉味香精。其生产工艺为：大豆蛋白酶解液5 0 9 ；葡萄糖： 2 0 9 ；木糖：3 5 9 ；甘氨酸：1 5 9 ；丙氨酸：o 5 9 ：半胱氨酸盐酸盐：3 o g ；精 氨酸：0 8 9 ；丝氨酸：o 5 9 ：v b t ：o 5 9 ：v c ：1 o g ：n a c h1 o g ：温度：1 1 0 。c ； 时间：6 0 r a i n 。 对肉昧香精风味的评价和分析则是本文研究工作的又一个重点。本文在制备 大豆蛋白酶解物制备m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 肉味香精的过程中，建立了有针对性的感官评价体系。该感官评价体系是将总体 的印象评分细分为容易辨别的几个细项，有效地提高了评价的准确性。对肉味香 精风味物质的分析，采用s d e 和s p m e 两种方法对产品风味物质进行分离或萃 取，并与g c m s 联用对风味物质进行定性和定量分析。 关键词：大豆蛋白酶解；酶解物分析；m a i l l a r d 反应；肉昧香精；感 官仪器分析。 北京工商大学硕士学位论文 a b s t r a c t h y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i n ( h v p ) h a sb e e nu s e df o rm o r et h a n10 0y e a r st o i m p a c tm e a t l i k ef l a v o rt op r e p a r e df o o da n dr e p r e s e n t so n eo ft h ee a r l i e s tf o r m so f p r o c e s sf l a v o r i n g s b u th c lh y d r o l y s i sm a yl e a dt ot h ef o r m a t i o no fc a r c i n o g e n i c c o m p o u n d ss u c ha s3 - c h l o r o p a n e 一1 ，2 - d i 0 1 i ti sp o s s i b l et oa v o i dt h ef o r m a t i o no f c a r c i n o g e n si fe n z y m e sa r ee m p l o y e df o rt h eh y d r o l y s i so fs o y b e a np r o t e i nt op r o d u c e e n z y m a t i c a l l yh y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i nf e - h v p ) t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so f s o y b e a np r o t e i nw a sd o n eb yp r o t e a s e s c o m p o n e n t sa n a l y s i so fe h v pa n dt h e p r e p a r a t i o no fm e a t - l i k ef l a v o r sb ym a i l l a r dr e a c t i o nw i t he - h v p , c e r t a i na m i n oa c i d s a n ds u g a r sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r n eu n i f o r md e s i g nw a su s e df o rr e a c t i o np a r a m e t e r ss e l e c t i o nt og e tt h eb e s t e n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o no fd i f f e r e n te n z y m e s r e g a r d i n gh y d r o l y s i sd e g r e e ( d h ) a st h et a r g e t ，t h eb e s te n z y m e s ，t h e i ra d d i t i o na m o u n t sa n dt h eh y d r o l y s i st i m e w e r eg o t t e n t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so ff + pe n z y m e sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w i n g ： e n z y m a t i ch y d r o l y s i st e m p e r a t u r e ：5l ；p h ：6 9 ；t h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ：15 ； f ：p 2 2 ：1 ；a n de n z y m e s u b s t m t e ( e s ) r a t i o ：4 ；e n z y m a t i c h y d r o l y s i st i m e ：s h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h eh y d r o l y s i sd e g r e ew a s3 0 4 5 t h ec o m p o n e n t so fe - h v pf r o ms o y b e a np r o t e i nw e r ea n a l y s e db yg e lf l i t r a t i o n ； h p l ca n da a a i tc a nb ed i v i d e di n t of i v ec o m p o n e n t s 1 ( m r 1 2 2 0 ) ；2 ( m r 7 5 0 一v 1 2 2 0 ) ；3 ( m r7 5 0 - 1 2 2 0 ) ；4 ( m r1 2 0 - - 4 2 0 ) ；5 ( m r5 0 - 1 2 0 ) t h em a i nc o m p o n e n t s o fe - h v pw e r em u l t i p l ep e p t i d e sw i t hl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n df r e ea m i n oa c i d s t h e na n a l y z et h ep e p r i d e sw i t hr p - h p l c t h er e s u l ts h o w e dt h a t5s h o r tp e p t i d sw e r e t h em a i nc o m p o n e n t si ne h v p t h a i rm o l e c u l a rw e i g h tw e r e4 6 2 0 、4 1 5 4 、4 1 8 4 、 3 9 7 0a n d319 ，4 e h v pc o n t a i n e d16k i n d so ff r e ea m i n oa c i d s ，a l lt h e s ec o m p o n e n t s p l a y e dai m p o r t a n tp a r ti nt h ef o r m a t i o no fm e a t l i k ef l a v o ri nm a i l l a r dr e a c t i o n t h em a t e r i a l so fm a i l l a r dr e a c t i o nw e r ee - h v p a m i n oa c i d sa n ds u g a r s o n h o g o n a ld e s i g nw a su s e dt oa r r a n g er e a c t i o n sa n df i n dt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o r t h es y s t e m t h eb e s tc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w i n g ：e h v p ：5 0 9 ；g l u c o s e ： i l i 大豆蛋白酶解物制备m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 2 0 9 ；x y l o s e ：3 5 9 ；g l y c i n e ：1 5 9a l a n i n e ：o 5 9 ；c y s t e i n e ：3 0 9 ；a r g i n i n e ：o 8 9 ； s e r i n e ：0 ，5 9 ；v m ：0 5 9 ；v c ：1 0 9 ；n a c i ：i 0 9 ；t e m p e r a t u r eo fr e a c t i o n ：l l o * c ；r e a c t i o n t i m e ：6 0m i n a n o t h e re m p h a s i si nt h er e s e a r c hi st oe s t a b l i s has y s t e mo nt h em e a t l i k ef l a v o u r e v a l u a t i o n t h ee v a l u a t i o ns y s t e mc o n c e r n st w oa s p e c t ：t h es e n s o r ye v a l u a t i o na n d i n s t r u m e n t a la n a l y s i so fv o l a t i l ef l a v o u r s t h et h e s i se s t a b l i s h e das p e c i a ls e n s o r y e v a l u a t i o nm e t h o do nt h es e n s o r yc h a r a c t e ro ft h em a i l l a r dr e a c t i o np r o d u c t s s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o n - e x t r a c t i o n ( s d e ) a n ds o l i dp h a s em i c r o - e x t r a c t i o n ( s p m e ) w e r eu s e di ns e p a r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o no fv o l a t i l ef l a v o u ra n dc o u p l e dw i t hg a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) i nq u a n t i t a t i v e a n d q u a l i t a t i v e a n a l y s i s k e yw o r d s ：e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fs o y b e a np r o t e i n ；a n a l y s i so f e - h v p ；m a i l l a r dr e a c t i o n ；m e a t - l i k ef l a v o r ；s e n s o r ye v a l u a t i o na n d i n s t r u m e n t a la n a l y s i s 1 v 北京工商大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所 取得的研究成果。除了文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本声明的法律后果完全由本人承担。 学位论文作者签名：查查蜩 日期：口“年6 月，1 日 北京工商大学学位论文授权使用声明 本人完全了解北京工商大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生 在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京工商大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子敝，允许学位论文被查阕瓤借 阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复 制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 学位论文电子版同意提交后，可于团当年口一年r - l _ - 年后在学校图 书馆网站上发布，供校内师生浏览。 学位敝储繇生逼导师槐扭嗍州年川阳 北京工商大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 大豆蛋白和水解植物蛋白( i t v p ) 1 1 1 大豆及大豆蛋白 大豆原产于中国，是世界上产量最大的食用和饲用蛋白资源，据报道 1 9 9 9 2 0 0 0 年度，全世界大豆总产量为1 5 6 7 2 亿吨，其中中国大豆总产量l4 2 9 万吨，排在美国、巴西、阿根廷之后位列世界第四。通常大豆含蛋白质约为4 0 ， 脂肪2 0 ，碳水化合物2 0 ，水分1 0 ，粗纤维5 ，灰分5 。大豆的一个重 要用途就是提取豆油，但过去对榨油后剩下的大量蛋白质却未能充分利用，只是 用作饲料和肥料。随着食品工业的发展，人们采用先进的工艺技术将脱脂豆粕 加工成多种大豆蛋白制品，如浓缩大豆蛋白、分离大豆蛋白、组织化大豆蛋白等， 这些大豆蛋白制品蛋白质普遍含量5 0 以上，其中大豆分离蛋白的的蛋白质含 量更高达9 0 左右，而且具有许多功能特性，如乳化性、持水性、持油性、起泡 性等在肉类制品、饮料、冰淇淋、焙烤食品及各种保健食品中具有广泛的应用， 高品质系列化大豆蛋白产品的工业化大规模生产，极大地拓宽了大豆蛋白的应用 范围【1 】【2 】【3 】。 大豆含有4 0 左右的蛋白质，超过其它任何粮食作物的蛋白质含量。大豆 蛋白是生产大豆多肽的原料，大豆蛋白不仅蛋白含量高，而且质量也好。根据世 界卫生组织( w h o ) 建立的蛋白质推荐摄入量，大豆蛋白含有人体必需的所有 氨基酸，其营养价值与动物蛋白相当，能够很好地满足人类的营养需要【4j 。尽管 和鸡蛋、牛奶相比大豆蛋白所含必需氨基酸的比例稍差，但却是植物蛋白质中营 养价值最高的蛋白质，其所含八种人体必需的氨基酸含量接近或高于联合国粮农 组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 建议的理想构成，见表1 - 1 【5 1 。 表i 一1 一些食品中必须氨基酸的含量( ) 大豆蛋白酶解物制备m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 1 1 2 水解植物蛋白( h v p ) 的生产和应用 水解植物蛋白( h v p ) 是一种在全世界广泛应用的食品风味物质，它是由大豆 粕、面筋、玉米蛋白、花生饼、棉籽饼、蓖麻粕等蛋白质源经水解得到的，传统 的水解方法是用酸水解，先将原料进行酸水解( 一般采用盐酸) ，使氨基酸从蛋 白质分子上游离出来，然后进行过滤、中和，再把不溶物去掉。如需精制，还要 进行真空浓缩并脱臭。必要时，再进行脱色处理，晟后，滤出沉淀、调整成分即 得产品。其工艺流程如下f 6 j ： 原料一酸水解一过滤一浓缩一中和一脱臭一脱色一浓缩一过滤一杀菌一包 装一成品 h v p 由于含有丰富的肽和氨基酸源，除了应用在以上食品中外，特别是在 m a i l l a r d 反应制备肉味香精的研究中，h v p 作为一种前体物质近几年来得到广泛 的应用还广泛用作肉类香精，调味料等食品的风味增强剂。h v p 与多种氨基酸、 还原糖在适宜的温度下发生美拉德反应，可产生众多风味如家禽味、猪肉味、牛 肉味等，这些风味成份在添加其他香料后继续提炼，可得到独具风味的香精。 1 1 3 酸法生产h y p 在食品安全中的隐患 酸法生产的水解植物蛋白由于在浓盐酸存在下加热水解生产的，生产过程 中，原料中的油脂水解成丙三醇，丙三醇又进一步与过量的盐酸反应，生成一系 列氯丙醇的异构体，包括3 一氯一1 ，2 丙二醇( 3 m c p d ) 、2 - 氯一1 ，3 一丙二醇( 2 m c p d ) 、 l ，3 二氯一2 - 丙醇( 1 ，3 - d c p ) 、2 ，3 一二氯一1 丙醇( 2 ，3 d c p ) 。据报道，这些氯丙醇异构 体对肝、肾、神经系统均有损害作用且有致癌性，因此各国纷纷制定氯丙醇的限 量标准，英国要求3 - m c p d 在现有方法不能检测到的程度( 0 0 1 m g k g ) ，表1 2 是各国对氯丙醇的要求： 2 北京工商大学硕士学位论文 1 1 3 1 氯丙醇的组成和毒性 氯丙醇是3 一氯一1 ，2 一丙二醇及其多种衍生物的通称，它们包括8 】： ( 1 ) 甘油一氯醇：由于甘油分子中有三个羟基，当氯原子取代不同位置上 的一个羟基时，可以形成以下三种不同的化台物：l 一氯一2 ，3 丙二醇 1 - m o n c 】c l l o r o - 2 3 - p m l l m e d i o l ( 1 - m c p d ) ；2 - 氯- l ，3 - 丙二醇2 仰0 n 砒l h o _ 1 a 印聊般砌( 2 山； 3 一氯一1 ，3 一丙二醇3 - m o n o c n o m - l , 2 - 俐o l ( 3 - m c p d ) 。 ( 2 ) 甘油二氯醇：当甘油分子中有两个羟基被氯原子取代时，可形成以下 两种化合物：1 ，3 - 二氯- 2 - 丙醇1 ，3 d i c h l o r o 一2 - p r o p a n o l ( 1 ，3 d c p ) ；2 ，3 - 二氯1 一丙醇 2 ，3 - d i c h l o r o - l p r o p a n o l ( 2 ，3 - d c p ) 。 ( 3 ) 甘油三氯醇：当甘油分子中有三个羟基都被氯原子取时，生成的化合 物称为l ，2 , 3 一三氯一丙醇1 ，2 ，3 一t r i c h l o r o - p r o p a n 0 1 ( 4 ) 并非由甘油取代而形成的氯丙醇还有三种同分异构体：l 一氯一2 丙醇 1 - c h l o r o - 2 一p r o p a n o l ；2 一氯一1 一丙醇2 - c h l o r o 一1 一p r o p a n o l ；3 - 氯一1 一丙醇 3 - c h l o m 一1 一p r o p a n o l 。 经过多年的病理和毒理的研究，发现3 一氯一1 ，2 一丙二醇及其多种衍生物对人体 有多种毒害作用。3 氯1 ，2 丙二醇主要是毒害神经系统和血液循环系统，容易使 人得神经病和心脏病，而且3 一氯i ，2 丙二醇还具有致癌作用，可引起各脏器和组 织的癌变，此外，3 - 氯1 ，2 丙二醇还能使精子活力降低，降低生育力f 9 l 。另外1 ，3 二氯2 一丙醇不仅具有致癌作用，还具有遗传毒性，能使细胞发生恶性变异。2 ，3 一 二氯一2 一丙醇对肝、肾等脏器均有毒性，并且也具有一定的致癌作用。由此可见， 氯丙醇对人体健康的威胁很大，必须引起重视。 3 大豆蛋白酶解物制各m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 1 i t 3 2 氯丙醇的生成机理 生产酸水解植物蛋白，般采用豆粕或菜籽粕为原料，豆粕内含粗蛋白质 4 0 5 0 ，粗脂肪0 5 1 5 ；菜籽粕含粗蛋白质3 3 3 7 ；粗脂肪1 o 3 o 。 耦脂肪经酸水解为脂肪酸和甘油。粗脂肪由重要的高级脂肪酸组成：软脂酸、 硬脂酸和油酸的甘油酯。脂肪水解一般在催化剂( 酸、碱、酶) 的作用下进行， 使脂肪被分解为脂肪酸和甘油。甘油分子中的三个羟基决定了甘油的化学性质， 在发生化学反应时，可以生成三种衍生物，而且一元和二元的衍生物存在有多种 结构的异构体，它们都含有一个不对称碳原子，因此，又有旋光异构体存在。例 如：甘油与氯化物生成3 一氯1 ，2 一丙二醇的结构式如下： hhhh h h i ii h c l 1 l1 h 0 c c c 0 1 1 一c i 一c c c 一( i h llll11 h0 hhhn hh 甘油与盐酸反应时按下式进行1 1 0 j ： c 】hs f o h ) j 十h c l l ：c j h 5 o h ) 】c 1 1 十h2 0 上述反应是可逆的，要使反应进行完全，反应生成的水量应尽量少，即尽可 能使用较浓的盐酸或氯化氢气体，并将生成的水加以除去。 目前已经确定脂肪是氯丙醇的主要前体物，由于生产酸水解植物蛋白的所用 的豆粕、豆饼、棉籽饼、花生饼等原料是油脂生产厂的副产品，其中不可避免地 残存油脂，比如冷榨豆饼中粗脂肪含量是6 7 ；热榨豆饼是3 4 5 ：脱脂 大豆、花生粕、菜籽饼分别是o 3 1 o 、6 l o 、1 4 。另外酸水解植物 蛋白生产厂家追求氨基酸的得率，投入过量的盐酸，延长水解时间，结果在产生 甘油和游离脂肪酸的同时，还产生了3 - m c p d 、1 ，3 - d c p 、1 ，2 - d c p i “】。 总之，酸水解植物蛋白在食品安全方面具有许多缺陷，而酸法水解制备h v p 相比较，酶法水解具有条件温和、副反应少、不破坏氨基酸、水解程度容易控制， 特别是在营养成分的保留上，具有不可比拟的优点，同时，酶法水解制备h v p 的产物只有短肽和氨基酸，符合食品卫生的要求。随着酶工业的发展，蛋白酶生 产成本的不断降低和酶应用技术研究的不断深入，酶解方法将替代酸法，成为水 解大豆蛋白最有效的方法之一。 4 北京一 商大学硕士学位论文 1 2 大豆蛋白酶解及其研究现状 仅在生命活动中有着极为重要的意义，而且在粮食、食品科学中也有广泛的应用， 1 2 1 蛋白酶概述 微生物中。蛋白酶能够将蛋白质水解成为际、胨、肽类，最后成为氨基酸。蛋白 x 一叶1 一n 1 一涔h c y 1 1 hr ，h lh 13舶融 j r i 8 ，b h h u 式中x 代表氨基，y 代表羧基，r i 、r 2 分别代表不同的氨基酸残基。在大豆 白酶按水解蛋白质的方式不同可分为以下几种 1 2 】【1 3 】： 子量较小的多肽类。 包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶 等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来 大豆蛋白酶解物制备m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 源蛋白酶，如丹麦n o v o z y m e 公司生产的碱性蛋白酶a l c a l a s e 、复合蛋白酶 p r o t a m e x 、中性蛋白酶n e u t r a s e 以及国产的碱性蛋白酶地衣型芽孢杆菌2 7 0 9 、 中性蛋白酶枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖土曲霉3 9 4 2 、酸性蛋白酶黑曲酶3 3 5 0 等。 ( 2 ) 外切酶，切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨 基酸。其中又把作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。 如丹麦n o v o z y m e 公司生产的f l a v o u r z y m e 酶就含有外切酶。外切酶的一个重 要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。 ( 3 ) 有些蛋白酶还能够水解蛋白质或多肽的酯键和酰胺键。蛋白酶水解蛋 白质时，作用部位因肽键种类而异。如胰蛋白酶的切点是羧基侧为碱性氨基酸( 精 氨酸、赖氨酸) 的肽键；胃蛋白酶要求切点两端有芳香族氨基酸；枯草杆菌碱性 蛋白酶要求切点的羧基侧为疏水性芳香族氨基酸( 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 。 这种蛋白酶对切点的特异性要求叫做蛋白酶的底物专一性。利用蛋白酶的底物专 一性可以定向获得特殊结构的多肽。 各种蛋白酶的主要作用位点都不相同，其中木瓜蛋白酶的主要作用位点是 a r g ，l y s 一，p h e x ：a l c a l a s e 蛋白酶的主要作用位点是a l a - ，l e u ，v a l ，t y r ， p h e ，t r y 一；p r o t a m e x 蛋白酶是一种杆菌蛋白酶复合物，作用位点更加广泛，专 一性不强。木瓜蛋白酶和a l c a l a s e 蛋白酶、p r o t a m e x 蛋白酶分属不同酶类，主 要作用位点差异较大，在用单独内切蛋白酶水解过程中原来隐藏在大豆蛋白分子 内部的疏水性氨基酸残基暴露出来，水解物有较强的苦昧。这是因为大豆蛋白在 未水解前其疏水性基团都包含在分子内部，从而不会呈出苦昧。当大豆蛋白经酶 水解后其疏水性氨基酸残基暴露出来，得到的大豆肽往往带有较明显的苦味，此 类氨基酸残基刺激舌上的苦味受容体( 即味蕾) ，即呈出苦味。通常蛋白质中的 疏水性氨基酸含量越高，水解产生苦肽的可能性就越大，影响了其在食品中的应 用。常用的脱苦方法，如疏水吸附、溶剂抽提、酶聚合等都会造成必须氨基酸大 量损失，由于游离的疏水性氨基酸比处于肽链端基的疏水性氨基酸苦味低，利用 外切酶将位于端基的疏水性氨基酸残基切下，可有效的减少大豆多肽的苦味i l ”。 1 2 2 关于大豆蛋白酶解的研究历史和现状 c a d w a l l a d e r 和b a e k 等人对用f l a v o u r z y m e ( n o v o ) 酶解大豆蛋白制各作了 6 北京t 商人学硕士学位论文 研究，摸索出f l a v o u r z y m e ( n o v o ) 酶解大豆蛋白的最佳条件，在此基础上，添 加核糖、半胱氨酸通过m a i l l a r d 反应制备出牛肉味物质【l5 1 。黄惠华等研究了木瓜 蛋白酶对大豆蛋白的水解作用，并通过电泳实验和氨基酸分析分析了水解前后水 解物组成的变化【l 。j i n y e o l 研究了酸处理、热处理对大豆分离蛋白酶解的影响， 研究了不同预处理方法对水解度、氨基氮、氮溶指数、肽链长度的影响i ”1 。 m a r g i t d a l l a a s l y n g 等人，比较了酸法和酶法两种方法对大豆蛋白的酶解效果， 并通过g c m s 和g c o 分析它们在m a i l l a r d 反应中所产生的不同的风味物质【1 8 】。 崔继科等不仅研究了酸、碱及加热处理对大豆蛋白酶解的影响，还探讨了大豆蛋 白采用木瓜蛋白酶水解后对其溶解性、乳化性、粘度、超泡性的影响，针对大豆 肽的苦味，研究了活性炭吸附、柠檬酸掩盖等方法对大豆肽苦味的影响，分析了 大豆蛋白的酶水解机理【1 9 1 1 2 0 1 。钱方、邓岩等人以及华南理工大学的杨晓泉、陈 中等人对用a l c a l a s e 、中性蛋白酶、胰蛋白酶水解大豆蛋白作了一定探索，并对 大豆蛋白酶解液的苦味成因也作了一定的研究f j 4 】 2 j 】。 吴建平等采用不同的蛋白酶水解大豆蛋白，研究了单一酶水解物和复合酶水 解物对大白鼠血管紧张素( a c e ) 的抑制活性，证实大豆蛋白的酶水解液中含有降 血压功能因子，得出了生产大豆降压肽的最佳条件【2 2 】【23 1 。 c a l d e r o na m 研究了大豆蛋白的水解和再聚合过程，通过在水解液中添加 甲硫氨酸，有效增加了类蛋白中的甲硫氨酸含量，提高了蛋白质的营养价值1 2 4 1 。 1 3m a i l l a r d 反应和肉味香精 1 3 1 肉昧香精及其研究现状 肉是人类饮食的重要组成部分，它是优质蛋白质的来源，并提供一些维生素 核矿物质，近2 0 年来，我国肉类工业发展很快，1 9 9 0 年已跃居世界第一位，据有 关部门统计，我国的肉类加工的产量已超过8 0 0 0 万吨，工业总产值达2 0 0 多亿元 人民币。但与国外发达国家相比，在肉类加工制品技术、产品种类方面存在很大 的差距。如国外肉制品产量占肉类加工产量的3 0 5 0 ，美国甚至高达7 0 ，而 我国的肉制品只占总产量的3 4 1 25 1 。因此，随着我国经济的发展和国民生活 水平的提高，肉制品加工业的发展已成为我国肉类加工工业的重要发展方向。 肉味香精在熟肉制品和罐头食品生产中，起着不可替代的作用。传统的肉类 一1 大豆蛋白酶解物制各m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 香精主要是将各种单体香料辅以其它的配料经调香、拌和而成，但各种熟肉香型 的风味特征十分复杂，利用各种合成的单体香料经过调香生产而成的肉类香精很 难达到与熟肉香味逼真的水平，香味单薄、口感较差，所以对天然热反应香精的 研究与利用引起了人们的高度重视。将两种或两种以上的前体物质在有控制条件 下加热处理而制得得香精被称为“热反应香精”。为了使制得的热反应香精更加 完美，也可以在反应之后添加其他的香料。这种热反应工香精广泛应用于食品工 业约有4 0 年的历史，国际食品香料香精工业组织( i o f i ) 将热反应香精定义为： 通过热食品原料或允许在食品或加工香料中使用的食品组分而制得的具有其风 味特征的产品1 2 6 j 。 但是，对肉类风味的研究一直可以追述到上个世纪中叶，随着各种分析仪器 和分析技术的出现，研究肉品风味的化学成分才成为可能。最初的工作主要致力 于提取和分析不挥性成分1 2 “，1 9 6 4 年，v a nd e no u w e r i a n d 等以牛肉提取物和牛 肉汤料为原料，先去除蛋白质和其它大分子化合物，然后将所得到的浓缩水溶液 用离子交换树脂分离，得到多种组分，其中只有几种组分的口味特征与原浓缩液 几乎相同，但稍微弱一些。对该有机酸组分的分析结果表明，这些有机酸包括 5 - i m p 、乳酸、琥珀酸、吡咯烷酮羧酸、币磷酸等。 从上世纪六卜年代后期开始，人们的注意力转向了肉品中挥发性香气成分的 研究，这是因为在肉品风味中，香气特征要比口味特征更重要。在过去的近三十 年里，肉品中的大量挥发性化合物得到了鉴定，掘报导，现己被鉴定的熟肉中的 挥发性化合物超过1o o o 种，其中可能与肉品风味有关的有4 0 0 多种r 2 7 。这些化合 物大体上可归纳为两大类，一类是烃、醇、醛、酮、酸、酯等简单化合物；另一 类是含氧、硫、氮原子的杂环化合物，如呋喃及其衍生物和噻吩及其衍生物，等 等。其中很多有较高的气味阂值，但对总体的风味几乎没有贡献。其它的化合物 可能含量很低，但对总体风味的影响非常大。近年来，研究集中于鉴定出“气味 赋予化合物( a r o m ai m p a c tc o m p o u n d ) ”，即那些由于其浓度及闽值的结合，对肉 的风味和总体香气起主要作用的化合物。近1 0 年来，分析仪器和分析方法的发展， 使得较低浓度赋予香味的化合物被鉴定出。气味赋予化合物通常是由通过气相色 谱和气味评价结合法对很稀的香气提取物进行分析鉴定出的，那些在极其稀释的 情况下其气味仍能用鼻子嗅出的挥发性化合物，被作为气味的最大贡献者。其它 北京工商大学硕士学位论文 研究鉴定出了肉风味中的许多挥发性化合物，并评价了其气味风味贡献及各个 化合物的阂值。表l 一3 中列出了一些从肉香中分离的重要含硫化合物。 表1 3 从肉香中分离出的含硫化合物及其气味特征f 2 8 】 组分风味描述 3 一巯基一2 丁酮 2 - 巯基3 戊酮 2 一甲基3 巯基呋喃 双( 2 甲基3 一呋喃基) 二硫化物 2 一甲基- 3 甲基二硫代呋喃 2 一( 2 甲基一3 - 呋喃基二硫代) - 3 - 戊酮 双糠基二硫化物 糠基甲基二硫化物 3 糠基二硫代一2 一丁酮 3 糠基二硫代2 戊酮 于洋葱味、硫臭味、煮肉味 肉汤咏，生土豆味 煮肉味、烤肉味 煮肉味 肉味、硫臭味、脂肪味 肉昧 焦昧、坚果味、煮熟蘑菇味 肉汤味、焦味、脂肪味 洋葱味、烧焦木材味 甜味、洋葱味、烤坚果味 生肉的香昧很弱，将其加热便可产生肉的特征香气。其中的风味成分就是由 前体物质经过这些复杂的化学反应过程而产生的。肉中的风味前体物质主要为低 分子的水溶性物质，而且是具有透析性的低分子化合物。例如，还原糖( 如葡萄 糖、果糖、核糖等) 、肽类( 如含硫的多肽、肌肽、磷酸肽、脂肽、核苷肽、谷 甘肽等) 、氨基酸( 尤其含硫氨基酸) 、有机酸、肌酸和肌酸酐。蛋白质的降解对 肉味前体物质的形成是必不可少的，而前体物质之间的相互作用便构成了肉的特 征香气【2 9 】。 热反应中产生肉香味的反应包括氨基酸、肽、糖硫胺素、类脂类物质等香昧 前体物质的热降解$ i l m a i l l a r d 反应两个方面。 1 3 2m a i i l a r d 反应及研究进展 m a i l l a r d 反应是食品中氨基化合物( 氨、氨基酸、肽和蛋白质) 和羰基化合 物( 还原糖类) 在食品加工和储藏过程中在一定温度下发生的反应，它是食品色 泽和香味产生的主要来源之- - 3 0 1 ，m a i l l a r d 反应是由法国生物化学家l o u i s m a i l l a r d ( 1 8 7 8 1 9 3 6 ) 于1 9 1 2 年发现的p ”。在研究蛋白质的生物合成时，m a i l l a r d 进行了一次错误的尝试，将浓缩的葡萄糖溶液与氨基酸反应，他发现反应物的颜 9 大豆蛋白酶解物制各m a i l l a r d 反应肉味香精的研究 色逐渐变黑、起泡，产生烤面包或烤肉或烤坚果的香味。在以后的5 年中他对该 反应进行了深入地研究，m a i l l a r d 反应就是以他的名字命名的。 m a i l l a r d 反应可分为三个阶段。第一阶段：葡基胺的生成随后的重排；第二 阶段：脱氧生成呋喃衍生物，还原酮和其他羰基化合物；第三阶段：从这些呋喃 和羰基中间产物到芳香化合物的转变，常常通过与其他中间产物( 如氨基化合物 或氨基酸降解产物) 发生反应而实现。 影响m a i l l a r d 反应风味物质形成的因素很多，包括温度、反应时间、p h 值、 反应物组成、羟基溶剂、缓冲剂和压力等，这些因素需要在实验中进一步确定。 m a i l l a r d 反应自1 9 1 2 年被法国化学家m a i l l a r d 发现以来，由于其在食品、医药 领域中的重要影响，引起了各国化学家的兴趣。关于m a i l l a r d 反应的机理、控制 方法、对食品营养价值的影响等的文章发表很多，近年来国际上己经多次召开以 m a i l l a r d 反应为专题的研讨会。但由于食品的组份太复杂，要完全搞清楚m a i l l a r d 反应的机理，仍是一件难事。为了研究m a i l l a r d 反应的机理，人们通常用简单的 几个原料，如某种氨基酸和糖类进行模拟反应，再研究反应的产物组成及生成途 径。但至今，人们只是对该反应产生低分子量物质的化学过程比较清楚，而对该 反应产生的高分子聚合物的研究尚属空白。 m a i l l a r d 反应在近几十年来一直是食品化学、食品工艺学、营养学、香料化 学等领域的研究热点。因为m a i l l a r d 反应是加工食品色泽和浓郁芳香的各种风味 的主要来源【3 2 1 【3 3 】，特别是对于一一些传统的加工工艺过程如咖啡、可可豆的焙炒， 饼干、面包的烘烤以及肉类食品的蒸煮。另外，m a i l l a r d 反应对食品的营养价值 也有重要的影响，既可能由于消耗了食品中的营养成分或降低食品的可消化性而 降低食品的营养价值，也可能在加工过程中生成抗氧化物质而增加其营养价值。 对m a i l l a r d 反应的机理进行深入的研究，有利于在食品贮藏与加工的过程中，控 制食品的色泽、香味的变化或使其反应向着有利于色泽、香味生成的方向进行， 减少营养价值的损失，增加有益产物的积累，从而提高食品的品质。 近三十年来，一些微量和超微量分析技术应用于食品化学领域的研究之中， 如气相色谱、高压液相色谱、核磁共振谱、质谱以及气相色谱质谱联用、气相 色谱红外光谱联用等，使m a i l l a r d 反应化学的研究得到了极大发展。 另外，食品化学家近年来将动力学模型引入对m a i l l a r d 反应的研究中。运用 1 0 北京：r 商火学硕十学位论文 这种方法的优点在于不需要考虑m a i l l a r d 反应复杂的反应过程，而只需要研究反 应物、产物的质量平衡以及特征中间体的生成与损失来建立动力学模型，从而预 测反应的速率控制尉3 。 1 4 利用m a i l l a r d 反应制备肉类香料的研究现状 肉味香精生产的主要原理是基于对肉类物质在加热过程中产生风味物质的 反应的模拟。模拟系统与实际产香系统近似程度越高，则反应所产生的肉香味越 逼真 3 5 1 。由于各种肉香组分在构成肉香的特征方面所起的作用是不完全相同的。 在肉味香精的实际生产过程中，没有必要要求模拟系统与实际产香系统完全相 同，而是根据肉香特征组分的形成机理，合理选择方便易得的反应原料，来进行 肉昧香精的商业化生产。利用前体物质制备肉味香精主要是以糖类和含硫氨基酸 如半胱氨酸为基础，通过加热时所发生的反应，主要包括脂肪酸的氧化、分解、 糖和氨基酸的热降解、羰氨反应以及各种生成物的二次或三次反应等口“。它们形 成的肉味香气成分包括了数百种化合物，以这些物质为基础，通过调和可制成具 有各种不同特征的肉味香料。肉味香精的原料大多数来自天然物质，而且其生产 过程如酶解、加热等也近似于天然过程，所以所制得的香精也可视为天然香精。 国外一些研究机构将参加反应的原料、可能发生的反应类型、可能产生的中 间体等条件输入计算机，借助计算机来发现可能生成的各种香味物质。三十多年 来，人们应用上述方法，使食品香味的研究和生产有了快速的发展。目前国外市 场上出售的各类巧克力香精、面包香精、咖啡香精、坚果香精( 如胡桃、杏仁、 榛子等) 及肉类香精都是m a i l l a r d 反应的产物，这类产物有的原料不动地推向市 场，有的经食品调香师调香后使香味变得更令人喜爱才出售( 即添加某些天然的 或合成的香料) 1 3 “。 1 9 9 8 年我国食品工业总产值达蛩j 5 9 0 0 亿元，而调节饮食、改善食品风味的各 种新型风味料己经成为食品工业中新的增长点。究其原因，第一是进入一日三餐 的食品是“九五”，以来点发展的加工食品。主食中如方便面年产1 5 0 万吨左右， 各种速冻食品4 7 0 万吨左右，这些产品均需要风味配料。第二是副食方面，重点 是肉食加工。中国肉食加工风味独特，品种繁多，对风味料的需求相当大。另外， 近几年调味料发展迅速，尤其是各种复合调味料发展很快，可以说是食品工业中 大豆蛋白酶解物制备m a i l l a r d 反应肉昧香精的研究 增长最快的品种。 食品香精多数还是按照天然食品的香气香味特点，通过调香技艺，用香精配 制而成，反应香料为配制食品香精，提供了一条新的途径1 3 9 】1 4 0 】。反应香料在国 际上认为是属于天然香料范畴，它是一种混合物，或是一定的原料，在反应条件 。f 生成的产品，具有某些食品特征香气与香味。目前通过m a i l l a r d 反应，可生成 肉类、家禽类、海鲜类、焦糖等等香气香味。似真度较高，我国现有技术水平， 还难以用现有的香