（应用化学专业论文）高含量大豆皂苷制备和分离工艺研究.pdf

浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 摘要 本文研究了从大豆皂苷粗提液中分离纯化得到高纯度的大豆皂苷的方法与工艺，包 括大豆皂苷粗提液的柱层析分离、结晶法精制两个主要过程。 首先，以柱层析法对大豆皂苷粗提液进行初步分离，利用静态吸附法和动态吸附法 考察了z t c 1 , h p d 1 0 0 ，h p d 3 0 0 ，h p d 6 0 0 ，a b 8 ，1 1 # ，1 2 # ，1 3 # 等树脂对大豆皂苷 提取液分离纯化能力，优选出1 1 # 树脂为层析吸附剂，分别研究了1 1 # 树脂静态、动态吸 附和解吸过程。静态吸附特性考察得出：p h 在中性条件下树脂对大豆皂苷的吸附量最大； 在考察的温度范围( 3 0 v 7 0 ) 内，发现树脂对大豆皂苷的吸附量随温度升高吸附量减小， 3 0 饱和吸附量最大，为3 0 3 5 1m g g 。动态吸附特性的考察发现，柱温对吸附量的影响 趋势与静态吸附时相同；初始上样浓度对动态吸附量影响较小，初始浓度升高，吸附量 略有增大。在规格为m 1 5 3c n l ( d ) x 2 7 2c n l 的层析柱上优化柱层析工艺，得到优化的 工艺条件为原料浓度6m g m l , 上样量1 0m g m l 树脂，上样温度6 0 。c ，原料上样后先用 1 。5b v 去离子水冲洗，再分别用1 5b v2 0 乙醇和2 5b v6 0 乙醇冲洗，收集6 0 醇洗 液蒸干得柱层析产品。在上述条件下可将大豆皂苷的含量从原料中的3 o 提高至4 5 以 上，大豆皂苷收率大于9 0 。考察了含水甲醇、乙醇、异丙酵、丙酮等试剂对柱层析所 得大豆皂苷粗品结晶的影响，得到优化的结晶条件：以4 0 乙醇为溶剂，大豆皂苷初始 浓度1 0 8m g m l ，冷却至2 0 析晶2 4 小时。可得含量大于9 6 o 的大豆皂苷，大豆皂苷 收率大于5 0 。 关键词：大豆皂苷大孔吸附树脂柱层析结晶 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e dt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fs o y a s a p o n i n sf r o mt h ee x t r a c to f s o y b e a n i ti n c l u d e dt w om a i n 眦 o c c s s e s , s e p a r a t i o n o ft h es o y a s a p o n i n s b yc o l u n m c h r o m a t o g r a p h ya sw e l la sc r y s t a l l i z a t i o n f i r s t l y , w es e p a r a t e dt h es o y a s a p o n i n s f r o mt h es o y b c a ne x t r a c tt h r o u g hc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y d i f f e r e n tt y p e so fm a e r o p o r o u sr e s i n sn a m e da sz t c - 1 ，a b 8 ，h p d - 1 0 0 ， h ，d 一3 0 0 ，h p d 6 0 0 ，i i # ，1 2 # a n d1 3 # r e s i n sw e l eu s e dt os e p a r a t es o y a s a p o n i n s t h es o r p t i o n a m o u n t ，r e c o v e r ya n dc o n t e n to f s o y a s a p o n i n sh a db e e ne x a m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t11 # r e s i nw a st h eb e s t t h eo p t i m a lo p e r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h ef e e dc o n c e n t r a t i o n6 m g m l ，a n dt h el o a da m o u n t1 0m ( m lr e s i n ) ，t e m p e r a t u r e6 0 c ，w i t he l u t i o np r o c e d u r e1 5 b vp u r ew a t e r , 1 5b v2 0 e t h a n o l 。2 5b v6 0 e t h a n o l ，r e s p e c t i v e l y t h e6 0 e t h a n o l e l u t i o nf r a c t i o nw a sc o l l e c t e da n de v a p o r a t e dt od r y n e s sa st h ec r u d ep r o d u c t t h e c h a r a c t e r i s t i c so fs t a t i ca n dd y n a m i ca d s o r p t i o na sw e l la sd c s o r p t i o no fs o y a s a p o n i n s0 nii # r e s i nw e r es t u d i e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rs t a t i ca d s o r p t i o nw e r ea sf o l l o w s ：w a t e ra s s o l v e n t , p h7 0a tt h et e m p e r a t u r e3 0 。c ，t h cs a t u r a t e da d s o r p t i o nc a p a c i t yo f s o y a s a p o n i n sw a s 3 0 3 5 1m g 。g - 1 t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h ed y n a m i ca d s o r p t i o nw a st h es a l t l ea so nt h e s t a t i ca d s o r p t i o n t h e n , s o y a s a p o n i n sw e r ef u r t h e rp u r i f i e db yc r y s t a l l i z a t i o ni n d i f f e r e n ts o l u t i o ns u c ha s d i f f e r e n tc o n t e n to fm e t h a n o l ，e t h a n o l ，a c e t o n ea n di s o p r o p a n o li nw a r e l s o l u t i o n t h ep u r i t y a n dr e c o v e r yo fs o y a s a p o n i n sb yc r y s t a l l i z a t i o nw a se x a m i n e d r e s u l t ss h o wt h a ts u i t a b l e c r y s t a l l i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：s o l v e n t4 0 e t h a n o l ，d i s s o l v e da tr e f l u xt e m p e r a t u r e ， i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n1 0 8m e d m l , c o o l e dt o2 0 f o r2 4h i nc o n c l u s i o n , t h ec o n t e n t so ft h es o y a s a p o n i n sc o u l db ei n c r e a s e df r o m3 o t o4 5 b y c o l u n mc h r o m a t o g r a p h y t h er e c o v e r yw a sm o r et h a n9 0 t h ec o n t e n to f s o y a s a p o n i n sc o u l d f u l t h e rb cr a i s e dt om o r et h a n9 6 o b yc r y s t a l l i z a t i o n , w i t har e c o v e r ym o r et h a n5 0 t h e t o t a lr e c o v e r yo f s o y a s a p o r t i n w a sm o r et h a n4 5 k e y w o r d s ：s o y a s a p o n i n s ；m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n s ；c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ； c r y s t a l l i z a t i o n 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 1 j o 刖舌 大豆，俗称黄豆，是豆科植物大豆( g l y c i n em a x ( l m e r i l l ) ) 的成熟种子。不仅富含大 量油脂以及蛋白质，而且还有大量具有生理活性的物质例如，大豆磷脂、大豆低聚糖、 大豆异黄酮、大豆皂苷等。特别地大豆皂苷以及大豆异黄酮是近来的研究重点。现代药 学研究表明，大豆皂苷成分具有增强免疫、降低血脂、抗氧化活性和抗真菌活性的功能， 对于防癌防治心血管疾病、抗病毒等具有广泛的功效。 中国是最早种植和食用大豆的国家之一，每年生产1 5 0 0 万吨以上的大豆，大豆种子 组成主要有子叶( 约占9 0 ) ，豆皮( 约7 5 ) ，以及胚芽( 约2 5 ) 。大豆胚芽仅占大豆总重 量的约2 5 ，其最主要的特征是大豆异黄酮、大豆皂苷的含量极高，是子叶含量的8 1 0 倍。大豆一般只是作为食品或者生产油脂，许多大豆皂苷未加以回收利用，利用廉价的 大豆原料开发高附加值的大豆皂苷，适应保健食品和医药工业的需要，为我国食品添加 剂、医药助剂增加新品种，为大豆的综合利用开辟新的途径，具有很好的经济意义和社 会效益。 目前常用的大豆皂苷提取工艺，一般是将脱脂后的大豆豆粕采用有机溶剂( 甲醇、 乙醇等) 加热回流提取，提取液经减压回收溶剂后得浓缩液。利用大豆皂苷在正丁醇中 的溶解度较大的性质，浓缩液加入一定体积的水溶解，再加入等体积的正丁醇萃取，减 压蒸于回收正丁醇，即得大豆皂苷粗品。这种工艺得到的产品含量不高，只有3 0 左右。 要制备高含量的大豆皂苷，必须进行进一步的纯化。 大豆皂苷提取液中的主要杂质是可溶性糖和大豆异黄酮，可溶性低聚糖占到提取物 干重的6 5 以上，所以除糖是提高大豆皂苷纯度的关键。在大豆皂昔的纯化工艺中，主 要依据各组分的极性及其在不同溶剂中溶解度的差异。大豆低聚糖极性相对较大，较易 溶于水而不易溶于极性较小的醇中；大豆皂苷则不易溶于乙醚、乙酸乙酯、丙酮等非极 性溶剂。大豆异黄酮极性一般略大于大豆皂苷的极性。因此常用以上极性的差异来分离 纯化大豆皂苷。 本文主要侧重于大豆皂苷的分离纯化研究，开发一种适合工业化生产的简单工艺， 生产高含量大豆皂苷( 9 0 ) 。 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 第一章文献综述 大豆是我国传统食品之一，国内外的研究【卜8 1 发现大豆除富含油脂和蛋白等组分，还 含有许多具有生理活性的组分。例如大豆异黄酮、大豆低聚糖和大豆皂苷等。关于这些 活性组分的分离纯化具有重要的意义，本文就其研究现状进行综述。 1 1 大豆异黄酮 大豆异黄酮( s o y b e a nl s o f l a v o n e ) 是一种生物活性物质，属于黄酮类化合物，主要存在于 豆科植物中，我国大豆中异黄酮的含量0 1 2 加4 2 t 2 瑚。大豆异黄酮在人们体内具有微 弱的雌激素活性，合称为异黄酮植物雌激素【2 1 。大豆异黄酮是多酚类混合物，其基本骨 架是3 苯基色原酮，基本可分为四种结构类型，苷元、葡萄糖甙、乙酰化糖甙和丙二酰 糖甙。大豆异黄酮包括三种苷元：染料木素( 金雀异黄素，g e n i s t e i n ) 、大豆苷元( d a i d z e i n ) 和黄豆黄素( g l y c i t e i n ) ，以及它们的葡萄糖苷、乙酰葡萄糖苷和丙二酰葡萄糖苷。天然情 况下它们大多以p 葡萄糖苷形式存在( 主要是乙酰和丙二酰基化) ，只有少数以苷元形式存 在。大豆中约5 0 - - 6 0 的异黄酮为染料木素，约3 0 - 3 5 的异黄酮为大豆苷元，约 5 1 5 的异黄酮为黄豆黄素【3 1 。大豆异黄酮苷的基本结构见图1 1 。其极性一般略大于大 豆皂苷的极性，因此常用此极性的差异来实现二者的分离。 大豆异黄酮有多种生理功能，能够与雌激素受体相结合，对雌激素起到双向调节作 用，防治骨质疏松，防治更年期综合症，安全且无副作用；还具有对人体心血管系统的 保护作用，可降低人体血液中的低密度脂蛋白，消灭人体内自由基延缓机体衰老等，因 此可改善人的体质，提高生活质量。目前自然界中的异黄酮类化合物多集中在豆科蝶状 花亚科的植物中，大豆中不仅异黄酮含量高而且组分多，其中富含生物效价比较高的染 料木苷等n 2 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 大豆异黄酮甙元大豆异黄酮甙 图1 1 大豆异黄酮的基本化学结构式 袭l 1 大豆异黄酮的结构组成与分类 1 2 大豆低聚糖 大豆低聚糖( 8 0 y b e a no l i g o r , c h a t i d c s ) # j - 半乳糖瞢类，主要成分水苏糖( s t a c h y o s c ) 、棉 子糖( r a f m o s e ) 和蔗糖( s u c r o s e ) ，在成熟后的大豆总含量约占1 0 ，比例为4 ：1 ：5 。棉子糖是 由半乳糖v _ a ( 1 ，6 ) 键与蔗糖的葡萄糖基连接，水苏糖是由半乳糖以a o ，6 ) 键与棉子糖的 半乳糖连接，故棉子糖与水苏糖是半乳糖类的低聚糖。它有类似蔗糖的甜味，甜味为蔗 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 糖的7 0 ，其热量是每克8 3 6k j ，仅是蔗糖热能的1 ，2 ，可作为低热能量甜味剂【5 1 。而且 安全无毒，其保健功能主要是通便洁肠，促进肠道内双歧杆菌增殖。因此，低聚糖可治 疗便秘、各种肠道疾病，调解人体肠道微生态平衡。另外，大豆低聚糖还具有降低血清 胆固醇和保护肝脏的作用，综上大豆低聚糖具有低热值、耐酸和耐热等优点，在各种食 品中的应用于极为广泛【6 1 。 1 3 大豆皂苷 大豆皂苷( s o y a s a p o n i n s ) ，又称大豆皂甙，是皂苷类化合物的一种。大豆皂菅是由大豆 及其它豆类种子中提取出来的一类化学物质，含量在0 6 2 - 6 1 6 之间【l l ，其分子是e h 低聚 糖和齐墩果烯三萜缩合形成的一类化合物。大豆皂苷分子是亲水亲油两性分子，因其水 溶液振荡时能产生大量持久的蜂窝状泡沫与肥皂相似而得名。 1 3 1 化学结构与分类 大豆皂苷是一种齐墩果烯三萜与低聚糖的缩合物，依据其皂苷元【列( 见图1 2 ) 的结构可 分为a 类、b 类、e 类、d d m p 类大豆皂苷。因为所有的大豆皂苷水解只生成两种苷元， 即a 类和b 类。因此也有学者将大豆皂昔分为a 、b 两类，认为e 类是b 类的酰氧化形式， 而d d m p 类则是b 类与d d m p 结合的形式。低聚糖链有六种单耱：8 d 葡萄糖醛酸 ( g l c u a ) 、p d 一葡萄糖( e j c ) 、p d - 半乳糖( g a l ) 、1 3 - d - 木糖( x y l ) 、a - l 阿拉伯糖( a r a ) 、a - l 广 鼠李糖( r h a ) 。其糖链部分含量在2 4 0 r - 2 7 之间。 图1 2 大豆皂苷的皂苷元分类 4 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 表1 2 大豆皂苷的皂苷元分类 a 类皂苷是一类二糖链的皂苷，在3 位和2 2 位连接糖链形成糖菅，目前已经分离n 6 种a 类大豆皂苷( a l - a 6 ) 和8 种乙酰化a 类大豆皂苷( a a - a h ) ，见表1 3 和图1 3 。此类皂苷被 认为是造成大豆食品发苦发涩的原因，因为其含有乙酰基所致。天然的a 类大豆皂苷都是 乙酰化形式，通过碱水解处理可以将其转为脱乙酰化或部分脱乙酰形式的皂苷。 表1 3a 类大豆皂苷结构组成 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) b 类和e 类皂苷是单糖链的皂苷，在3 位连接糖链形成糖苷。己分离到的b 类皂苷有两 种命名方法，一种命名为大豆皂苷i ，v t ，另一种命名为大豆皂苷b a b b ，b c , b b ， 6 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) b c 和e 类皂苷有两种大豆皂苷b e 和b d t q ，其对应关系见表1 4 和图1 4 ，大豆中分布最普遍 的是大豆皂苷b b ，e 类皂苷是天然存在最少的皂苷。本文采用o k u b o ( 大久保一良) 的命 名方式。 在非常温和条件下可从大豆中分离到d d h 口皂苷p 。1 4 】，( d d m p ：2 ，3 - - 氢2 ，5 - - - 羟6 甲基4 h - 毗喃4 酮) ，d d m p 类大豆皂苷在固体原料中加热比较稳定，但在水溶液中对热 都不稳定以及f c 3 + 存在的条件下，受热易大部分分解成b 类，少部分分解成e 类皂苷，以 及2 甲基- 3 羟基吖吡喃酮嗍。以p g 为例，在- 2 0 ( 2 下保存1 5 天浓度没有明显变化，在3 0 c 下可保持3 h ，而在6 5 c 下则迅速分解。d d m p 类皂昔被认为是天然存在的真正形式的皂 苷，有报道天然存在的皂苷中d d m p 形式的b 类皂苷占7 5 - - 8 4 。它是以大豆皂苷元b 为配 基，已知的五种d d m p 皂苷按其在h p l c 的流出顺序和c 3 位的糖链不同命名为大豆皂苷 a 舀风，p a 汀g ，社。在乙醇等醇溶剂中，由于皂苷的糖链含有羧基结构，长期保存后会发 生酯化反应，生成相应的酯【9 1 ，因而皂苷的醇提取物不宜在醇中保存过长时间。l h e n g 等【1 4 1 发现d d m p 类皂苷在水溶液状态中，在碱性和酸性下均不稳定，在p h = 7 0 下最稳定， 且3 0 时开始分解，乙醇具有稳定效应，当水溶液中乙醇含量达到3 0 以上，d d m p 在6 5 的分解可以完全停止。研究发现，d d m p 类的皂苷分解反应为一级反应，反应活化能为 4 9k j m o l 。 1 3 2 基本理化性质 大豆皂苷是种白色粉末，呈味性：大豆中的皂苷的昧感从微甘到苦涩，是大豆制 品苦涩味的主要来源之一。皂萤的呈味作用不同且比较复杂，一般用内标法对各皂苷种 类进行呈味性感官分析【6 l 。大豆皂苷中最苦的是乙酰化的a 组皂苷，a 组皂苷脱乙酰后苦 涩味降低，b 组皂苷的苦涩味小于a 组皂苷。分子量在1 0 0 0 左右，化学分子式及分子量【1 0 l 见表1 5 。其分子极性较大，易溶于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇中；难溶于乙醚、 苯，乙酸乙酯等极性较小的有机溶剂中；在含水丁醇和戊醇中溶解度较好，且能与水分 成两相，故可利用此性质从水溶液中用正丁醇或戊醇萃取，借此与极性大的糖、蛋白质 分开。 大豆皂苷显酸性，加入甲酸能改善分离度。大豆皂苷溶液加入硫酸铵、醋酸铅等中性盐 类可产生沉淀。大豆皂苷与苯肼反应生成红棕色沉淀，与五氯化锑反应呈紫蓝色，在冰醋酸 乙酰氯溶液中呈红色，于氯仿硫酸中呈现绿色荧光【4 1 。故可应用这些性质，来检测食物中 7 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 的大豆皂苷的含量。 表1 5 大豆皂苷的分子式及分子量 名称化学结构分子量 a a g l c ( 1 2 培娥l + 2 ) 舀c u a ( 1 3 ) a ( 2 2 一l 3 _ l 漪l ( 2 ，3 ，4 埘- o - a c e t y l ) 1 3 6 5 5 a b g l c ( 1 2 ) g a i ( 1 2 ) g l c u a ( 1 - - , 3 ) a ( 2 2 - 1 ) a r a ( 3 - 1 ) g l c ( 2 346 - t e w a - o - a c e t y l ) 1 4 3 7 5 a c r h a ( 1 - - , 2 ) g a l ( 1 - - * 2 ) g l c u a ( 1 - - , 3 ) a ( 2 2 - 1 ) r e a ( 3 p 1 ) g l c ( 2 ，3 , 4 ，6 - t e t r a - o - a c e t y l ) 1 4 2 1 5 a d 棼1 - - * 2 ) a r a ( 1 - * 2 ) g i c u a ( 1 - - , 3 ) a ( 2 2 * - - 1 ) a r a ( 3 * - 1 ) g l c ( 2 ，3 ，4 , 6 - t e t r a - o - a c e t y l ) 1 3 9 1 5 a e g a l ( 1 - - - 2 ) g l c u a ( i - - , 3 ) a ( 2 2 4 - - i ) a r a ( 3 , - - i ) x y l ( 2 ，3 ，4 仃i - o - a c e t y l ) 1 2 0 3 3 a f g a l ( 1 - + 2 ) g l c u a ( 1 q ) a ( 2 2 p 1 ) a r a ( 3 - 1 砑c ( 2 ，3 ，4 ，6 - t e t r a - o - a c e t y l ) 1 2 7 5 4 a ga r a ( 1 - - , 2 ) g l c u a ( 1 - - - , 3 ) a ( 2 2 * - - - 1 ) a r a ( 3 - - i ) x y l ( 2 ，3 ，4 - i f i - o - a c e t y | ) 1 1 7 3 3 a l l a r a ( 1 - - , 2 ：) g l c u a ( 1 - - , 3 ) a ( 2 2 - - 1 ) a r a ( 3 * - - 1 ) g l c ( 2 346 - t e t r a - o - a c e t y l ) 1 2 4 5 4 b a g l c ( 1 2 ) g a l ( 1 - + 2 ) g i c u a ( 1 _ 3 ) b 9 5 9 1 b b r h a ( 1 - - , 2 ) g a l ( 1 2 ) 9 1 c u a ( 1 3 ) b 9 4 3 1 b c r h a ( 1 2 ) a 嘣1 2 ) g l c u a ( 1 - - + 3 ) b 9 1 3 i b b g a l ( t - - - - 2 ) g l c u a ( 1 - - - , 3 7 9 7 0 b c a r a 0 - - , 2 ) g t c u a ( i - * 3 ) b 7 6 7 0 b d g l “l 一2 ) g a i ( 1 2 ) g l c u a ( 1 3 ) e 9 5 7 i b e r h a ( 1 - - * 2 ) g a l ( 1 - - - , 2 ) g l c u a ( 1 - - - , 3 ) e 9 4 1 1 c t gg i “i - - , 2 ) g a l ( 1 - , 2 ) g l c u a ( 1 - - , 3 ) b ( 2 2 - - 2 _ ) d d m p 1 0 8 5 1 隗 r h a ( 1 - - , 2 ) g a l ( 1 - - * 2 ) g l c u a ( 1 - - ) 3 ) b ( 2 2 - - , 2 _ ) d d m p 1 0 6 9 1 b a r h a ( 1 - - , 2 ) a r a ( 1 - - , 2 ) g l c u a ( i - - - * 3 ) b ( 2 2 - - - , 2 _ ) d d m p 1 0 3 9 1 y g g a l ( 1 吃埘c u a ( i - - - 3 ) b ( 2 2 2 j d d m p 9 2 3 0 y a a r a ( 1 - * 2 ) g l c u a ( 1 - - , 3 ) b ( 2 2 - - , 2 _ ) d d m p 8 9 3 0 1 3 3 含量分布 大豆皂苷主要存在于豆科植物各部分及豆制食品中，其中以果实中含量最高。以b b 的量为基准比较，大豆胚芽中皂苷的含量最高( o 5 - - 1 9 ) ，是子时含量的5 1 6 倍。子叶 中含量仅次于胚芽，在大豆的根部皂苷含量最少。大豆胚芽中a 组皂苷的含量为 8 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 1 2 5 。- - 1 4 6 * * ，b 组皂苷的含量为0 4 2 , - - 0 5 2 ，子叶中b 组皂苷含量为0 1 4 加1 8 t 1 。 s h i r a i w a 等人【i 】分析了多j 盘4 5 7 种大豆胚芽中的皂苷含量，表明胚芽中总皂苷含量为 0 6 2 嗡1 6 ，其中a 组皂苷0 3 6 , - , 3 4 1 ，b 组皂苷0 2 6 屯7 5 ，不同品种大豆的胚芽 中的a 组皂苷组成变化较大，分为7 种类型，9 0 以上的品种以a a 或a b 的一种作为主要组 分。大豆皂苷a a ：a b 约为l ：1 ，b 组皂昔的组成比例稳定，胚中以b a 翮b b 为主，二者的比 例约为1 ：2 。子叶中以b b 和b e 为主，比例约为5 ：2 ，豆皮中几乎不含有皂苷。也有报道 b b 、b c 类皂苷的总量【1 2 】在大豆种子中为2 5 0 - , 5 8 51 t m o i g 。大豆皂苷a 类以a 猁a b 为主， b 类以b 瘌b b 为主，d d m p 类以a g ，1 3 9 为主，e 类含量最少。总的皂苷含量【7 ，9 】为：a 类： 5 6 8 士6 5 b 类( 包含d d m p 类) 4 2 5 4 6 5 e 类0 7 ：t ：o 1 。 1 3 4 生理功能及应用 大豆皂苷是生物活性因子，国内外的研究已经证明，大豆皂苷具有抗脂质氧化、抗 自由基、增强免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多种生理功能。目前已经应用于食品、药品、 化妆品领域。由于它具有多种生理功能，具有较大的潜力和广阔的前景。大豆皂苷在药 理学的效应作用主要表现在以下几个方面：( 1 ) 溶血性f 3 45 】：大豆皂苷在高浓度时能导致 红血球破坏具有溶血作用，是由于皂苷与细胞膜上的胆固醇结合使细胞膜破裂导致的。 ( 2 ) 大豆皂苷可以抑制血清中脂类的氧化【i 删，抑制过氧化脂质的生成，并降低血中固醇 和甘油三醋的含量。日本学者认为大豆皂苷能明显抑制过氧化脂质的生成，同时还具有 降低体内转氨酶含量，抑制不饱和脂肪酸的过氧化，抑制因肾上腺素作用造成的脂类分 解，降低血浆中胆固醇和甘油三脂含量等功能。( 3 ) 抑制血小板凝聚作用【1 9 1 。大豆皂苷在 体内毒素诱发的播散性血管内凝血实验中，可激活纤维系统，增强纤维蛋白原降解产物， 进而强烈地抑制血小板的凝聚，表现出较强的抗凝血作用。( 4 ) 抗癌作用【l ”：大豆皂苷是 人们从食物中摄入的主要皂苷，不被吸收约在消化道中停留2 4h ，它与肠上皮细胞膜作用 引起的生理作用可降低结肠癌的发病率。( 5 ) 钙离子通道阻滞作用【l ”。大豆皂苷具有钙离 子通道阻滞作用，通过向培养的大自鼠乳鼠的心肌细胞的培养基中加入大豆皂苷，发现 大豆皂苷可使心肌细胞群落的自发性搏动呈现具有一定的抑制作用，同时伴有心肌细胞 动作电位的各项参数的减少，如继续用常规培养基洗脱掉大豆皂苷，或使用钙能使肾上 腺素增加细胞外钙的浓度，则可使上述抑制发生逆转，说明大豆皂苷具有钙离子的通道 9 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 阻滞作用；( 6 ) 扩张心、脑血管，改善心肌缺氧功能 1 7 - 19 】。对大豆皂苷的药理研究证实： 大豆皂苷可减少冠状动脉和脑血管阻力，增加冠状动脉和脑的血流量，改善心、脑供血 不足，并可减慢心率，并对缺血性改变有明显的促进作用。( 7 ) 大豆皂苷对中枢心血管系 统的药理作用研究的较多【1 2 l 。目前一致的结论是：大豆皂苷可使血压升高，心率加快， 通过向动物侧脑室注射大豆皂苷，研究者发现，大豆皂苷可加强中枢交感神经活动。使 血管收缩，加快心率和增强心肌的收缩力而引起的血压升高。 大豆皂菅可以用于食品，如作为食品添加剂；应用于食品添加剂：及保健食品大豆皂 营具有发泡性和乳化性，可在食品、药品、化妆品中作添加剂广泛应用。向酒中添加可 增加泡沫的体积，保持泡沫的稳定性，同时有利于改善啤酒的风味。日本的一些学者在 此领域研究较为深入，开发研制了含大豆皂苷的保健食品、减肥食品及皂苷汁、皂苷饮 料等并申请了专利【2 3 1 。大豆皂苷在化妆晶中的应用f 2 1 ，大豆皂苷可阻止由脂质过氧化 引起的皮肤疾患，减少皮肤病的发生，日本学者研究含大豆皂苷的化妆品，并申请了专利， 其实用效果在临床已得到证实。 1 4 大豆皂苷的分离纯化工艺 大豆皂苷的分离纯化有许多方法，传统的皂苷提取方法【2 i 目前有：冷浸法、加热回流 法、索氏抽提法和超声提取法等。先将原料大豆料等用石油醚、乙醚、苯或乙烷等非极 性溶剂进行脱脂，再用先用乙醇或甲醇作为溶剂进行提取，或者先萃取再脱脂。然后浓缩， 再加等量的正丁醇和水充分搅拌，精制后收集正丁醇相，蒸于即得大豆皂苷粗提物，随后根 据需要对其进行分离纯化。可利用皂苷的溶解度用甲醇乙酸乙酯或乙醚等非极性溶剂进 行沉降，也可对大豆皂苷进行沉降，再通过硅胶柱色谱或大孔吸附树脂或分配色谱等纯 化后得高纯度大豆皂苷 2 2 - 2 5 1 。大豆皂苷利用低级醇等进行提取对主要的影响因素有：萃 取时间，萃取次数，温度，p n ，溶剂浓度，料液比等。 1 4 1 溶剂浓度的影响 萃取所采取的溶液可以是低级醇如甲醇和乙醇等，从安全和经济角度采用乙醇。根 据相似相溶的原理，从分子结构上分析，皂苷类物质的极性较大，易溶于含水溶剂中， 而黄酮类物质的溶解度因分子结构的不同而有很大的差异。一般黄酮化合物为平面型分 子，因堆砌紧密，分子间引力较大，故难溶于水，而异黄酮类化合物的b 环受吡喃环羟基 1 0 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 的立体阻碍，故排列不紧密，分子问引力降低有利于水分子的进入，亲水性比平面型分 子增加，因此可以找到一个适宜的溶剂浓度，使皂苷与异黄酮都有较高的提取率【1 8 】。当 乙醇浓度低于6 0 时，蛋白很难以沉淀的形式除去，提取液混浊，不利于后续分离，故 选乙醇浓度在6 0 9 5 之间。李晓霞【1 8 】考察乙醇浓度对大豆异黄酮和皂苷提取效果的影 响，发现乙醇浓度为7 5 时，提取效果最好。黄进【3 】报道皂苷的提取率随乙醇浓度升高而 有所降低，在无水乙醇中提取率显著降低，这可能是因为这些成分在乙醇中的溶解度小。 提出最佳溶剂浓度为5 0 8 0 。许浮萍等【2 2 】采用4 0 0 o - - 8 0 的乙醇进行萃取大豆皂苷。 1 4 2 萃取时间以及次数影响 随时间增加，大豆皂苷萃取率增大，在3 撕h 后基本维持不变，一般的萃取时间4 - 6h 可以满足要求。而萃取2 3 次以后皂苷的总提取率也变化不大，因此可认为萃取3 次就已 完成。 1 4 3 萃取温度和p h 影响 温度对提取的影响不大，但温度太高贝q 会导致d d m p 类皂苷分解和酰化的a 类皂苷 脱酰基，不能得到天然成分的皂苷，温度太低萃取速度过慢。s a t o s h i 等口3 】研究温度一般 控制在在3 0 “5 c 最佳。p h 在5 - 8 之间最利于后续分离纯化，p h 太低则皂苷在溶剂中 会产生沉淀，使收率大大下降，p h 太高则皂苷会产生部分分解。因此必须有适当的p h 值。 1 4 4 萃取液料比的影响 一般地随液料比的增加，提取率会增加，但料液比增大到一定程度则提取率变化不 大，过大的液料比将会造成大量的溶剂消耗，且效果不会增加显著。有地英子 2 4 1 研究表 明料液比在5 1 0 ：l 就可取得满意效果。在进行皂苷萃取过程中，可使用微波或超声波 协助技术【2 卯。其中萃取剂，微波和超声波作用时间、温度等影响较大。微波辅助一般可 以降低溶剂用量，选择性好，且可避免温度过高导致不稳定物质分解，且已经有应用实 例。贾建波等【2 6 】探讨了以水为介质，对大豆胚芽中的皂苷和异黄酮进行微波和超声波前处 理，提取效果和纯溶剂萃取法相比，经4 5 0w 功率微波处理3 0r a i n ，4 0 0w 功率超声波在 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 4 0 处理4 5r a i n ，固液比为i ：2 0 ，温度为6 0 c ，时问为1h ，再经4 0 的乙醇，浸提2 次。 皂苷从4 4 提高到5 8 ，比溶剂法的提取率分别提高了3 2 。 综上所述，萃取的溶剂浓度和料液比是最为重要的两个因素口1 ，最佳的提取条件为： 乙醇浓度为6 0 8 0 之间，p h 在7 左右，即不用调节溶液的p h 。提取温度在3 5 6 5 左右，最佳的液料比为扣1 0 ：i 每次萃取5l l ，共3 次，可保证提取率在9 0 以上。 1 5 大豆皂苷原料液的预处理 由于大豆的组分复杂，而其中大豆皂苷的含量较低，乙醇提取液中存在大量的蛋白 质、可溶性碳水化合物及大豆异黄酮等，即使采用脱脂大豆粕作为原料，仍含有一定的 油脂。为了获得大豆皂苷含量较高的大豆提取物，研究合适的分离精制工艺，分离去除 杂质( 包括脂肪、蛋白、糖、盐等) 是非常必要的。原料液的预处理主要是对乙醇提取液进 行脱脂和脱蛋白处理。大豆中蛋白质含量较高，在以7 0 乙醇作为提取剂时，虽然部分 蛋白质发生变性引起其溶解度显著降低，但在提取液中仍存在一定量的蛋白质。提取液 中存在的蛋白质对浓缩、分离操作影响较大，浓缩时大量的蛋白质易起泡溢出。用大孔 吸附树脂柱层析精制皂苷时，蛋白质的絮凝导致上柱速度变慢，树脂吸附性能降低和床 层阻塞现象等 3 , 1 s i 。因此必须对提取液进行脱蛋白处理。目前脱蛋白的方法主要有：盐析 沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点法、重金属沉淀法、超滤法等。 ( i ) 等电点法【3 】：脱蛋白的方法是将澄清的热滤液调p h 值于4 5 5 0 ，放置1 2 小时进行 二次过滤或离心分离。经检测和观察后续步骤的萃取液表明这种处理可以将游离蛋白基 本除尽；( 2 ) 乙醇沉淀法和等电点法相结合【1 8 】：乙醇提取液冷冻后使一部分蛋白变性而沉 淀，离心后的上清液经浓缩后首先进行脱脂处理。然后将处理液用等电点法进一步去除 溶液中的蛋白质：( 3 ) 超滤法：许浮萍等【2 2 】报道萃取液用美国p a n 公司生产的小型超滤 装置，氧化锆无机膜元件，孔径为2 0n l n ，膜压力设定为2 0p s i ( 0 1 4 m p a ) ，流速设 定为7 7 5m 1 m i n ，得到截留液和透过液。可有效分离大豆蛋白。( 4 ) 加热变性法【2 7 ，2 8 】： 将上述调稀的料液用高温闪蒸装置高温处理( 1 0 0 - 1 4 0 c ) ，使料液中的蛋白质再次变性 析出；将料液经过冷却器冷却；过滤机( 过滤前添加适当的絮凝剂) ，过滤出料液中的 变性蛋白质，收取滤液。 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 1 6 大豆皂苷的分离纯化方法 1 6 1 正丁醇萃取法 利用大豆皂苷在正丁醇中的溶解度较大的性质，浓缩液加入一定体积的水溶解，再加 入等体积的正丁醇萃取，减压蒸干回收正丁醇，即得大豆皂苷粗品。这种工艺得到的产 品含量不高，只有3 0 左右【3 - 7 1 。要制备高含量的大豆皂苷，必须进行进一步的纯化。 1 6 2 有机溶剂沉淀法 大豆皂苷浓缩液经正丁醇萃取，减压蒸馏回收正丁醇后得大豆皂苷稠膏，先加入甲 醇或乙醇溶解，再加入乙酸乙酯、丙酮或乙醚等溶剂迸行沉淀，通过离心分离得大豆皂 苷。缺点是沉淀中形成的大豆皂苷颗粒非常细小，离心后上清液并不澄清，有相当部分 的大豆皂苷颗粒并未能从上清液中分离出来，大豆皂苷回收率低，有机溶剂的用量较多。 黄进【3 j 研究了甲醇和乙酸乙酯作为沉淀溶剂纯化大豆皂苷。大豆皂苷在乙酸乙酯中 溶解度低，大豆异黄酮在其中的溶解度高。而在甲醇和乙酸乙酯混合溶剂中大豆皂苷的 溶解度进一步降低。田晶等【1 5 】将大豆皂苷的醇提液经正丁醇萃取，减压浓缩得浓缩液加 入甲醇溶解后，再加入十倍体积的丙酮，搅拌，静置沉淀，抽滤得沉淀，干燥得8 0 含 量的大豆皂苷。d o b b i n s 等【2 9 】在大豆皂苷醇提浓缩液中加入体积比2 5 5 0 的丙酮，利用 丙酮，水来沉淀皂苷，离心或者过滤得沉淀，干燥得7 0 0 , 6 以上含量大豆皂苷。尽管皂苷在 丙酮中不溶，但升高温度，大豆皂苷会在丙酮水中部分溶解，因此操作温度不宜过高， 一般在6 0 以下。丙酮比例过高，试剂利用效率下降，水比例过高，则所得大豆皂苷纯 度下降。所得的7 0 含量皂苷可用7 0 乙醇以1 ：1 5 ( 重量：体积) 进行结晶，得纯度高 于9 5 的大豆皂苷。 李晓剖1 8 】考察了无水乙醚、乙酸乙酯、丙酮三种有机溶剂作为沉淀剂纯化大豆皂苷 的效果，结果表明，大豆皂苷在较高极性的丙酮和较低极性的乙醚中回收率都相对较低， 说明极性太大或极性太小的溶剂均不能使大豆皂苷充分沉淀。乙酸乙酯中沉淀效果居中。 大豆皂苷在乙醚中的沉淀颗粒非常小，离心仍不能完全聚集，而丙酮中皂苷颗粒则比较 大。综合考虑以丙酮为合适的沉淀剂。 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 1 6 3 酸碱水解乙酸乙酯萃取法 将大豆皂苷粗品在稀h c l 或在稀碱1 8 3 0 1 ( n a o h 、k o h 稀溶液等) 中水解为极性更小 的苷元后以乙酸乙酯萃取。这种方法最终产品纯度较高，一般在9 0 以上，但收率低， 产品外观差，分离过程耗用大量的酸碱，不适合工业化生产。 1 6 4 铅盐沉淀法 将粗品皂苷溶于少量乙醇中，加入过量的饱和乙酸铅溶液，搅拌，使大豆皂苷沉淀 完全。滤取沉淀。将所得沉淀溶解于8 0 7 醇中，然后通入h 2 s 进行脱铅处理，脱铅后， 直接将滤液减压蒸干即得大豆皂苷。或将滤液减压浓缩，浓缩液加入乙醚使大豆皂苷沉 淀析出，分离出沉淀后干燥即得大豆皂苷i 协。们。此法所得大豆皂苷产品纯度可达9 5 以 上，但产率极低，且铅离子有毒，因此限制了其应用。 1 6 5 柱层析法 1 6 5 1 大孔吸附树脂柱层析法 大孔吸附树脂是一种人工合成的具有多孔立体结构的聚合物吸附剂，是在离子交换 剂和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新树脂，是依靠它和被吸附分子( 吸附质) 之间 的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作，同时其本身的多孔状结构又 具有筛选作用。吸附和过筛作用以及本身的极性使得大孔吸附树脂具有吸附、富集、分 离不同母核结构化合物的功能1 。大孔吸附树脂多为苯乙烯型或2 甲基丙烯酸酯型，理化 性质稳定，不溶于水、酸、碱及常用有机溶剂。它对一些与其骨架结构相近的分子如芳香 族环状化合物尤具有很强的吸附能力，已经广泛用于天然产物分离和中药生产中【o 】。可 根据待分离化合物的性质选择树脂的孔径、比表面积和极性。大豆皂苷的苷元部分为憎 水性，能被非极性和弱极性树脂所吸附，同时皂苷分子较大，故应选择孔径较大的非极性 或弱极性吸附树脂 3 2 。5 】。利用大孔吸附树脂法纯化大豆皂苷工艺简单、产品纯度高，是 目前国内外研究的重点。文献报道使用最多的是d 1 0 1 、x a d 2 、a b 8 、h p - 2 0 等型号树 脂【3 6 4 6 1 。 浙江大学硕士论文( 2 0 0 7 ) 吸附树脂应用影响因素有( 1 ) 树脂的本身化学结构：大孔吸附树脂的孔径和比表面积 是影响大孔吸附树脂对中草药有效成分吸附的主要因素( 4 7 。5 2 】。大孔吸附树脂比表面积越 大，单位质量大孔吸附树脂与中草药有效成分作用的面积越大。同时大孔吸附树脂对有效 成分作用面积受大孔吸附树脂孔径的影响。大孔吸附树脂表面积由树脂外表面积和树脂 内部孔网形成的内表面积组成。当树脂孔径小于吸附的有效成分分子时，有效成分分子不 能进入树脂内部，只能吸附在树脂外表面；当树脂孔径大于有效成分分子时，有效成分 既可以吸附在树脂外表面也可吸附在内表面。综合孔径和比表面积作用结果，当树脂孔径 较大，大孔吸附树脂比表面积越大，吸附量越大；( 2 ) 溶液浓度1 5 m 3 】：皂苷在大孔吸附树脂 上是物理吸附，从物理吸附等温方程可以发现，初始浓度增加，平衡吸附量增加，吸附率 降低，平衡吸附时间增