（细胞生物学专业论文）血睾屏障体内动态变化细胞生物学机制的研究.pdf

捅婴 摘要 睾丸是雄性个体最重要的生殖器官，它不仅是精子生成的重要场所，而且还具有分泌 雄性激素、维持副性特征的功能。睾丸中主要有三种细胞赖氏细胞、支持细胞、生殖 细胞。赖氏细胞位于曲细精管之间，其分泌的睾酮等雄性激素维持着睾丸内外的激素环境； 支持细胞位于睾丸曲细精管内基底膜附近，它们之间的紧密连接形成血睾屏障，将分化至 各阶段的生殖细胞包裹在其中，为精子发生提供免疫豁免环境。研究证实在睾丸中血睾屏 障为精子的发育提供了一种免疫屏障，它不仅可是一个有选择性通透作用的屏障，能维持上 皮细胞层两侧物质成分的差异的屏障而且，它被多种方式调控，选择性地允许物质通过；它还 可能参与细胞间的信号传递实现动态变化，然而，在精子发生过程中，究竟血睾屏障如何 进行动态变化的分子结构和相关功能变化机制尚不清楚。 近年来方面血睾屏障的研究主要集中于血睾屏障组成部分紧密连接和黏附连接。尽 管紧密连接和黏附连接的分子结构已经得到了初步的研究，鉴定出了一些重要的结构膜蛋 白，但其在血睾屏障中动态变化中的作用和机制仍不甚明了，备受争论。由此，我们提出 问题：在血睾屏障动态变化中，其分子结构是否发生变化，如果答案是肯定的说明血睾屏 障结构膜蛋白分子在起着关键的作用，相反，说明血睾屏障分子结构不发生改变。 鉴于以上认识，本实验从紧密连接和黏附连接入手，分别建立镉处理和白消胺模型， 模拟睾丸内血睾屏障“打开 和“关闭”的过程，镉处理模型模拟紧密连接动态变化过程， 白消胺模型模拟黏附连接变化过程，并对血睾屏障核酸和蛋白水平进行观察分析，观察血 睾屏障动态变化过程中其分子结构和功能是否发生变化。 结果显示，镉处理后在7 小时到4 8 小时内，小鼠黏附连接结构膜蛋白表达量呈下降 趋势，紧密连接结构膜蛋白表达量也随之降低，切片观察显示血睾屏障被打开，发生动态 变化。白消胺模型结果显示处理1 4 天到9 0 天时，黏附连接结构膜蛋白表达量呈下降趋势， 紧密连接结构膜蛋白表达量也随之降低，从9 0 天到1 5 0 天时紧密连接结构膜蛋白表达量 和黏附连接结构膜蛋白表达量逐渐回升这些说明本实验所使用的实时荧光定量p c r 技术 和免疫印迹技术是成熟的。由于紧密连接和黏附连接都参与了血睾屏障动态变化，而精子 发生却要首先从基底膜开始穿越支持细胞之间和与生精细胞间形成的紧密连接与黏附连 接再到达管腔，证明在紧密连接和黏附连接结构膜蛋白的动态变化下，精母细胞可以穿越 小鼠睾丸的紧密连接和黏附连接，使得细线期精母细胞完全穿越血睾屏障；亦证明了荧光 定量p c r 技术和血睾屏障示踪等检测血睾屏障结构和功能技术的稳定和可靠性为本研究 提供了技术保障。 i 捅要 实验步骤分两种情况，一是通过生物素示踪技术观察所建立的动物模型的血睾屏障是 否发生变化并通过示踪物侵入距离来分析其变化程度，二是针对不同处理模型和不同时间 点r n a 的样本进行实时动态分析，并对其蛋白表达量进行统计。血睾屏障生物素示踪结 果显示，棕色的生物素沉淀进入到动物模型的曲细精管腔内部，随着处理时间的增加其示 踪物侵入距离和程度越明显，通过数据统计说明镉和白消胺处理模型的血睾屏障已经发生 动态变化，即可以模拟正常情况下血睾屏障通透性变化的过程；对不同处理模型和不同时 间点r n a 的样本进行实时动态分析结果显示，紧密连接和黏附连接的结构膜蛋白会随着 血睾屏障的动态变化而升高和降低，二者存在着信号传递上的联系，并且随着药物针对靶 位的不同紧密连接和黏附连接发生变化的顺序和蛋白表达量也有差别，这说明在血睾屏障 动态变化过程中存在着一套复杂的分子变化机制。 由上可知，当针对研究紧密连接变化的镉处理模型中，黏附连接膜蛋白先于紧密连接 膜蛋白发生变化，表达时间和量上二者均有较大差别；在针对研究黏附连接的白消胺模型 中，黏附连接蛋白膜先于紧密连接膜蛋白发生变化，并先于紧密连接膜蛋白在1 5 0 天后恢 复 本课题采用血睾屏障生物素示踪和实时荧光定量p c r 研究血睾屏障膜蛋白的相互关 系及动态变化过程，结果验证了血睾屏障动力学研究上的紧密连接“打开关闭“假说 和黏附连接“聚合”“解聚”假说，发现了血睾屏障动态变化中存在着一套复杂的分子变化 机制，说明在动态变化过程中其结构膜蛋白具有关键的作用，是血睾屏障动态变化中的重 要建筑模块。本研究不仅为最终阐明血睾屏障动态变化提供可靠的依据；而且对建立新型 血睾屏障动态变化研究模型具有重要的理论意义，同时为哺乳动物睾丸内微环境研究打下 基础，也为推动雄性生殖生物学临床应用起到积极的作用，可为男性不育患者带来福音。 关键词：血睾屏障紧密连接黏附连接 a b s t a c t a b s t r a c t t e s t i s ， a sar e p r o d u c t i v eo r g a ni nm a l em a m m a l s ， c o m p o s e so ft w o m a i np a r t s ：s e m i n i f e r o u st u b u l e sf o rs p e r m a t o g e n e s i sa n di n t e r s t i t i a l t i s s u ef o rs e c r e t i n ga n d r o g e nw h i c hk e e pt h em a l ec h a r a c t e r s t e s t i s h a sar e l a t i v e l yi m m u n em i c r o e n v i r o n m e n t ，n a m e da sn i c h e ，t h e r em a i n l y a r et h r e et y p e so fc e l l s l e y d i gc e l l s ，s e r t o l ic e l l sa n dg e r m c e l l s ，a n db l o o d t e s t i sb a r r i e rw h i c hb e t w e e nt h e m i nd e t a i l s ，l e y d i g c e l l sl i e sa m o n gt h es e m i n i f e r o u st u b u l e s ，w h i c hc a ns e c r e ta n d r o g e n t om a i n t a i nt h eh o r m o n ee n v i r o n m e n t ：s e r t o l ic e l l sb u i i dt h e b l o o d t e s t i sb a r r i e rw i t ht h et i g h tj u n c t i o nt op r o v i d et h es p e c i a l e n v i r o n m e n tw i t h o u ti m m u n i t y ，w h i c hi sv e r yi m p o r t a n tf o r s p e r m a t o g e n e s i s as i n g l et y p ea 1s p e r m a t o g o n i u m i nr o d e n t s ，s u c ha s r a t sa n dm i c e ，g i v e sr i s et o2 5 6m a t u r es p e r m a t i d si nt h es e m i n i f e r o u s e p it h e li u md u r i n g s p e r m a t o g e n e sisf o rt h ise v e n tt o h a p p e n ， p r e l e p t o t e n ea n dl e p t o t e n es p e r m a t o c y t e sm u s t t r a v e r s et h e b l o o d t e s t i sb a r r i e r ( b t b ，a l s ok n o w na st h e s e m i n i f e r o u se p i t h e l i u m b a r r i e r ) a tl a t es t a g ev i i ia n de a r l yi x o ft h ee p i t h e l i a lc y c l e t h e b t bi sc o n s t i t u t e d l a r g e l yb yi n t e r s e r t o l ic e l lt i g h tj u n c t i o n s ( w j ) h o w e v e r ，c e l l c e l l a c t i n b a s e da d h e r e n sj u n c t i o n s ( a j ) e c t o p l a s m i c s p e c i a l i z a t i o n ，at e s t i s s p e c i f i ca jt y p e ) a n dp o s s i b l y c e l l c e l l i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t b a s e dd e s m o s o m e 一1 i k ej u n c t i o n s ，a r e a l s of o u n da tt h eb t bs i t e a ss u c h ， t h e s e j u n c t i o n sm u s tu n d e r g o e x t e n s i v er e s t r u c t u r i n gd u r i n gt h i s p r o c e s so fg e r mc e l lm i g r a t i o n y e t i i i a b s t a c c t h em e c h a n is m ( s ) t h a t r e g u l a t e sb t bd y n a m ic sr e m a i n sl a r g e l yu n k n o w n r e c e n ty e a r st h es t u d i e sc o n c e r n i n gb t bm o s t l yc o n c e n t r a t e do nt i g h t j u n c t i o n s ( t j s ) a n da d h e r nj u n c t i o n s ( a j s ) ，a sar e s u l tt h e yf o u n ds o m e i m p o r t a n tc o m p o n e n tp r o t e i n sb u tt h et h em e c h a n i s mo ft h eb t bd y n a m i c isn o tcle a r s ow ea d w a n c e dt h et h e o r yt h a tw h e t h e rt h ec o m p o n e t p r o t e i n sh a sc h a n g e da n dt h em e c h a n i s m st h e yt a k ec h a n g e d t oa d d r e s sa b o v eq u e s ti o n ，o u re x p e r i m e n t ss t a r tw it h e s t a b l i s h i n gt h em o d e lo fc a d m i u ma n db u s u l f a ni nm i c e t h er e s e a r c h i n g i nt w om o d e l sf o c u so nt h et j sa n da j ss e p a r a t e l y t h e nw eu s et h eb i o t i n a sat r a c e rt oa n a l y s i st h ew h e t h e rt h eb t bh a sc h a n g e d ，a l s ow ea n a l y s i s t h er n as a m p l e so fd i f f e r e n tt i m e p o i n tb e t w e e nt h e s em o d e l s f i n a ll y w ea n a l y z e dt h em a i nc o m p o n e tp r o t e i n si n b t bi nd n aa n dp r o t e i n l e v e l t os e ew h e t h e rt h e r eh a st h em e c h a n i s mo f “a s s e m b l y d i s a s s e m b l y ”i nb t bd y n a m i c a sar e s u l t ，f r o m7h o u r st o4 8h o u r sa f t e rt h et h et r e a t m e n t o fc a d m i u m ，t h e e x p r e s s i o n o fp r o t e i n i n a j s h a sd e c r e a s e d f i r s t l y l i k e l yf r o m1 4d a y st o1 5 0d a y sa f t e rt h e t h et r e a t m e n to f b u s u f l a n ，t h ee x p r e s s i o no fp r o t e i ni na j sh a sd e c r e a s e da n df r o m1 4 d a y st o9 0d a y sa f t e rt h et h et r e a t m e n to fb u s u f l a n ，t h e nt h ee x p r e s s i o n o fp r o t e i ni nt j sh a sc a m eb a c k t h i sr e s u l td e m o n s t r a t e dt h a t t h a t o u re x p e r i m e n t su s i n g t e c h n i q u e so fr e a l t i m ep c ra n dw e s t e r nb l o t t i n gi sr e l i a b l e t h er e s u l t r e v e a l e dt h a tp r e l e p t o t e n ea n d e p t o t e n es p e r m a t o c y t e sm u s tt r a v e r s e i v a b s t a c t t h eb l o o d t e s t i sb a r r i e r ，s ot h e r eh a st h em e c h a n i s mt o t oa l l o wt h e s p e r m a t o c y t e st ot r a v e r s et h eb t b i nt h i sp r o c e s st h ec o m p e n tp r o t e i n i nb t ba l s o t a k ec h a n g e di nq u a n t i t y t h es u c c e s so fc o n t r o lg r o u p w i t hn o r m a lm i c ed e m o n s t r a t e dt h a tourt e c h n i q u ef o rr e a l ti m ep c ra n d o t h e r sw e r er e li a b l ei nt h er e s e a r c h i nc o n c l u s i o n ，o u rr e s u l t sc l e a r l yr e v e a l e dt h a tt h e r eh a sm e c h a n i s m i nb t bd y n a m i c i nt h i s p r o c e s st h e r eh a sc a l l e d “a s s e m b l y a n d d i s a s s e m b l y ”p h e n o m e n a t h em e m b r a n ep r o t e i no fb t bp l a y e da n i m p o r t a n tr o l ei ni t t h ep r e s e n ts t u d yi sv e r yh e l p f u lf o ra d d r e s s i n g t h eb a s i cq u e s t i o n sa b o u tb t ba n di m p e li n gc l i n i cp r a c t i c ec o n c e r n e d w i t hm a l ef e r t i l i t y k e yw o r d s ：b l o o d t e s t i sb a r r i e rt i g h tj u n c t i o n a d h e r e nj u n c t i o n v 首都师范大学学位论文使用授权声明 本人已经认真阅读首都师范大学的“研究生学位论文著作权管理规定 ，同意本人所 撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥有学位论文 的部分使用权，即： 1 )已获学位的研究生必须按学校规定提交印刷版和电子版学位论文，学校可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文； 2 )为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料 在图书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 作者签名：蒋福兴导师签名：朱宝长 2 迦墨年三月上卫且 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程 中的规定享受相 关权益。 回童途塞握銮卮澄卮! ! 兰生；旦二生 旦三生蕉查! 作者签名：蒋福兴导师签名：朱宝长 2 q q 墨年量月2 q 目 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其它个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：蒋福兴 日期：2 0 0 8 年5 月2 0 日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名：蒋福兴 日期：2 0 0 8 年5 月2 0 日 第一部分文献综述及木题意义 第一部分文献综述及本题意义 血睾屏障的基本结构和功能 1 血睾屏障的基本结构 血睾屏障最早是b r u y n 等于1 9 5 0 年发现的，他们将染料注入动物的血液后，染料会 出现在全身各器官组织中，而在大脑和睾丸曲细精管中却没有发现染料。2 0 世纪6 0 年代 初，学者们发现曲细精管的肌样细胞层及支持细胞间的紧密连接构成了物质通透的屏障。 1 9 7 0 年，f a w c e tt 等【1 】【3 】用电子致密物质标记法于电镜下显示了血睾屏障的存在。 许多研究证明，血睾屏障是睾丸间质内的毛细血管与曲细精管之间存在的结构总称， 主要包括间质内毛细血管的内皮细胞及其基膜、曲细精管的界膜、曲细精管内支持细胞之 间的紧密连接【2 j 。睾丸间质内存在着丰富的毛细血管，它构成血管的渗透性屏障，参与曲 细精管与睾丸间质的物质交换。正常生理状态下，毛细血管的内皮细胞能选择性调节从小 分子至超大分子的物质通过；毛细血管的基膜是由内皮细胞和成纤维细胞共同产生的，其 主要成分是i 型胶原、片蛋白、串珠素等【3 】1 5 】。基膜构成了内皮细胞与结缔组织间的界面 结构，同时，它对大分子蛋白等物质具有选择性通透作用 4 1 【5 】。曲细精管的界膜是介于毛 细血管与生精上皮之间结构的总称，对曲细精管与睾丸间质的物质交换起着重要的屏障作 用，它对物质的通透具有选择性，因此也属于血睾屏障的组成部分1 6 1 。曲细精管的界膜自 血管侧至曲细精管侧分为成纤维细胞层、类肌细胞层及基膜。成纤维细胞主要对界膜起修 复作用【7 1 。类肌细胞层一般认为是物质通透的主要屏障，精小管界膜中的成分有i 、i i i 、 型胶原、层粘连蛋白、制动素着位素、纤维粘连蛋白和蛋白多糖等 9 1 。细胞外基质具有 重要的生物学功能，可通过形成非特异屏障参与血睾屏障的构成；在靠近曲细精管基底部 的支持细胞间形成的紧密连接，是构成血睾屏障的形态学基础。此连接将曲细精管进一步 分隔成基底室和近腔室，在生精细胞向管腔迁移运动过程中，在基底室和近腔室间还形成 中间室【1 0 。15 1 。基底室位于曲细精管基底膜与支持细胞的紧密连接之间，内含精原细胞、前 细线期和细线期精母细胞。近腔室位于基底室的内侧，含有细线期以后的各级生精细胞。 此连接不是一个简单的“篱笆”，它在精子形成的过程中、在不同的生殖周期内以及生命的 各个阶段都是处于动态的变化过程之中【1 6 1 。睾丸支持细胞之间通过紧密连接( t i g h t j u n c t i o nt j ) 和支持细胞与生殖细胞之间的黏附连接( a d h e r nj u n c t i o n ) 为主要结构形 1 首部师范人学颂十学协论文 成的血睾屏障( b l o o dt e s t isb a r r i e rb t b ) ，将生精上皮分成基底室和近腔室( 如图1 ) 。 前细线期和细线期的初级精目细胞位于生精上皮的基底室。必须通过j 】i l 睾屏障进入近腔室， 爿能分化形成成熟单倍体槽子细胞【1 7 - 2 0 。 。壁! 竺。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ _ 一s i e h e s j s_ ：e i o s i s m ；t o es 图1 血睾屏障基本结构 1 2 紧密连接的基本结构 紧密连接的膜整合蛋白种类很多( 如图2 ) 能够调节紧密连接动力学以及能够影响精 于发生的蛋白主要有3 类重要的结构膜蛋白，即o c c l u d i ns ，c l a u d i n s ，以及j a l f ( j u c t i o n a l a d h e n s i o nm o l e c u l e s ) i i s 。 l 2 1 闭锁蛋白o c c l u d i n 家族是紧密连接膜整合蛋白中的一种相对分子量为6 0 6 5 k d a - 2 一 第一部分文献综述及木题意义 曼曼曼皇! ! ! 曼舅皇曼曼曼曼曼皇曼量曼舅o _ _ m。m m m m mmm m。 m 寰 的单链多肽，是依赖钙离子的细胞内连接分子，具有防卫与屏障的功能。它由4 个跨膜结 构域、2 个细胞外环、1 个细胞内环、1 个小的n 末端胞质结构域与个大的c 末端胞质结构 域组成，它的第一个细胞外结构域富含t y r 和g l y ( 6 0 ) 1 9 】【2 0 1 。这种结构在不同的动物 中具有高度同源性。也有研究显示，相邻的2 个o c c l u d i n 分子可以发生聚合作用，研究 中发现f u r u s 以闭锁蛋白e d n a 转染哺乳动物肾小管上皮细胞m d b k ，发现鸡闭锁蛋白在m d b k 细胞中表达并准确定位于m d b k 细胞的紧密连接部位，不同的是其胞浆内仅有1 5 0 个氨基酸 残基，这可能与翻译后修饰有判2 0 1 。人、小鼠、狗的闭锁蛋白具有高度同源性( 9 0 ) ，证明 闭锁蛋白在进化上非常保剞2 1 1 。更具意义的是，所表达的闭锁蛋白羧基末端亦同胞膜下z 0 1 结合，进一步提示它通过z 0 1 与细胞内其它蛋白质相结合形成稳定的结构，这对维持紧密连 接的正常功能是必不可少的【2 2 2 5 1 。o c c l u d i n 是影响支持细胞紧密连接功能的一种关键蛋 白质，对细胞间的黏连与通讯起着重要的作用，与钙黏蛋白相偶连，它的任何微小的变化 都会引起紧密连接与黏着连接中许多分子的连锁变化，导致紧密连接与黏着连接结构与功 能的变化【2 酬。 在m d c k 细胞中，o c c l u d i n 过度表达，增强上皮中的电阻( t e r ) ，使得t j 连接屏障变得 更紧。在培养x e n o p u s 上皮中添加人工合成的可封闭o c c l u d i n 的多肽，可以降低t e r ，破 坏血睾屏障的功能，最终导致生殖细胞的丢失【2 7 1 。在支持细胞体外模型中，c d c l ：能导致支 持细胞内o c c l u d i n 的表达量降低，使血睾屏障的通透性增大，撤除c d c l 。后，血睾屏障的 通透性恢复伴随着支持细胞内的o c c l u d i n的表达量升高，这表明o c c l u d i n 与血睾屏 障的通透性有着十分密切的关系【2 7 珈l 。 o c c l u d i n 影响精子发生的作用机制，o c c l u d i n 可能通过钙黏蛋白来影响紧密连接与 黏着连接的结构，从而导致精子细胞数量的减少。这也提示，紧密连接与黏附连接存在着 广泛的联系，比如c d c l 。导致的紧密连接的损伤，可以降低钙黏蛋白的表达量以及钙黏 蛋白在黏着连接中的重新定位与分布。其他的研究也证明，紧密连接与黏着连接在功能上 也有着广泛的联系【3 l 】。黏着连接的分解可以阻止紧密连接的组装。此外，钙黏蛋白在大鼠 睾丸b t b 形成之前的最高表达，也提示紧密连接与黏着连接的装配都需要大量的钙黏蛋白 1 3 2 1 1 2 1 。紧密连接内相邻细胞上的o c c l u d i n 与o c c l u d i n 能够相互连锁配对成绳索状纤 维，不过，这些o c c l u d i n分子在很大程度上是去磷酸化的，这表明，部分o c c l u d i n 不 是通过磷酸化作用，而是通过其他的信号途径来调节紧密连接动力学的【3 3 1 2 0 】。不同的蛋白 质也有可能通过不同的信号转导途不过o c c l u d i n 对紧密连接的破坏能否引起其他细胞 的变化有待进一步研究。 首都师范大学硕十学何论文 l 一一曼 i 曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼蔓! ! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼鼍曼皇曼! 皇曼皇曼曼曼曼曼曼葛曼量皇 1 2 1c l a u d i n s 是在上皮和内皮细胞紧密连接位点处发现的的紧密连接结构膜蛋白， 至少有2 4 种，分子质量均在2 0 k d - - 一2 7 k d 之间，c l a u d i n 家族是紧密连接膜整合蛋白中的另 一族成员，其相对分子量约为2 2 k d a 对紧密连接的功能及上皮细胞问的连接起着重要作用。 c l a u d i n 与o c c l u d i n 有着相似的分子拓扑学特征，每一种c l a u d i n 分子包含1 个短的n 末端胞质结构域、4 个跨膜结构域、2 个细胞外环与1 个大的c 末端胞质结构域。它的一 级结构与o c c l u d i n 没有任何同源性，这表明c l a u d i n 与o c c l u d i n 是两种不同的蛋白 质。实际上，相邻细胞间的o c c l u d i n - - c l a u d i n 复合体形成的小孔，是小分子物质通过 紧密连接的通道。o c c l u d i n 或c l a u d i n 通过周围膜蛋白z o - 1 的s h 3 结构域与细胞质内 的细胞骨架相连接，从而将紧密连接的膜蛋白与细胞骨架相偶联，进而与支持细胞形成的 紧密连接的紧密程度相关联】。z 0 - 1 在信号转导分子的作用下，可以调节紧密连接的紧密 程度，从而决定是否让精子细胞通过紧密连接，在c l a u d i n 完全敲除的小鼠睾丸中发现， 支持细胞跨膜条带已经消失，并且在它们的生精小管内是成簇的有核细胞群，但没有正常 的精子，动物表现为没有生育能力，造成这一结果可能是因为c l a u d i n 基因敲除后，c l a u d i n 的表达量降到很低，不能再与o c c l u d i n 形成小分子出入细胞所需的通道，生精细胞所需 的营养物质和细胞因子不能及时传递给生精细胞，生精细胞的发育和代谢出现紊乱，因此 正常的精子的生成受阻，动物丧失了生育能力。对以上结果分析，c l a u d i n 可能主要通过参 与物质的转运，调节精子的生成【1 2 】。 1 2 3 j a m 是紧密连接膜整合蛋白中的第三个家族，它主要定位于上皮细胞与内皮细胞 中，其相对分子量约为3 6 4 1k d a ，分子质量的差异可能是因为不同的j a m 有着大小不 同的糖链。每个j a m 分子包含1 个细胞内结构域、1 个细胞外结构域和1 个跨膜结构域【3 5 1 。 其细胞外结构域由2 个与免疫球蛋白结构类似的“v 一型结构构成。j a m 可以促进同型细 胞间的黏连。若将j a m 基因转进c h o 细胞，c h o 细胞对右旋糖苷的通透性降低5 0 左右， j a m 的这种功能与钙黏蛋白类似 2 0 l 。不过j a m 是否是紧密连接纤维的必须组分以及紧密 连接的功能性蛋白质，还有待于进一步研究。然而，体外与体内实验都表明，j a m 的单克 隆抗体可以阻止单核细胞穿越内皮细胞，能够抑制白细胞在脑脊液晕的积聚，还能阻止白 细胞进入脑的软组织以及可以降低血脑屏障的通透性。基于以上研究，可以认为j a m 是 控制脑膜炎炎性反应的一种新的靶蛋白。另一方面，用t n f 一和i f n y 联合处理人 内皮细胞，可以导致j a m 在内皮细胞内的重新分布，进而可以促使白细胞穿越内皮细胞【3 3 1 2 0 l 。这都表明，j a m 的重新定位对帮助白细胞穿越血管内皮、到达炎性部位以及引发炎性 反应具有重要的作用。巨核细胞中有j a mm p , n a 的表达，提示j a m 还有其他未知的生理 第一部分文献综述及本艇意义 功能【1 “。对j a l i 是否能够促进前细线期与细线期精原细胞穿越血睾屏障有待进一步研究。 由于j a m 有促进白细胞穿越血管内皮这一独特的功能，因此，这一家族对进一步研究探 讨精予发生过程中紧密连接动力学的变化可能具有重要的价值。 ，l 。 黏 图2 紧密连接基本结构 1 3 黏附连接的基本结构 淤 。蒜。 一一7 高蕊纛【一 目前在哺乳动物睾丸内已经发现的三种黏附连接形式中，支持细胞与生精细胞之间的黏 附连接是研究最为集中的方面，通过2 0 0 0 年c h e n g 等研究发现，黏附连接主要由 c a d h e r i n c a t e n i n ，n e c t i n a f a d i n a n d i n t e g r i a l a m i n i n 三种蛋白功能复合体组成并发 挥信号传导的功能t 搠，其中c a d h e r i nn e c t i ni n t e g r i n 是结构膜蛋白c a t e n i n a f a d i n l a m i n i 等是功能膜蛋白( 如图3 ) ，它们通过肌动虽白( a c t i n ) 与细胞骨架相联发挥功能。 例如c a d h e r i n c u t e n i n 蛋白复合体遭过肌动蛋白f ( f - a c t i n ) 与细艟骨架相联，从而与 另一复台体n e c t i n a f a d i n 相联系传导信号，而且最新研究表明a f a d i n 也可以与紧密连 接周围膜蛋白z o _ l 相连接从而使黏附连接与紧密连接发生信号通路的调节，这一事实同 时也说明c a d h e r i n c a t e n i n ，n e c t i n a f a d i n i n t e g r i n l a m i n i n 四种蛋白功能复合体之 间也存在着交互作用( c r o s s t a l k i n g ) d ，除了上述几种膜蛋白井近年来还鉴定一些信 号分子如c s k ，c a s ，c - s r c p g o c t n ，c 9 2 ，a n dp t p - r l i o 等它们与结构膜蛋白一起做为 结构成分，并行使着信号转导的作用。 c a 4 h e r i n 是黏附连接结构膜虽白，分予量大小为9 0 1 3 0 9 d ，按其表达位置分为上皮 c a d h e t i n ( e p i t h e l i a lc a d h e r i ne - c a d h e r i n ) ，神经c a d h e r i n ( n e u r a lc a d h e r i n s 首都师范人学硕十学位论文 n c a d h e r i n ) ，胎盘c a d h e r l n ( p l a c e n t a lc a d h e r i np c a d h e r i n ) ，每个c a d h e r i n 分子由一个高浓缩细胞质区，一个跨膜区和由5 5 0 个氨基酸残基组成的胞外区构成在膜 内区每个c a d h e r i n 分子与b 或r - c a t e n i n 相连接组成c a d h e r in c a t e n in 蛋白复合物，而 另一端与细胞骨架蛋白a c t i n 相连，( 见圈1 ) 目前通过支持细胞体外培养血睾屏障发现 已经发现了c a d h e r i n c a t e n i n 的存在”l1 3 4 1 ，这项发现表明在哺乳动物睾丸中支持细胞与 生精细胞问的黏附连接广泛表达c a d h e n n c a t e n l n ，发挥细胞连接功能单位的作用，同样 通过免疫荧光检验技术发现c a d h e r l n c a t e n l n 定位在了生精细胞与支持细胞连接之上 在使用免疫共沉淀和蛋白免疫印迹技术还鉴定出了e - l c a d h e r i n 、与0 一c a t e n i n 成一比一 的比例相互作用t 并与b a c t i n 相连近而与细胞骨架相连接，从而调节黏附连接功能。 图3 黏附连接基本结构 第一部分文献综述及本题意义 曼i i ! 曼曼曼曼曼曼皇曼! 曼曼 4 血睾屏障的基本功能 血一睾屏障可以防止精子抗原外逸进入血液循环引起自身免疫反应，同时也防止有害物 质进入生精小管，干扰精子的发生，为生精细胞分裂增殖及精子产生创造了一个特殊稳定 环境。 1 4 1 提供生精细胞发育的微环境 精原细胞位于基底室内，在精子发生的动态过程中，细线期精母细胞分化成粗线期精 母细胞离开基底室，穿过紧密连接中部时，这些紧密连接能分段开放，并在粗线期精母细胞 的下方紧密连接重新组合，形成中间室。中间室的存在能确保生精细胞向管腔移动时维持 血一睾屏障的连续性和完整性【3 9 l 。随后近腔侧的紧密连接开放，生精细胞进入近腔室，中间 室消失。基底室与近腔室的微环境是不同的，血浆和淋巴中的某些物质能进入基底室，与生 精细胞接触，但不能通过紧密连接，进入近腔室，保证了近腔室内精母细胞的成熟分裂和精 子发育所需的微环境，对精子的发生具有重要作用【删。血一睾屏障的存在，还对维持基底室 和近腔室间一定的渗透压梯度，对生精上皮产生的液体向管腔方向分泌具有重要作用。 1 4 2 免疫屏障作用 发育中的精母细胞、精子细胞和精子有特异的自身抗原，正常情况下的血一睾屏障能阻 止这些特异抗原与机体的免疫系统接触，避免发生自身免疫反应。即使生殖道远端屏障破 坏，机体对精子发生也会产生自身致敏反应产生抗精子抗体，但血循环中的抗精子抗体不 能通过血一睾屏障进入生精小管，阻止与精子发生免疫反剧2 0 1 。如果血一睾屏障被破坏，精子 抗原与机体的免疫系统接触，将会引起自身免疫性睾丸炎，从而导致男性不育。 1 4 3 通透屏障作用 血一睾屏障的各层结构对不同大小物质的通透及其通透速度具有选择性。正常情况下， 离子与小分子物质通透快，其中水分子通过最快，3 0 m i n 可进入睾网液。酒精、尿素、甘油 及碳酸氢盐能缓缓地进入睾网液。标记钠、钾、氯和碘注入血流后能缓缓地进入睾网液，3 h 后其浓度仍低于血浆。由于葡萄糖在睾丸内很快代谢，因而睾网液中一般不含葡萄糖和果 糖。氨基酸进入睾网液的速度以谷氨酸最慢，甘氨酸略快【4 。血浆蛋白几乎完全不能通过 血一睾屏障，因而睾网液内蛋白含量很低。类固醇通透力弱，睾网液中的含量比血液低。许 多抗生育药物可进入睾网液，起到抗生育作用。 1 - 4 4 提供生精细胞发育微环境作用 提供生精细胞发育的微环境精原细胞位于基底室内，在精子发生的动态过程中，细 首都师范人学硕十孑：何论文 线期精母细胞分化成粗线期精母细胞离开基底室，穿过紧密连接中部时，这些紧密连接能 分段开放，并在粗线期精母细胞的下方紧密连接重新组合，形成中间室。中间室的存在能确 保生精细胞向管腔移动时维持血一睾屏障的连续性和完整性。随后近腔侧的紧密连接开放， 生精细胞进入近腔室，中间室消失【4 2 1 。基底室与近腔室的微环境是不同的，血浆和淋巴中的 某些物质能进入基底室，与生精细胞接触，但不能通过紧密连接，进入近腔室，保证了近腔 室内精母细胞的成熟分裂和精子发育所需的微环境，对精子的发生具有重要作用。血一睾屏 障的存在，还对维持基底室和近腔室间一定的渗透压梯度，对生精上皮产生的液体向管腔 方向分泌具有重要作用。 1 5 血睾屏障的动力学研究进展 有序的开放机制保证了精子生成的顺利完成紧密连接形成的血睾屏障也调节着物质 的运动，如营养物和代谢产物在生精上皮的进出。虽然有关睾丸中紧密连接对物质的运输 研究甚少，但是在其他器官中，溶质通过紧密连接的调节机制已经有了较深入的研究，如肾 和肠。这将为睾丸中紧密连接开放机制的研究提供一定的依据 2 0 l 4 3 】。镉诱导的b t b 的破 坏可能引发或继发于黏附连接( a j ) 的分解，所以该模型对研究睾丸内黏附连接和紧密连 接在生理和功能上的关系来说是相当有意义的，特别是因为二者之间存在交互作用( c r o s s t a l k i n g ) 4 4 1 。该模型的缺点是镉诱导的b t b 损坏是不可逆的，这就对b t b 恢复过程中的 目标基因改变的平谷造成困难。 在对其他上皮( 如体外m d c k ) 细胞的研究中，人们虽然还没有完全知晓调节紧密连 接生物学发生和紧密连接动力学调节的信号途径或者分子，但近来研究鉴定出了可以影响 血睾屏障动力学的生物分子【4 5 】，这些分子包括t g f b 3 ，c a 2 + , 磷酸化的紧密连接蛋白，钙调 蛋白，c a m p 以及p k a 和p k c 等，上述已知同紧密连接和黏附连接有关的大多数的信号 分子仍有待于在睾丸内进行确定和研究。 已有研究研究显示在支持细胞紧密连接组装的过程中t g f 在m r n a 和蛋白质水平都有短 暂的下降，添加t g f 到支持细胞的培养基内可以有效地抑制o c c l u d i n ，c l a u d i n 1 l 的表达， 并进而干扰支持细胞紧密连接屏障，同样的添加重组的t g f 也可以干扰体外己形成良好的 紧密连接屏障，所得到结果共同表明了t g f 是在血睾屏障动力学调节中一个重要的细胞因 子，最近研究也显示了t g f 通过p 3 8 m a p k 途径干扰了支持细胞紧密连接屏障，在体外 p 3 8 m a p k 的一种特异性抑制剂s b 2 0 2 1 9 0 可以有效的中止t g f 诱导的支持细胞紧密连接 的分解1 3 0 1 4 4 ，这些观察结果清楚的显示，如果t g f 确实可以在体内干扰b t b ，那么睾内 r 第一部分文献综述及木题恿义 该细胞因子功能的确实就可以干扰血睾屏障的功能。 酪氨酸的磷酸化在调节血睾屏障动力学中具有重要的作用( 如图4 ) ，o c c l u d i n ，和z o 1 都可以为酪氨酸激酶的底物并被磷酸化，在紧密连接位点发现的o c c l u d i n ，是被高度磷酸 化的，在m d c k 细胞血睾屏障的组装过程中人们也越来越多检测到o c c l u d i n ，c l a u d i n 1 1 的磷酸化现象m 】，在小鼠睾丸内，伴随着b t b 的发展磷酸化的o c c l u d i n ，的水平也逐渐增 加，表明了o c c l u d i n ，的表达水平同紧密连接的组装是相关的，另外大鼠的支持细胞和生精 细胞都可以表达肌管素( r m t m ) 并且产生r m t m 蛋白( 可能为一种蛋白酪氨酸磷酸酶