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南方医科大学 博士学位论文 kindlin-2通过促进tgf-smad信号通路加速肾脏纤维化 姓名：魏潇凡 申请学位级别：博士 专业：内科学（肾病） 指导教师：侯凡凡；张宏权 201106 博士学位论文 k i n d l i n 2 通过促进t g f - p s m a d 信号通 路加速肾脏纤维化 博士研究生：魏潇凡 指导教师：侯凡凡教授 张宏权教授 摘要 研究背景 慢性肾脏病( c h r o n i ck i d n e yd i s e a s e ，c k d ) 已成为威胁全世界公共健康的 主要疾病之一，严重危害人类健康及经济。流行病学调查数据显示，慢性肾脏 病在中国、美国、日本、加拿大及伊朗的发病率已达到1 0 一1 3 ，不亚于糖尿 病和高血压的发病率。此外，c k d 发病还呈现出年轻化趋势，二三十岁的透析 患者越来越多，年龄最小的甚至不至l j l 0 岁，令人震惊。因此，延缓肾脏疾病并 减少肾脏损伤已刻不容缓。 肾脏纤维化是各种进展性肾病的最终通路。尽管肾脏纤维化的发病机制复 杂，但大量研究证实t g f b 在肾脏纤维化中发挥着关键性的作用，与细胞的增殖、 凋亡、活化、迁移、细胞外基质合成有密切关系，参与肾纤维化的各个环节中， t g f b 被认为是最重要最强烈的纤维化诱导因子。t g f 1 3 1 诱导的生物学功能主要 依赖其完整的s m a d s 信号通路。t g f p 1 首先与其i i 型受体( t p r i i ) 结合，t 1 3 r i i 磷酸化i 型受体( t 1 3 r 0 ，激活的t 1 3 r i 将活化s m a d 蛋白s m a d 2 和s m a d 3 ，磷酸化 的s m a d 2 和s m a d 3 随后与s m a d 4 一同进入细胞核，在核内调控了t g f p 1 靶基因的 ， 转录。虽然大家都熟知这个过程，但是t g f 1 3 1 受体与s m a d 2 和s m a d 3 相互作用的 机制还有待深入探索，研究发现在这过程中有多种衔接蛋白分子对其进行着调 控从而促进t g f b 1 s m a d 信号。 肾脏纤维化的病理特征是过量的细胞外基质( e c m ) 的积聚和沉积，而肌成 中文摘要 纤维细胞( m f b ) 是导致病理条件下肾间质中e c m 过度沉积的主要效应细胞。研 究证实上皮一间充质转化( ( e p i t h e l i a l m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n , e m t ) 是m f b 来源 的一个重要机制。e m t ，是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下失去其上皮 表型向问充质细胞转分化的现象。已有越来越多的研究强有力地证实了e m t 在 不同类型的肾脏疾病中发挥着重要作用，而逆转e m t 则能有效改善肾脏纤维化。 虽然大量研究揭示了各种e m t 的始动因素、调节因子及存在的信号通路，但是 在所有的因素中，t g f b 1 是核心因子，启动并调节e m t 的全过程。 我们的课题合作研究组发现k i n d l i n - 2 蛋白可以诱导乳腺癌细胞e m t 而促进 乳腺肿瘤细胞的转移。这个发现引起了我们对k i n d l i n - 2 分子的关注，k i n d l i n - 2 是否也参与肾脏上皮细胞的e m t 而促进肾脏纤维化呢? k i n d l i n - 2 是k i n d l i n 蛋自 家族的一种，k i n d l i n 蛋白家族是一类新型的衔接蛋白，它能与整合素相互作用 加强整合素的激活。研究还发现k i n d l i n - 2 在肌动蛋白极化、细胞伸展及整合素连 接激酶定位在黏着斑中发挥着必不可少的作用。另外，k i n d l i n - 2 在胚胎发育及肿 瘤进展中发挥着重要功能。 目前，有关k i n d l i n - 2 在肾脏中的作用鲜有报道。唯一的一篇也是最新的一篇 文献指k i n d l i n - 2 通过与整合素的相互作用调节足细胞的粘附和纤维连接蛋白 的沉积，文中还提出t g f b 能明显增加足细胞k i n d l i n - 2 的表达，提示k i n d l i n - 2 可能参与肾脏疾病。我们分别以人近端肾小管上皮细胞为体外模型，以小鼠单 侧输尿管结扎模型开展动物实验并结合患有肾脏纤维化的临床病人的肾脏活检 标本研究k i n d l i n - 2 在肾脏纤维化中的作用，并探讨了k i n d l i n - 2 与t g f 1 3 s m a d 3 信号通路的关系，阐明了具有创新性的分子机制。 博士学位论文 第一章k i n d l i n 2 参与t g f - p l 诱导的人肾小管上皮细胞的上皮一问 充质转化m 町 目的 观察k i n d l i n - 2 对h k c 细胞上皮间充质转化的作用；研究t g f d 1 对k i n d l i n - 2 的调节作用并探索k i n d l i n - 2 在t g f 一1 3 1 诱导h k c 细胞e m i 中充当的角色。 方法 1 常规培养肾小管上皮细胞h k c ，不同剂量的t g f p l ( 0 、l 、2 、s 2 乏1 0 n g m 1 ) 作 用于h k c 细胞4 8 d , 时或5 n g m lt g f b 1 作用于h k c 细胞不同时间( 0 、1 2 、2 4 、 4 8 及7 2 d x 时) ，或5n g m lt g f 1 3 1 处理瑚细胞不同时间( o 、1 2 、2 4 及4 8 小时) ，w e s t e r nb l o t 及r e a l t i m ep c r 检钡g e - c a d h e r i n 、a - s m a 及f n 蛋白和 m r n a 的表达。 2 在h k c 细胞中瞬时转染全长k i n d l i n - 2 质粒和对, 照f l a g 载体4 8 d , 时，w e s t e r n b l o t 及r e a l t i m ep c r 检测e - e a d h e r i n 、a - s m a 及f n 蛋白和m r n a 的表达。 3 建立稳定表达硒n d l 珏2 和对照空载f l a g 的m 【c 细胞系，w e s t e r nb l o t 、 r e a l t i m ep c r 及免疫荧光检测两组细胞e - c a d h e r i n 、a - s m a 及f n 的蛋白和 m r n a 表达。 4 k i n d l i n - 2s i r n a 或c o n t r o ls i r n a 作用h k c 细胞2 4 d , 时后，再用t g f b 1 处理细 胞4 8 小时，w e s t e r nb l o t 及r e a l t i m ep c r 检测e - c a d h e r i n 、伍s m a 及f n 的蛋白 和m r n a 的表达。 结果 1 t g f 一1 3 1 以时间依赖的方式上调h k ca - s m a 蛋白俨4 5 4 6 ，p = 0 0 3 9 ) 及 m r n a 表达俨1 8 5 3 7 ，p = 0 0 0 1 ) ，增加f n 蛋白肝5 7 8 4 ，p = 0 0 1 5 ) 及 m r _ n a 表达( f - - 2 0 4 6 8 ，p = 0 0 0 2 ) ，而下调e c a d h e 】r i n 蛋白盱7 4 5 7 ，p = 0 0 11 ) 及m r n a 表达1 9 2 4 6 ，p = 0 0 0 1 ) 。 2 t g f 一8 1 以时间依赖的方式上调h l 细胞k i n d l i n - 2 蛋白4 2 7 5 ，p = 0 0 2 8 ) 和m r n a 1 6 9 0 9 ，p = 0 o o o ) 的表达，同时，t g f 一8 1 以剂量依赖的方式诱 l i l 中文摘要 导i - i k c 细胞i c l n d l i n - 2 蛋白( f - 4 7 3 2 ，p = 0 0 21 ) 和m r n a 俨5 8 4 3 ，p = 0 0 21 ) 的表达。 3 短暂过表达k i n d l i n - 24 8 d , 时后，与f l a g 组相比，转染f l a g - k i n d l i n 2 的h k c 细 胞中a s m a 蛋白( 一2 9 0 5 ，p = 0 0 4 4 ) 及m r n a 表达显著上调( t = - 4 0 6 9 ， p = 0 0 1 5 ) ，同样f n 的表达明显增加。而e - c a d h e r i n 蛋白( ，= 3 1 3 5 ，p = 0 0 3 5 ) 及m r n a ( ，= 4 5 4 6 ，p = 0 0 1 0 ) 表达显著下调。 4 稳定表达k i n d l i n - 2 后，h k c 的形态学发生改变，从原来的鹅卵石状变成长梭 形。稳定表达k i n d l i n - 2 后，h k c 细胞中c t - s m a 和f n 蛋白及m r n a 表达显著上 调，e c a d h e d n 蛋白和m r n a 表达显著下调。 5 k i n d l i n - 2s i r n a 作用于h k c 细胞后抑制t g f b 1 诱导的a - s m a 蛋白( 辟5 7 7 4 ， p - - - o 0 2 1 ) 和m r n a ( f = 1 6 6 6 3 ，p = 0 0 0 1 ) 表达，同样显著抑制f n 蛋白 俨1 8 0 4 6 ，p = 0 0 0 1 ) 和m r n a ( f = 1 9 0 3 5 ，p = o 0 0 0 ) 的表达。而k i n d l i n - 2 s i r n a 能恢复被t g f 3 1 抑制的e - c a d h e r i n 蛋白俨1 2 0 5 4 ，p = 0 0 0 2 ) 和 m r n a 俨7 2 1 8 ，p = 0 0 1 2 ) 的表达。 结论 1 t g f 一8 1 以剂量和时间依赖的方式上调h k c 细胞k i n d l i n - 2 的表达。 2 k i n d l i n - 2 可以诱导h k c 细胞的a - s m a 和f i b r o n e c t i n 表达，抑n e - c a d h e r i n 的表 达，促进h k c 细胞的e m t 。 3 t g f 8 1 诱导h k c 细胞的e m t 需要k i n d l i n - 2 的参与。 关键词k i n d l i n - 2 僻平滑肌肌动蛋白b 钙粘蛋白纤维连接蛋白转化生长因子1 上皮问 充质转化 i v 博士学位论文 第二章k i n d l i n 2 参与t g f - p l 信号通路的机制研究 目的 研究k i n d l i n - 2 与s m a d 3 及t g f 1 3 1 受体的关系，探索k i n d l i n - 2 在 t g f - i b l s m a d 3 信号通路中发挥的作用。 方法 1 常规培养h k c 细胞，实验分组为：转染空载f l a g 组、转染f l a g - k i n d l i n - 2 组、 转染空载f l a g 或k i n d l i n - 24 8 d 时后加t g f p l 处理3 0 分钟组，分别提取细胞总 蛋白，w e s t e r nb l o t 检测s m a d 3 的磷酸化。 2 实验分组为：转染c o n t r o ls i r n a 7 2 d x 时组、转染k i n d l i w 2s i m 叮a 7 2 小时组、 转染c 沁n t r o ls i r n a 或k i n d l i n - 2s i i m a 7 2 小时后加t g f - 1 3 1 处理3 0 分钟组，分 别提取细胞总蛋白和核蛋白，w e s t e r nb l o t 检测s m a d 3 的磷酸化。 3 实验分组为：共转染c o n t r o ls i r n a 及f l a g 空载7 2 小时组、共转染c o n t r o ls i r n a 及f l a g 空载7 2 d x 时后加t g f - b 1 处理3 0 分钟组、共转染k i n d l i n - 2s i r n a 及f l a g 空载7 2 小时后加t g f p 1 处理3 0 分钟组和共转染k i n d l i n - 2s i r n a 及抵抗 k i n d l i n - 2s i r n a 的质粒7 2 小时后t g f p l 处理3 0 分钟组，提取细胞总蛋白， w e s t e r nb l o t 检测s m a d 3 的磷酸化。 一 4 转染f l a g - k i n d l i n - 2 至h k c 细胞中，免疫共沉淀检测k i n d l i n - 2 与s m a d 3 的相互 作用。 5 转染f l a g - k i n d l i n - 2 - n 端或c 端至m 细胞中，g s t - p u l ld o w n 检测k i n d l i n - 2 与 s m a d 3 相互作用的区域定位 6 共转染f l a g - k i n d l i n - 2 及h a - t p 或f l a g - k i n d l i n - 2 及h a - t i b r i i 至h k c 细胞 中，免疫共沉淀检测k i n d l i n - 2 与t i b r i 和t 1 3 r i i 的相互作用。 7 共聚焦荧光显微镜观察k i n d l i n - 2 与s m a d 3 、t 1 r i 和t 3 r i i 的共定位。 8 免疫共沉淀检测敲低k i n d l i n - 2 后对s m a d 3 与t p m 的结合的影响。 v 中文摘要 结果 1 k i n d l i n - 2 干预h k c 细胞后，与对照组一样均不能引起s m a d 3 的磷酸化。在分 别转染f l a g 或f l a g - k i a d l i n - 24 8 d 时后再用t g f p 1 作用3 0 分钟后，与f l a g 组相 比，k i n d l i n - 2 明显增加s m a d 3 的磷酸化。 2 k i n d l i a - 2s i r n a 处理阳k c 细胞7 2 d , 时后再与t g f - i h 作用3 0 分钟，k i n d l i a - 2 s i r n a 明显抑制t g f p l 诱导的s m a d 3 的磷酸化及s m a d 3 的核转移。而抵抗 k i n d l i n - 2 s i r n a 的质粒有效恢复被k i n d l i n - 2 s 诹n a 抑制的t g f b l 诱导的 s m a d 3 的激活。 3 i - i k c 细胞中转染f l a g - k i n d l i n - 2 ，免疫共沉淀结果显示k i a d l i n - 2 与s m a d 3 有相 互作用。g s t - p u l ld o w n 结果显示，s m a d 3 的m i - 1 1 段与k i n d l i n - 2 的n 端有较强 的相互作用，未观察到s m a d 3 的m h l 段与k i n d l i n - 2 的c 端的相互作用，s m a d 3 的m h 2 段与k i n d l i n - 2 的n 端及c 端均没有相互作用。 4 在h k c 细胞中分别共转, 入f l a g - k i n d l i n - 2 和h a - t 1 3 r i 或f l a g - k i n d l i n - 2 和 i - i a - t p r n ，免疫共沉淀结果显示，k i a d l i n - 2 和t b 及t b r 均具有相互作用。 5 阳( c 中转染f l a g - k i n d l i n - 2 ，免疫共沉淀结果显示k i n d l i n - 2 与s m a d 3 及t g f - i b i 受体形成复合物。 6 共聚焦荧光显微镜观察结果证明k i n d l i n - 2 与s m a d 3 、t b m 及t p r u 具有共定 位。在正常状态下，定位区域主要分布在细胞膜上。在加2 x , t g f d l 刺激后， k i n d l i n - 2 与s m a d 3 在细胞核内具有共定位。 7 免疫共沉淀结果显示k i n d l i a - 2s i r r a 抑* l j s m d 3 与t p 础的结合，从而抑制 t g f p l 诱导的s m a d 3 的磷酸化。 结论 1 k i n d l i n - 2 不能激活s m a d 3 ，但是k i n d l i n - 2 与t g f p l 具有协同作用激活s m a d 3 。 2 t g f - 1 3 1 弓l 起s m a d 3 的磷酸化需要k i n d l i n - 2 的参与。 3 k i n d l i n - 2 分别与s m a d 3 、t p 砌及t p 砒i 相互作用并形成复合物，在分布上发生 共定位。 4 敲低k i a d l i n - 2 后抑制s m a d 3 与t g f p l r i 的结合。 关键词k i n d l i n - 2p - s m a d 3s m a d 3 转化生长因子- p l 转化生长因子b 1 受体 v i 博士学位论文 第三章k i n d l i n 2 在肾脏纤维化中发挥重要作用 目的 通过动物实验探讨k i n d l i n - 2 在肾脏纤维化中发挥的作用；检测患有慢性肾病 的临床病人肾脏组织中n d l i n 2 及p s m a d 3 的表达，探索k i n d l i n - 2 在慢性肾病中 的作用并观察k i n d l i n - 2 及p - s m a d 3 表达的相关性。 方法 1 i c r 小鼠随机分为：注射c o n t r o ls i r n a 假手术组( c o n t r o ls i r n a + s h a m 组) ， c o n t r o ls i r n a 单侧输尿管结扎( u u o ) 模型组( c o n t r o ls i r n a + u u o 组) 及 k i n d l i n - 2s i r n a 模型组( k i n d l i n - 2s i r n a + u u o ) 。采用单侧( 左) 输尿管结扎方 法，建立梗阻性肾小管间质纤维化小鼠模型，s h a m 组只游离输尿管而不结扎， 在术前一周和术后一周内通过尾静脉注射c o n t r o ls i r n a 或k i n d l i n - 2s i r n a 。 术后7 天处死动物，取出肾脏，分别用于免疫组织化学、w e s t e r nb l o t 和 r e a l t i m ep c r 。 2 运用h e 及m a s s o n 染色观察肾脏组织形态学改变及胶原纤维的沉积，采用免疫 组织化学法检测瞄n d l n 2 、p - s m a d 3 、小平滑肌肌动蛋白m s m a ) 及纤维连 接蛋白( f i b r o n e c t i n ) 表达的部位和变化。 3 w e s t e r n b l o t 检测瞄栅n 2 、p - s m a d 3 、s m a d 3 、a - s m a 及f i b r o n e c t i n 的蛋白表 达。r e a l t i m ep c r 检测k i n d l i n - 2 、a s m a 及f i b r o n e c t i n 的m r n a 表达。 4 利用免疫组织化学方法检测病人标本q a k i n d l i n - 2 及p - s m a d 3 的表达。 结果 1 h e 染色显示：与假手术组比较，u u o 模型组小鼠肾组织出现不同程度的肾 小管扩张或部分肾小管萎缩、间质面积增宽、间质炎症细胞浸润。而k i n d l i n - 2 s i r n a + u u o 组，肾脏纤维化症状明显改善。 2 m a s s o n 染色结果显示：与假手术组比较，u u o 模型组小鼠肾组织胶原在肾小 球及间质区显著增多。而在k i n d l i n - 2s i r n a + u u o 组，胶原沉积症状明显减 少。 v 中文摘要 3 免疫组化结果表明：k i n d l i n - 2 主要分布在肾小管细胞胞质中，细胞核中也有 表达，p - s m a d 3 只分布在细胞核中，a - s m a 及f i b r o n e c t i n 只分布在小管间质中。 与假手术组比较，u u o 模型组小鼠肾组织k i n d l i n - 2 、p - s m a d 3 、a s m a 及 f i b r o n e c t i n 表达显著增加。而k i n d l i n - 2s i r n a + u u o 组，这些蛋白表达均明显 减少。 4 w e s t e r nb l o t 结果证明：与假手术组相比，u u o 模型组小鼠肾组织k i n d l i n - 2 、 p - s m a d 3 、a - s m a 及f i b r o n e c t i n 的蛋白表达显著增加，而k i n d l i n - 2s i r n a + u u o ， 组，k i n d l i n - 2 俨1 8 5 4 0 ，p = o 0 0 3 ) 、p - s m a d 3 ( f = 1 4 7 3 5 ，p = o 0 0 5 ) 、a - s m a ( f = 2 7 9 2 8 ，p = o 0 01 ) 及f i b r o n e c t i n 盱5 6 2 0 0 ，p = o 0 0 0 ) 蛋白表达均明显减 少。 。 5 r e a l t i m ep c r 结果发现：与假手术组比较，u u o 模型组小鼠肾组织k i n d l i n - 2 、 a - s m a 及f i b r o n e c t i nm r n a 表达显著增加，而k i n d l i n - 2s i r n a + u u o 组， k i n d l i n - 2 ( f _ 9 9 1 3 ，p = o 0 1 3 ) 、a - s m a ( f = 8 1 7 5 ，p = o 0 1 9 ) 及f i b r o n e c t i n ( 肛8 0 3 9 6 ，p = o 0 0 0 ) 训脸i a 表达均明显减少。 6 病人标本免疫组织化学显示：与正常肾脏相比，患有肾脏纤维化的病人的肾 组织中k i n d l i n - 2 及p - s m a d 3 显著增加，并且两者具有正相关。 结论 1 在小鼠单侧输尿管结扎模型中，k i n d l i n - 2 、p s m a d 3 、a - s m a 和f i b r o n e c t i n ；及 表达显著上调。 2 敲低k i n d l i n - 2 有效减轻单侧输尿管结扎小鼠的肾脏纤维化。 3 k i n d l i n - 2 在肾脏纤维化病人的活检组织中高表达，其增加与p - s m a d 3 的表达 具有正相关。 关键词k i n d l i n - 2 单侧输尿管结扎肾间质纤维化 i i 博士学位论文 k i n d l i n - - 2p r o m o t e sr e n a lf i b r o s i st h r o u g h f a c i l i t a t i n gt g f - p s m a ds i g n a l i n g p h d c a n d i d a t e ：x i a o f a nw e i s u p e r v i s o r s ：p r o f e s s o rf a n f a nh o u p r o f e s s o rh o n g q u a nz h a n g a b s t r a c t b a c k g r o u n d c h o m ck i d n e yd i s e a s e ( c k d ) h a sb e c o m eo n eo ft h em a j o rd i s e a s e sw h i c h t h r e a t e nw o r l d w i d ep u b l i ch e a l t ha n db r o u g h ta b o u t 伽l o r l l l o u ss u f f e r i n ga n d e c o n o m i cb l l r d e nt ot h ep a t i e n t s 。t h ep r e v a l e n c eo fc h r o n i ck i d n e yd i s e a s eh a s r e a c h e de p i d e m i cp r o p o r t i o n sw i t h1 0 - 1 3 o f t h ep o p u l a t i o n si nt a i w a n , h a l l ，j a p a n , c h i n a , c a n a d a , i n d i aa n dt h eu s a m o r n t h a n10 0m i l l i o np e o p l ea r o u n dt h ew o r l d r e l yo nd i a l y s i st os u l v i v e ，a n dt h er a t i oi n c r e a s e sa ta na v e r a g ea n n u a lg r o w t hr a t eo f 8 m o r ea n dm o r ey o u n gm e ns u f f e rf r o mc k d ，e v e nt h ey o u n g e s to n ei sl e s st h a n 10y e a r so fa g e ，h o ws h o c k i n g ! t h e r ei sn ot i m et od e l a yi nr e d u c i n gd a m a g et o k i d n e ya n dp r o t e c t i n gk i d n e yf r o ma l lk i n d so fk i d n e yd i s e a s e r e n a lf b r o s i si si n e v i t a b l eo u t c o m eo f av a r i e t yo f p r o g r e s s i v ek i d n e yd i s e a s e s m u l t i p l ec e l l u l a re v e n t sa n dm o l e c u l a rm e d i a t o r sp a r t i c i p a t ea n di n t e r a c ti nc o n c e r t i n r e n a lf i b r o g e n e s i s a m o n gt h em a n yf i b r o g e n i cf a c t o r st h a tr e g u l a t er e n a lf i b r o t i c p r o c e s s ，t g f ph a sl o n gb e e nc o n s i d e r e da s ac e n t r a lm e d i a t o ro ft h ef i b r o t i c r e s p o n s e t g f - pe x e r t si t sb i o l o g i c a lf u n c t i o n sm a i n l yt h r o u g hi t s d o w n s t r e a m s m a d ss i g n a l l i n gm o l e c u l e s t h et g f p s m a d 3s i g n a li st r a n s d u c e dt h r o u g hi t sc e l l m e m b r a n et y p eia n dt y p ei is e r i n e t h r e o n i n ek i n a s er e c e p t o r s t g f p 1b i n d st oi t s t y p ei ir e c e p t o r , t h ec o m p l e xt h e nf o r m sad i m m e rw i t ht h et y p eir e c e p t o r , r e s u l t i n g a b s t r a c t i nt h ep h o s p h o r y l a t i o na n da c t i v a t i o no ft h et y p eir e c e p t o r t h ea c t i v a t e dt y p ei r e c e p t o rp h o s p h o r y l a t e ss m a d 2a n d o r3 ，w h i c ht h e nh e t e r o d i m e r i z e s 谢t l ls m a d 4a n d s u b s e q u e n t l y t r a n s l o c a t ei n t o t h en u c l e i , w h e r et h e yr e a tt h et r a n s c r i p t i o no f t g f - d - t a r g e tg e n e s s o m ea d a p t o rp r o t e i n si n c l u d i n gs 撇d i s a b l e d - 2e l f s p e c t r m , e n d o f i na n ds oo i lh a v eb e e nr e p o r t e dt of a c i l i t a t et g f ps i g n a l i n gb y l i n k i n gs m a d 2 s m a d 3t ot h er e c e p t o rc o m p l e x t u b u l o i n t e r s t i t i a lf i b r o s i si sc h a r a c t e r i z e d b ye x c e s s a c c u m u l a t i o no f e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( e c m ) i nt h er e n a li n t e r s t i t i u m t h em a j o rs o u i c 圮o fe x c e s s i v e e c mp r o d u c t i o ni nc k da p p e a r st ob et h ei n t e r s t i t i a l m y o f i b r o b l a s to v w b ) e p i t h e l i a l m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ( e m t ) i sc o n s i d e r e da so n ei m p o r t a n ts o u 玎eo f m f b e p i t h e l i a l - t o - m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n i sab i o l o g i c p r o c e s st h a ta l l o w sa p o l a r i z e de p i t h e l i a lc e l lt ou n d e r g om u l t i p l eb i o c h e m i c a lc h a n g e st h a te n a b l ei tt o a 髂u m eam e s e n c h y m a lc e l lp h c n o t y p c ag r o w i n gn u m b e ro fr e s e a r c h e ss t r o n g l y c o n f i r m e dt h ei m p o r t a n tr o l eo fe m ti nd i f f e r e n tt y p e so fk i d n e yd i s e a s ea n dt h e r e v e r s a lo fe m tc o u l di m p r o v er e n a lf i b r o s i s a l t h o u g hn u m e r o u ss t u d i e sh a v e r e v e a l e dav a r i e t yo fi n i t i a lf a c t o r s ，k e ym e d i a t o r sa n ds i g n a l i n gp a t h w a y so fe m t , t g f - b1a p p e a r st ob et h em o s tp o t e n ti n d u c e ro fs u c hc h a n g e s ，a n di sa b l et ob o t l i i n i t i a t ea n dc o m p l e t et h i s p r o c e s s t g f p l - i n d u c e de m tm a i n l yr e l i e so nt h e i n t e g r i t yo fi t ss m a d ss i g n a l i n gp a t h w a y k i n d l i n - 2i so n et y p eo fk i n d l i np r o t e i nf a m i l y ，w h i c hi sn o v e la d a p t o rp r o t e i n s ， r e g u l a t i n gt h ea c t i v a t i o no fi n t e g r i n a tt h em o l e c u l a rl e v e l ，c e l i - e c ma d h e s i o ni s m e d i a t e d p r i m e l yb yi n t e g r i n s k i n d l i n - 2 - i n t e g r i n i n t e r a c t i o ne n h a n c e s t a l i n - m e d i a t e di n t e g r i na c t i v a t i o na n dk i n d l i n - 2i sa l s or e x l u i r e df o ra c t i np o l a r i z a t i o n , c e l l ss p r e a d i n g ，a n di l kl o c a l i z a t i o ni n t of a s t w og r o u p si n d e p e n d e n t l yg e n e r a t e d 煳l i n - 2 - d e f i c i e n tm i c ea n di nb o t ho a s e st h ek n o c k o u ta n i m a l sd i e da to rb e f o r e e m b r y o n i ca g e7 5d a y sd u et os e v e r ed e t a c h m e n to ft h ee p i b l a s ta n de n d o d e r m 博士学位论文 r e s u l t i n gi np e d - i m p l a n t a t i o nl e t h a l i t y w ec a nu n d e r s t a n dt h es i g n i f i c a n c eo f k i n d l i n - 2i nc e l l - e c ma d h e s i o na n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a tp r e s e n t , t h e r ei sr a r er e p o r ta b o u tt h er o l eo fk i n d l i n 0 2i nk i d n e y o n l yo n e r e s e a r c hp r o v e dt h a tk i n d l i n - 2r e g u l a t e dp o d o c y t ea d h e s i o na n df i b r o n e c t i nm a t r i x d e p o s i t i o nt h r o u g hi n t e r a c t i o n sw i t hp h o s p h o i n o s i t i d e sa n dt g f - pm a r k l yi n c r e a s e d k i n d l i n - 2e x p r e s s i o n o u rg r o u ph a sp r e v i o u s l yd e m o n s t r a t e dt h a tk i n d l i n - 2c o u l d p r o m o t eb r e a s tc a n c e l m e t a s t a s i sb yi n d u c i n gt h ee m t o fb r e a s tt u m o rc e l l s w e d r a wah y p o t h e s i st h a tk i n d l i n - 2c o u l dp r o m o t er e n a lf i b r o s i sb yi n d u c i n gt h ee m t o f r o m lt u b u l a re p i t h e l i a lc e l l s i f t m e ，w h a ti st h em o l e c u l a rm e c h a n i s m ? w eu t i l i z e t h em o d a lo f h u m a nr e n a lt u b u l a re p i t h e l i a lc e l l si nv i t r o ，m i c eu n i l a t e r a lu r e t e r a l o b s t r u c t i o n ( u u o ) m o d a li nv i v o ，c o m b i n e dw i t hc l i n i c a ls p e c i m e n so fp a t i e n t sw i t h c l t od e t e r m i n et h er o l eo fk i n d l i n - 2i nr e n a lf i b r o s i s ，a n dd i s c u s st h ed e t a i l e da n d i n n o v a t i v em o l e c u l a rm e c h a n i s m s c h a p t e ri k i n d l i n - 2i sr e q u i r e df o rt g f - - p l - i n d u e e de m ti nh u m a n k i d n e y t u b u l a re p i t h e l i a lc e l l s o b j e c t i v e t oi n v e s t i g a t et h er o l eo fk i n d l i n - 2i ne m to fh k c ，o b s e r v et h ee f f e c to f t g f b 1o nk i n d l i n - 2e x p r e s s i o ni nh k c sa n dt oe x p l o r et h er o l eo fk i n d l i n - 2i n t g f 一8 1 一i n d u c e de m t o f h k c s m e t h o d s 1 h k c sw e r et r e a t