MMP2敏感型聚乙二醇水凝胶联合去细胞瓣制备复合支架的实验研究优秀毕业论文.pdf

华中科技大学 硕士学位论文 mmp-2敏感型聚乙二醇水凝胶联合去细胞瓣制备复合支架的实验 研究 姓名：陈义初 申请学位级别：硕士 专业：外科学（心血管外科） 指导教师：董念国;史嘉玮 2011-05 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 mmp-2 敏感型聚乙二醇水凝胶联合去细胞瓣敏感型聚乙二醇水凝胶联合去细胞瓣 制备复合支架的实验研究制备复合支架的实验研究 研究生：陈义初 导 师：董念国 中文摘要中文摘要 第一部分：基质金属蛋白酶底物肽的合成和检测第一部分：基质金属蛋白酶底物肽的合成和检测 目的：目的： 分别制备对基质金属蛋白酶-2（mmp-2）高度敏感的 mmp(w)x 肽和对 mmp-2 不敏感的 mmp(df) x肽，进行相关检测。 方法：方法： 采用 fmoc 固相合成法制备 mmp(w)x 肽和 mmp(df) x肽， mmp(w)x 肽 的氨基酸序列为 ac-crd-gpqgiwgq-drc-nh2，mmp(df) x肽的氨基酸序 列为 ac-crd-gdqgiagf-drc-nh2。采用高效液相色谱法和质谱进行鉴定。 结果：结果： mmp(w)x肽高效液相色谱分析其纯度为 99.06%，质谱检测分子量为 1632.79/摩尔；mmp(df)x肽高效液相色谱分析其纯度为 99.29%，质谱检测分子 量为 1553.69/摩尔。 结论：结论：mmps 底物肽能够体外合成并用于组织工程研究。 第二部分：基质金属蛋白酶底物肽聚乙二醇复合第二部分：基质金属蛋白酶底物肽聚乙二醇复合 水凝胶的制备及性质研究水凝胶的制备及性质研究 目的：目的： 采用分子量20,000da 丙烯酰化四分枝状聚乙二醇（4-arm-peg-ac）和基 质金属蛋白酶底物肽制备可降解复合水凝胶，并检测其性能。 方法：方法： 利用已制备的基质金属蛋白酶底物肽，联合丙烯酰化四分枝状聚乙二醇 制备浓度为10(w/v)的复合水凝胶。 mmp(w)x 肽复合 peg 水凝胶为实验 a 组， 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 mmp(df) x肽复合 peg 水凝胶为实验 b 组，对照 c 组为单纯 peg 水凝胶。比 较三种水凝胶在37磷酸盐缓冲液中的降解情况，再外源性添加 mmp-2，观察 三种水凝胶降解情况。检测三组水凝胶的细胞毒性。在制胶过程中包埋转化生长 因子（tgf-1） ，检测各组水凝胶对 tgf-1的缓释效果。 结果：结果： 磷酸盐缓冲液中 a、b、c 三组水凝胶4周累计降解率分别为68.36%、 64.23%、66.28%，三者差异无统计学意义（p0.05） ；分别添加 mmp-2，a 组4 周累计降解率为83.75，降解速度加快，b、c 组则变化不明显。mtt 法检测 复合 peg 水凝胶无细胞毒性。a、b、c 三组水凝胶 tgf-17天累计释放率分别 为59.63、 53.18%、 44.36%， 三者差异无统计学意义 （p0.05） ； 分别添加 mmp-2 后，a 组对 tgf-1 释放速度明显加快。 结论：结论： mmps 底物肽 peg 复合水凝胶结构稳定、 对细胞无毒性。 其中对 mmp-2 敏感型复合 peg 水凝胶对生长因子 tgf-1有良好的控释效果，有望应用于新 型组织工程心脏瓣膜支架材料的研制。 第三部分：第三部分： mmp-2 敏感型聚乙二醇水凝胶联合敏感型聚乙二醇水凝胶联合 去细胞瓣制备复合支架去细胞瓣制备复合支架 目的目的: 制备对 mmp-2敏感型聚乙二醇水凝胶去细胞瓣复合支架， 并检测其相关 生物学性能。 方法：方法：采用酶+去污剂法制备去细胞瓣。在 mmp-2敏感型聚乙二醇水凝胶成胶 过程中，利用化学交联剂碳化二亚胺（edc）将复合水凝胶与去细胞瓣充分耦 联，制备复合支架。进行 he 染色和电镜扫描观察与 dna 含量、羟脯氨酸含 量以及瓣叶生物力学检测。 结果结果: 形态学观察见复合支架细胞外基质紧密，胶原纤维结构整齐、紧凑。与 单纯去细胞瓣相比较，复合支架的 dna 含量、羟脯氨酸含量差异无统计学意 义（p0.05） ，但瓣叶生物力学性能提高。 结论结论: mmp-2 敏感型聚乙二醇水凝胶联合去细胞瓣制备的复合支架， 保持去细胞 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 瓣基本特征的同时有助提高生物力学性能，有利于组织工程心脏瓣膜的构建。 关键词：关键词： 基质金属蛋白酶， 酶降解， 四分枝状聚乙二醇， 水凝胶， 去细胞瓣膜， 复合支架， 组织工程心脏瓣膜， 力学性能 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 application of decellularized valves modified by matrix metalloproteinase-2 degradable poly-ethylene glycol hydrogel in tissue engineering heart valve candidate: chen yichu supervisor: prof dong nianguo abstract part one: synthesis and identification of substrate peptides of matrix metalloproteinase objective: to synthesize and test two substrate peptides of matrix metalloproteinase (mmp). methods ： the mmp(w)x peptide with the sequence of ac-crd-gpqg iwgq-drc-nh2 was highly sensitive to mmp-2. the mmp(df) x peptide with the sequence of ac-crd-gdqgiagf-drc-nh2。ac-crd-gpqgiwgq-drc-nh2 was insensitive to mmp-2. they were synthesized with the method of fmoc solid phase and identified by the method of mass spectrum (ms) and high performance liquid chromatography (hplc). results: analyzed by hplc and ms，the purity of two peptides was at 99.06% and 99.29% respectively. and the molecular weights of them were at 1632.79/mol and 1553.69/mol respectively. conclusion: the substrate peptides of mmp could be synthesized in vitro for tissue engineering. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 7 part two: preparation compound hydrogel of polyethylene glycol with matrix metalloproteinase substrate peptide objective: to construct a biodegradable compound hydrogel by four-armed polyethylene glycols (peg) with the molecular weight of 20000 and matrix metalloproteinases (mmp) -2 substrate peptide. methods: the experiments were randomly designed into three groups: mmp-2 sensitive compound peg hydrogel, mmp-2 insensitive compound peg hydrogel and simple peg hydrogel. and the compound hydrogels were prepared by michael addition reaction. th observation of degradation in different mediums and test of the cell toxicity were done. transforming growth factor (tgf) -1 was embedded into hydrogel during production process and its release rate was calculated. results: compound hydrogel had excellent stability. the degradation rates of group a and b in phosphate buffer solution for four weeks were 68.36% and 64.23% respectively. there were no significantly difference between the two group and the control group (p0.05). by adding mmp-2, the enzymatic degradation rate of group a reached 83.75%, but group b and c did not change significantly. no cell toxicity of compound hydrogel was detected by mtt test. tgf-1 accumulative release rate for 7 days was 59.63, 53.18% and 44.36% respectively(p0.05). but by the addition of mmp-2, tgf-1 release rate of group a became obviously faster. conclusions: the mmp-2 enzymatically degradable peg hydrogel had structure stability and no cell toxicity, and could effectively control the release of tgf-1. it is a potential material to fabricate a new hybrid scaffold for tissue engineering heart valves. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 8 part three：construction of a hybrid scaffold by decellularized valves and enzymatically degradable polyethylene glycol hydrogel objective: to construct a hybrid scaffold with matrix metalloproteinases-2 (mmp-2) enzymatically degradable peg hydrogel and decellularized valves. and to measure the biological characteristics of the scaffold in tissue engineering heart valve. methods: decellularized valves were prepared by trypsinase and tritonx-100. decellularized valves scaffolds were modified by mmp-2 sensitive peg hydrogel with the help of a coupling reagent, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodimide (edc) during the process of gelling. hematoxylin-eosin staining and scanning electronic microscopy were performed. and the hydroxyproline content, cell dna assay and biological mechanic properties of leaflets were measured. results: compared with the simple decelluarized valve scaffolds, the hybrid scaffolds were more compact in structures of extracellular matrix and perferable in the biological mechanics characteristics. and no significant changes were between them in dna assay and hydroxyproline content. conclusions: this kind of hybrid scaffolds had proper manifestation in the biological mechanic characteristics compared to the simple decelluarized valves. it is beneficial to the study of tissue engineering. keyword matrix metalloproteinases, enzymatic degradation, 4-arm polyethylene glycol, hydrogel, decellularized valve, hybrid scaffold, mechanical characteristic 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 英汉缩略词表英汉缩略词表 英文缩写英文缩写 英文全称英文全称 中文全称中文全称 4-arm peg 4-arm polyethylene glycol 四分枝聚乙二醇 peg-ac polyethylene glycol-acrylate 丙烯酰化的聚乙二醇 - sma alpha-smooth muscle actin -平滑肌肌动蛋白 aps ammonium persulfate 过硫酸氨 dmso dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 dmem dulbeccos modified eagles medium dulbeccos 改良 eagle 培养基 dnase deoxyribonuclease 脱氧核糖核酸酶 ecm extracellular matrix 细胞外基质 edc carbodiimide 碳化二亚胺 edta ethylenediamine tetraacetic 乙二胺四乙酸 fn fibronectin 纤维连接蛋白 fcs fetal calf serum 胎牛血清 he hematoxylin-eosin 苏木精-伊红染色 hplc high performance liquid chromatography 高效液相色谱分析 ln laminin 层粘蛋白 mfb myofibroblast 肌成纤维细胞 mrna messenge ribonucleic acid 信使核糖核酸 mmp matrix metalloproteinases 基质金属蛋白酶 ms mass spectrum 质谱分析 pbs phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲溶液 peg polyethylene glycol 聚乙二醇 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 pla polylactic acid 聚乳酸 pga polyglycolic 聚乙醇酸 plga poly- (lactic-co-glycolic acid) 聚乳酸乙醇酸共聚物 phb polyhydroxybutgrate 聚羟基丁酸酯 pha polyhydroxyalkanoate acid 聚羟基烷酯 rnase ribonuclease 核糖核酸酶 tgf-1 transforming growth factor-1 转化生长因子-1 tehv tissue engineering heart valve 组织工程心脏瓣膜 timp tissue inhibitor of metallo- proteinase 基质金属蛋白酶组织抑制物 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 9 前前 言言 心脏瓣膜疾病严重威胁人类健康， 瓣膜置换是治疗心脏瓣膜疾病的主要手段 1-2，全世界每年约有20余万患者行瓣膜置换手术。目前临床上常用的瓣膜替代物 主要为生物瓣和机械瓣，两者各有优缺点，机械瓣具有良好的耐久性，但需要终 身抗凝治疗，有出血、栓塞风险；生物瓣存在钙化、退行性变，使用寿命有限， 15-20年需再次手术3-5。临床和科研工作者一直致力于寻找理想的瓣膜替代物， harken等6曾提出理想瓣膜替代物应该具备无炎性反应、无免疫反应、功能良好、 终身受用、可生长、可按需定做以及无需抗凝等条件。组织工程是将生命科学原 理与工程学相结合， 目的在于研发一种具有修复和改善受损组织功能的生物替代 品，有望能解决目前临床瓣膜替代物的缺陷。 组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve，tehv)是按照组织工程学 方法，将自体的种子细胞（seed cell）种植于可降解的支架材料上，并在体外培 养后植入体内， 随着种子细胞的不断增殖、 细胞外基质 （extracellular matrix， ecm） 的分泌、支架材料的逐渐降解和被替代，最终形成具有正常结构和功能的心脏瓣 膜7-10。理想的tehv具有自我重构和生长的特点，可以克服机械瓣膜和生物瓣膜 不足， 其临床应用具有广阔前景11-12。 由于心脏瓣膜在人体中所处部位和功能的 特殊性，要求tehv具有较高的生物学性能。尽管国内外关于tehv的研究已取 得一定成果，但距离应用于人体的理想的tehv相差甚远。 tehv主要包括支架材料、种子细胞以及两者间相互作用三个方面13。三者 的有机结合和良好的相互作用是构建理想tehv的关键，其中首要基本要素是支 架的选择和构建14。异种瓣经去细胞处理后，虽然保留以胶原纤维为主的三维结 构，为细胞生长、迁移提供了良好微环境，但研究表明15：瓣膜胶原交联减少， 力学性能下降，可溶性基质成分(如可溶性胶原、葡胺聚糖)丢失，生物信号可激 活位点减少，影响种子细胞的增殖和分化。而某些人工高分子材料在组织重构和 细胞黏附方面也不理想，存在炎性细胞浸润及合成材料降解不彻底。 高分子材 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 料聚乙二醇（polyethylene glycol, peg）因具有高度亲水性、生物相容性好和自 身免疫原性低等优点，在组织工程领域应用广泛16-19。新一代分枝状peg，末端 可引入氨基、羧基等官能团或交联进行化学修饰，提高多肽、蛋白等的稳定性且 降低免疫源性。特别是近年来“复合支架”概念的提出，为理想的tehv支架材 料研制带来新的希望。 “智能化支架”已成为组织工程研究热点，温度、ph值、应力及酶敏感型 支架备受推崇。其中酶敏感型支架，如新型复合 peg水凝胶（hydrogel），利用 种子细胞自身分泌蛋白酶（尤其mmps）的行为，促进支架携带的活性分子的释 放，进而调控组织培养微环境，具备生物智能特征，适合tehv的构建20。分枝 状peg其末端官能团能与多肽的巯基在一定条件下发生化学反应， 形成连续的网 状结构。 这种结构有利于包埋活性分子， 还可随着水凝胶降解逐步释放活性分子； 用于交联的多肽中还可嵌入酶解反应位点，通过活细胞分泌mmp-2降解多肽位 点等效应，促使活性分子释放，有利种子细胞在支架的生长、粘附。 本实验研究受国家自然科学基金项目-“智能化天然支架调控组织工程心脏 瓣膜生长微环境（no. 30600608） ”和 863 项目-“peg 交联去细胞瓣多信号复合 材料的研制（no. 2009aa03z420） ”资助。我们利用四分枝丙烯酰化 peg （4-arm-peg-ac）和 mmps 底物肽成功制备 mmp-2 酶敏感型复合水凝胶，包埋 活性分子转化生长因子（transforming gowth factor, tgf）缓释性能良好,与去 细胞瓣结合改善了支架生物力学性能，为进一步 tehv 的构建提供了理论和实 验依据。 本课题设计主要分为三部分：1）mmps 底物肽的制备和检测；2）mmps 底物肽聚乙二醇复合水凝胶的制备及性质研究；3）mmp-2 敏感型聚乙二醇水凝 胶联合去细胞瓣制备复合支架。 参考文献参考文献 1. nkomo vt, gardin jm, skelton tn, et al. burden of valvular heart disease: a population-based study. lancet, 2006, 369: 1005-11. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 11 2. billiar kj, sacks ms, et al. biaxial mechanical properties of the natural and glutaraldehyde treated aortic valve cusp-part : experimental results. j biomech eng, 2000, 122:23-30. 3. schoen fj, levy rj, et al. tissue engineering heart valves: current challges and future research perspectives. j biomed mater res, 1999, 47: 439-65. 4. khan ss, trento a, derobertis m, et al. twenty-year comparison of tissue and 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mmps 底物肽的酶解反应位点。 1.2 多肽鉴定多肽鉴定 利用吉尔生化(上海)有限公司的 lcms-2010 型液相色谱质谱联用仪 (shimadzu 公 司 ) 进 行 检 测 。 高 效 液 相 色 谱 法 (high performance liquide chromatography, hplc)纯化并分析肽的纯度，质谱分析(massspectrum，ms)以 确定分子量。 2. 结果结果 2.1 多肽性状多肽性状 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 肉眼观察，两种肽均呈白色冻干粉状。20密闭干燥保存，易溶于双蒸水 和 pbs。 2.2 多肽鉴定多肽鉴定 mmp(w)x 肽高效液相色谱分析其纯度为 99.06%(95%)，主峰保留时间 11.953min， 峰高618153.125mv； 质谱检测分子量1632.79/mol （如图1.1） ； mmp(df) x肽高效液相色谱分析其纯度为 99.29%(95%)，主峰保留时间 12.483min，峰高 181852.859mv，质谱检测分子量 1553.69/mol（如图 1.2） 。 3. 讨论讨论 多肽是多种氨基酸残基按一定顺序排列，通过肽键结合的化合物。多肽与体 内大多数细胞和组织的生物学功能有关，近年人工多肽应用广泛，主要用作重要 的生物活性分子及药物，具有良好应用前景 4-6。合成的 mmps 底物系列多肽在 机体内具有生物学效应，目前主要用于肿瘤治疗、抗血栓、组织修复等领域 7。 mmps 是一大类降解 ecm 成分蛋白酶，受基因转录、酶原激活和基质金属 蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitiors of metalloproteinases, timps）等水平调控， 正常组织含量较低 8。组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve, tehv） 培养初期，种子细胞生长活跃，可使 mmps 基因表达及酶活性上调。mmps 包 括胶原酶（如 mmp-1、-8、-13）和明胶酶（如 mmp-2、-9），主要降解 i、iii 型胶原和弹性蛋白，基质溶素（如 mmp-3、-10）主要降解 fn、ln 等。mmps 在调节 ecm 代谢同时参与细胞黏附、迁移、增殖和组织形态的形成。实验显示 肌成纤维细胞种植去细胞瓣后，mmp-2、-8、-13 和 timp-1mrna 等均阳性表 达。有研究证实 9，mmp-2、-9 等能酶解潜伏相关肽（latency-associated peptide, lap）所掩盖转化生长因子（transforming growth factor, tgf）-1的活化位点， 而人工合成的 mmps 底物系列多肽可模拟 lap 作用，其中 mmp(w)x ac-gcrd-gpqgiwgq-drcg对 mmp-2 高度敏感，mmps 酶解效应可促使 tgf-1激活、释放。 目前研究的 mmps 底物肽有多种，其核心主要在于肽的酶解反应位点，再 在其前后端添加其它氨基酸残基，进行空间构像改造。mmp(w)x 肽氨基酸序列 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 为 ac-crd-gpqg iwgq-drc-nh2（半-精-天-甘-脯-谷-甘-异-色-甘-谷-天-精- 半） ， 其核心部分为中间的 8 个氨基酸组成的序列， 指示出酶解反应位点， mmp-2 可以水解该多肽序列中甘氨酸和异亮氨酸连接部分， 同时两端添加的氨基酸残基 中含有半胱氨酸（cys） ，其侧链上含有的硫元素活性很高，可引入其它官能团或 交联进行化学修饰，提高多肽、蛋白等的稳定性且降低免疫源性。dreher 等 10 将连接 mmps 底物肽和甲氨蝶呤的水凝胶制成纳米粒（20-50nm） ，利用肿瘤细 胞高表达 mmp-2、-9 特性实现定位释药。lutolf 等 11 利用分枝状 peg 连接一端 含巯基的 rgdsp 肽，两端含巯基的 mmps 底物肽（如 mmp(w)x），再诱陷生 长因子如( 血管内皮生长因子 vegf、骨形成蛋白 bmp-2)，制备智能化 peg 水 凝胶，实验表明血管内皮细胞、成骨细胞黏附性提高，而且种子细胞周围 mmps 酶解效应释放 vegf、bmp-2，成功诱导毛细血管、骨的生成。 本实验采用固相合成法制肽，该方法由美国科学家 merrifield 发明，现已成 为多肽及蛋白质合成最常用的技术 12。 该方法对于微量有机物的纯化与组分鉴定 有较高要求， 通过此方法制备的mmp(w)x 肽和mmp(df) x肽， 经外观和hplc、 ms 分析，结果达到实验要求，为下一步制备多肽复合水凝胶的奠定了基础。 参考文献参考文献 1. mott jd, werb z, et al,et al. regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. curr opini cell biol, 2004, 16: 558-64. 2. fields gb, noble rl, et al. solid phase peptide synthesis utilizing 9- fluorenylmethoxy carbonyl amino acids. int j peptide protein res, 1990, 35: 161-214. 3. liu z, hu bh, et al. convenient synthesis of acetonide protected 3,4-dihydroxypheny lalanine (dopa) for fmoc solid-phase peptide synthesis. tetrahedron lett, 2008, 49: 5519-521. 4. lutolf mp, hubbell ja, et al. synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. nat biotechnol, 2005, 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 23: 47-55. 5. mott jd, werb z, et al. regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. curr opini cell biol, 2004, 16: 558-64. 6. shi jw, dong ng, sun zq, et al. immobilization of decellularized valve scaffolds with arg-gly-asp-containing peptide to promote 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