（遗传学专业论文）不同基因型栝楼的rapd标记及其细胞遗传学研究.pdf

摘要 本试验以来自不阈生态区的9 个栝楼栽培种和9 个野生种为材料，同时在分子水 平和细胞水平上对其进行遗传差异的研究，旨在建立一套快速、灵敏、准确的种质鉴 定技术体系，促进栝楼市场的健康发展，实现栝楼资源的可持续翻用。主要的研究结 果如下： 1 试验采用改良的s d s 法提取的槠楼种子总基函组d n a ，完全可以用予r a p d 分析。该提取方法具有简便、经济、快速等优点。 2 r a p d 技术具有弓| 物没有严格的种属限制、多态 生强及检测灵敏等特点，但是 该技术的稳定性和重复性较差，因此，有必要寻找一个适合本试验的r a p d 反应体 系，提高其稳定性和可重复性。本试验测试了模板d n a 浓度、d n t p s 浓度、t a q 酶 浓度、随机引物浓度、m 矿浓度以及变性时间、退火温度和时间、延伸时间、循环次 数等对r a p d 反应结果的影响。结果表明：l x p c r b u f f e r 、1 5 m m o l l m g c l 2 、0 。2 m m o l l d n t p s 、0 41 tm o l l 引物、7 5 n g 模板d n a 及l u 的t a q d n a 聚合酶为最佳反应用量； 9 4 预变性5 m i n 、9 4 变性3 0 s 、3 8 退火8 0 s 、7 2 延伸1 2 0 s 、7 2 延伸1 0 m i n 、 扩增碡o 个循环为最佳反应程净。 3 利用筛选到的3 0 个引物对1 8 种材料进行r a p d 分析，共产生2 5 9 条带，其中 多态性带2 4 1 条占9 3 。l 。随机引物$ 4 6 0 和s l l l 4 扩增鹚的条带最多为1 3 个，扩增 出的条带数最少的是引物$ 4 9 7 和$ 2 0 3 2 ，只产生4 条带。扩增片段长度大多集中在 1 0 0 - - 2 0 0 0 b p 之间。根据u p g m a 方法构建聚类树状图，将1 8 个栝楼品种聚成七类。 4 r a p d 分析能检测出大量变异，通过沈较备品种闯的特异带或特征带的差异， 可进行品种鉴别和纯度鉴定。如，长兴吊瓜在引物$ 3 8 5 扩增时产生的$ 3 8 5 - - 7 2 0 b p 特异谱带，遥川峨嵋在s 1 1 3 4 扩增时产生的s 1 1 3 4 - - 3 0 0 b p 带型缺失，山东小片在孳 物s 1 1 3 7 扩增时产生s 1 1 3 7 b p 。3 0 0 b p 带型缺失和在引物$ 4 6 0 扩增时产生的$ 4 6 0 - - 2 0 0 b p 特异谱带等等，利用这些特征带可进行栝楼晶种的早期鉴定。 5 细胞学标记研究采用了稍加改进的f b s g 法获得了根尖细胞染色体分散、平 展、分裂相多、随体清晰的染色体制片。核型分析结果表明6 个品种的核型均为基本 对称核型，但染色体的随体大小、数目等方面还存在一些差异。所以，细胞遗传学研 究也可以作为一种分析栝楼不同基因型材料的亲缘关系及种质鉴定的方法。 关键词：栝楼r a p d 遗传差异种质鉴定核型分析 a b s t r a c t i nt h i se x p e r i m e n t ，m o l e c u l a rt e c h n i q u ea n dc l l r o m o s o m ek a r y o t y p ea n a l y s i sw e r e u s e dt oa n a l y z et h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i po fn i n ec u l t i v a r sa n dn i n e w i l ds t i r p so f t r i c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i mw h i c hw e r ef r o md i f f e r e n tr e g i o n so fc h i n a ，s ot h a tw ec a l l e s t a b l i s has e to f r a p i d ，s e n s i t i v ea n da c c u r a t es y s t e m so fs e e di d e n t i f i c a t i o n ，t h eh e a l t h y d e v e l o p m e n to ft r i c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i mw i l lb ep r o m o t e da n dt h es u s t a i n a b l e u t i l i z a t i o no ft r i c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i mr e s o u r c e sw i l lb er e a l i z e d r e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 i nt h es t u d y , t h eg e n o m i cd n ae x t r a c t e db ya d v a n c e ds d sm e t h o dc o u l db ef u l l yu s e d f o rr a p d a n a l y s i s n l ee x t r a c t i o nm e t h o di ss i m p l e ，e c o n o m i ca n dq u i c k 2 r a p dt e c h n i q u ec h a r a c t e r i z e dw i t hn os t r i c tl i m i t a t i o nt op r i m e r , s t r o n gp o l y m o r p h y a n ds e n s i t i v e ，b u ti ti sn o tg o o di ns t a b i l i t ya n dr e p e a t a b i l i t y , s ot h e r ei san e c e s s i 够t of i n da r a p dr e a c t i o ns y s t e ms u i t a b l ef o rt h ee x p e r i m e n ti no r d e rt op r o m o t es t a b i l i t ya n d r e p e a t a b i l i t y t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r sa n de x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r so nr a p dw e r es t u d i e d i nt h ei t e m s ，s u c ha st e m p l a t e ，d n t p s ，t a qd n ap o l y m e r a s e ，p r i m e r ，m g z + a n d d e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r e ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r ea n dt i m e ，t h ee l o n g a t i o nt i m ea n dc y c l e n u m b e r s a sar e s u l t ，o p t i m a lp c ra m p l i f i c a t i o ns y s t e mi n c l u d e d l p c rb u f f e r 、 1 5 m m o l lm g c l 2 、0 2 m m o l ld n t p s 、0 4um o l lr a n d o mp r i m e r s 、7 5 n gd n at e m p l a t e 、 1 ut a q d n a p o l y m e r a s e t 1 1 eo p t i m a la m p l i f i c a t i o np r o g r a mw a s a sf o l l o w s ：5 m i na t9 4 。c ， f o l l o w e db y9 4 f o r30 s e e ，38 f o r8 0 s e e ，7 2 f o r12 0 s e e ，4 0c y c l e sa n df i n a l e x t e n s i o nt i m eo f7 2 f o rl0 m i n 3 at o t a lo f2 5 9p r o d u c t sw e r ea m p l i f i e db y3 0s e l e c t e dp r i m e r s ，o fw h i c h2 4 1 ( 9 3 1 ) w e r ef o u n dt o b ep o l y m o 印h i ca m o n gt h e18g e n o t y p e s ，r a n d o mp r i m e r s $ 4 6 0a n ds1114 h a dt h em o s tp r o d u c t su pt o13b a n d s ，w h i l e $ 4 9 7a n d $ 2 0 3 2h a do n l y4b a n d s t h el e n g t h o fm o s ta m p l i f i e df r a g m e n t sr a n g e df r o m10 0t o2 0 0 0 b p i tw a sc o n c l u d e dt h a te i g h t e e n b r e e d sw h i c hh a db e e nt e s t e di nt h er e s e a r c hc o u l db ec l a s s i f i e di n t os e v e ng r o u p s 4 r a p da n a l y s i sc a ne x a m i n el o t so fv a r i a t i o n s f o re x a m p l e ，c h a n g x i n gt r i c h o s a n t h e s w h i c hw a sa m p l i f i e db yp r i m e r $ 3 8 5c a l lp r o d u c es p e c i f i cm a r k e r $ 3 8 5 - - 7 2 0 b p ，s i c h u a n t r i c h o s a n t h e sw h i c hw e r ea m p l i f i e db yp r i m e rs113 4c a l lp r o d u c es113 4 3 0 0 b pb a n d d e l e t i o n s h a n d o n g x i a o p i a nc a l lp r o d u c es 113 7 b p 一3 0 0 b pb a n dd e l e t i o na n ds p e c i f i cb a n d o f $ 4 6 0 - - 2 0 0 b pr e s p e c t i v e l ya m p l i f i e dw i t hp r i m e rs 1 1 3 7a n d $ 4 6 0 t h e s es p e c i f i cb a n d s w e r e i m p o r t a n t c h a r a c t e r i z a t i o nf o rd i s t i n g u i s h i n gt r i c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i m t t c u l t i v a r s 5 i ns t u d i e so fc y t o l o g i c a lm a r k e r s ，c e l l so fc h r o m o s o m e ss c a t t e r e d ，f l a t t e d ，m o r es p l i t p h a s e sw e r eo b t a i n e du s i n gm o d i f i e df b s gm e t h o d t h er e s u l t so fs t u d yf o rk a r y o t y p e s h o w e dt h a ts i xb r e e d sh a ds i m i l a rk a r y o t y p e s ，b u tt h e ya l s oh a ds o m ed i f f e r e n c e sa m o n g t h e m ，s u c ha ss i z ea n dn u m b e ro fs a t e l l i t e a c c o r d i n gt ot h o s ew ec o u l di d e n t i f yt h e m t h e r e f o r et h i sc y t o l o g i c a lr e s e a r c hc a nb ec y t o l o g i c a lm a r k e r su s e dt oa n a l y z et h er e l a t i o n s a n dt h eb r e e d sd i s t i n c t i o no fv a r i o u sg e n o t y p e so ft r f c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i m k e y w o r d s ：t r i c h o s a n t h e sk i r i l o w i im a x i mr a p d g e n e t i cd i f f e r e n c e g e r m p l a s mi d e n t i f i c a t i o nk a r y o t y p ea n a l y s i s i i i 插图和附表清单 表l 核型按对称链程度分类的示意图，1 4 表2 不同提取法所得山西短勃l 号种子d n a 的紫外分析结果。1 5 表3s d s 法对1 8 种括楼品种的种子d n a 提取的紫外分析结果1 6 表4 最佳反应体系( 2 5 珏1 ) “”一“2 3 表5 最佳反应程序2 3 表63 0 个引物的痔列及其扩增结果，”一”2 9 表7 引物对各供试材料的扩增带数( 1 ) 3 0 表8 引物对备供试材料的扩增带数( 2 ) ”3 1 表9 栝楼品种r a p d 多态性标记“”一一- 3 2 表l o 特异引物对不同供试材料扩增的特征谱带3 3 表n 特舜引物对不同供试材料的特征缺失3 3 表1 2 栝楼1 8 个晶种的3 0 个引物1 2 1 个r a p d 片段的聚类结果3 5 表1 35 个栝楼品种的核型比较一“一一一”一3 7 表1 45 个栝楼品种随体类型的差异3 7 霜薹不同提取法获得的由谣短勃王号种子d n a 图谱1 7 图2 用s d s 方法提取1 8 种栝楼种子的d n a 图谱1 7 图3 用s d s 方法提取1 8 种栝楼种子d n a 的p c r 扩增图谱( s 愀 1 8 图4 8 不同反应条件下扩增的r a p d 带型1 9 2 王 图9 一1 1 不同扩增参数对t 泌p d 图谱的影响2 2 圈1 2 2 5 不同引物对供试品种扩增的r a p d 图谱2 3 2 8 图2 6 2 8 某些供试品种的特征谱带o d oog ooo e o o o 3 3 - 3 4 圈2 91 8 个供试品种聚类图“3 5 附表11 8 个基因型的名称及其来源4 9 附表21 8 个供试品种阈的相似系数“s 0 5 l 附表31 8 个供试品种间的r a p d 遗传距离5 2 5 3 附图1 6 六份待试品种的染色体核型5 4 5 6 附图7 一1 2 六份待试品种的染色体核型模式图5 7 5 9 附表4 9 六份待试品种的染色体测量数据6 0 一6 5 v i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名- 毯趁 帆斯牙年加7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： 帆触“夕 1 文献综述 1 1 栝楼种质资源及遗传差异研究的意义 葫芦科( c u c u r b i t a c e a e ) 栝楼属( t r i c h o s a n t h e sl i n n ) 约八十余种，分部于东南亚，由 此向南经马来西亚至澳大利亚北部，向北经中国至朝鲜、日本。我国有四十余种，全 国都有分布，以西南和华南居多【l 训。本属的有些植物具有很高的药用价值，中华人 民共和国药典收录了本属的3 种植物，中药志收录了1 3 种。从栝楼根提取的天 花粉蛋白临床上已经被用于治疗葡萄胎、肿瘤和艾滋病等；栝楼的果实在治疗心血管 疾病方面也有特效；栝楼的种子中药名为栝楼仁，本草纲目记载栝楼仁具有润肺 止咳滑肠之功效。栝楼子富含脂类物质和蛋白质，它以其独特的风味和保健作用已经 成为消费市场的新宠。当前，由于对栝楼种质资源的评价、保护工作不足导致野生栝 楼资源日渐衰竭，栽培种抗性和遗传多样性不断下降，市场上的栝楼种子品质参差不 齐，同名异物、同物异名的情况十分普遍。 农业生产中，特别是在播种早期至果实成熟之前进行品种鉴定( 如区分不同材料 的种子和幼苗等) 具有十分重要的意义，而采用r a p d 方法在选择合适的引物的情 况下，就能够鉴定出不同栝楼品种及鉴定出杂种种子的纯度。同时，在分子生物学水 平上开展栝楼属野生种和栽培种的鉴定研究，可以明确两者的亲缘关系和系统进化规 律，为种质资源的保护、开发和利用奠定坚实的理论基础。在对1 8 种材料进行r a p d 分子标记研究的基础上，能获得差异较大的品种。对部分栽培和野生品种再进行细胞 学方面的研究( 如核型分析) ，可以更加深刻地揭示它们之间的遗传差异与联系。总 之，分子生物学和细胞遗传学结合研究对于栝楼的种质鉴定和引种育种有着重要的意 义和价值。 1 2 细胞遗传学在栝楼系统分类及种质资源研究的应用 栝楼属是林奈于1 7 5 3 年依据蛇瓜t a n g u i n al 建立的。当时对该属植物仅记载了 四种，到目前为止，已确认的栝楼植物有8 0 余种。本属植物通过长期演化，在花序、 小苞片、果实及种子上常有差异而形成不同的近缘类群，因此，很多分类学家曾把本 属分为各组或划分成不同的亚属。栝楼作为一个复合种，其研究被称为“t h em o s t i n t r a c t a b l et a x o n o m i cp r o b l e mi ne a s t e r na s i ac u c u r b i t a c e a ec e n t e r 【4 】栝楼属植物细胞遗 传学研究报道较少，d a r l i n g t o n ( 1 9 5 5 ) 5 】手旨出本属染色体基数为x - - 1 1 。迄今，查阅文 献 6 - 9 所知，国外只报道了该属1 1 个种的染色体数目。黄璐琦等在对国内进行广泛调 查采集的基础上，从美国、英国、澳大利亚、泰国、马来西亚及日本等国的各大标本 馆借来标本，系统研究整理了分部于世界各地本属植物的种类，确认有8 4 种8 变种， 我国有3 7 种6 变种，是栝楼属植物的主要分布中心。早在1 9 9 4 年，黄璐琦等就研究 报道了栝楼属8 种植物的染色体数目，除瓜叶栝楼和马干铃栝楼外，其余6 种均为首 次报道【m 】。 1 3 分子标记技术及其在栝楼研究中的运用 1 。3 1d n a 分子标记技术 分子标记分广义和狭义两种。广义指可遗传的并可检测的d n a 序列或蛋白质， 包括生化标记在内。而狭义的分子标记仅指d n a 标记。1 9 7 4 年，g r o d z i c k e r 】等人 发现了d n a 水平上的分子标记一rf l p 。19 8 0 年，人类遗传学家b o s t e i n 1 2 】首先提出 了用r f l p 作为构建遗传连锁图的设想。1 9 8 7 年，d o n i s k e l l e n t ：3 等报道了第一张人 类r f l p 遗传图谱，开创了分子标记应用的新纪元。近2 0 年来，特别是在人类基因 组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 的推动下，分子标记的研究与应用得到了迅 速发展。与形态学标记、细胞学标记、生化标记相比，分子标记具有众多优点。d n a 分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的d n a 片段。 这种d n a 片段是基因组d n a 经限制性内切酶切割，或作分子杂交后在电泳上检测 得到的。当前分子标记已经广泛用于育种目标性状与分子标记的连锁分析等等。 1 3 1 1r f l p r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 且o 限制性片段长度多态性是发 展较早的一种分子标记。产生r f l p 的分子基础是d n a 中特定的限制性内切酶位点 上碱基对的改变或其他的分子重排，用特异的限制性内切酶切割后，与同位素或者非 放射性物质标记的探针杂交后，通过显示酶切片段的大小来检测不同遗传位点的等位 突变。r f l p 的特点是无表型效应，稳定性好，标记数量丰富。8 0 年代以来，这项技 术被广泛用于植物中，已经建立了多种高等植物的r f l p 遗传图谱，并在多种作物中 成功地用于品种鉴定、遗传变异检测等等【1 4 。16 1 。利用i u l p 进行多态性分析具有众多 优点，主要表现在：第一，较高可靠性，这是由限制性内切酶识别序列的专一性决定； 第二，来源于自然变异，依据d n a 上丰富的碱基变异不需任何诱变剂处理；第三， 多样性，通过酶切反应d n a 水平上所有差异，因而在数量上无任何限制；第四，共 显性，指r f l p 能够区别杂合体与纯合体；第五，数量性，具有数量化。尽管r f l p 标记在众多的研究领域得到了广泛的应用并取得了显著成果，但它也存在着诸如技术 较复杂、成本高、劳动强度大、放射性物质污染、对所研究对象需要有一定的遗传背 景知识等不足。因此，r f l p 技术的应用和推广受到了一定的限制。1 9 9 9 年，黄璐琦 运用r f l p 标记技术对栝楼居群内雌雄株共9 个个体的r d n a 进行分析，结果表明： r d n a 的r f l p 变化样式在栝楼居群中变化较大，较难用于此复合种的遗传多样性分 析【1 7 1 。 1 3 1 2a f l p a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 是由荷兰人z a b e a u 等 1 8 】于19 9 2 2 年发明的一项d n a 指纹技术。该法兼具r f l p 和r a p d 两种优点。它的基本原理是 对基因组d n a 限制性酶切片段进行选择性扩增，使用双链人工接头与该酶切片段相 接连作为扩增反应的模板，在d n a 聚合酶的作用下进行p c r 扩增。a f l p 标记技术 运用中如果注意到了操作步骤的优化，引物的设计及引物的巧妙结合这些关键点，不 但可以提高工作效率，还可以降低成本。如操作步骤的优化；引物的设计；引物的巧 妙组合等等。a f l p 为显性标记，不能区分纯合和杂合，因此在群体遗传结构交配系 统研究中有一定的局限性，不如s s r 等共显性标记。但是由于a f l p 标记位点多， 效率高，一套完整的a f l p 标记数据能较全面的反映群体间群体内不同层次的变异情 况，所以它是一种十分理想而有效的遗传标记技术。目前，a f l p 技术在蔬菜、林木 及拟南芥上得到广泛应用。但a f l p 采用了同位素检测手段，随着银染技术和荧光 a f l p 技术的发展，可大大提高a f l p 的安全性。 1 3 1 3s s r 和i s s r s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 作为第二代基于p c r 的一种新型d n a 分子遗传标 记，广泛分布于整个植物基因组。如m c c o u c h 等从3 2 8 4 个已测序的水稻基因组b a c 和p a c 克隆中( 覆盖8 3 的水稻基因组序列) 利用电子p c r 进行引物设计，开发出 了2 2 4 0 个新的s s r 标记【1 9 】。在水稻、玉米、小麦、大麦、大豆等作物中，s s r 的多 态性显著高于r f l p 。该标记技术是根据微卫星序列两侧的保守序列设计引物，对串 联重复的微卫星序列进行p c r 扩增，结果可以显示出s s r 序列拷贝数的差异。该技 术重复性和稳定性都较好，被广泛运用于遗传作图、种质鉴定等研究中。如s h a r o p o v a 等在玉米基因组文库中新开发了1 0 5 1 对s s r 引物，并用其中的9 7 8 对引物构建了玉 米s s r 分子图谱【2 0 j 。n a g a r a j u 等利用7 0 个s s r 标记和4 8 1 个i s s r 标记对2 4 个不 同水稻材料进行了进化和分类研究【2 1 1 。在构建植物s s r 图谱的基础上，开展控制重 要性状的基因或者q t l 的定位分析，为进一步进行分子标记辅助选择甚至克隆这些 基因或q t l 打下基础。但由于s s r 两侧的引物具有物种特异性，引物设计又耗时耗 力，这在一定程度上限制了该技术的广泛运用。i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 是由加拿大蒙特利尔大学z i e t k i e w i c z 等发展起来的一项标记技术。它在引物设计和 运用上较s s r 更加简便，免去了引物测序和引物设计等复杂环节。近年来，i s s r 标 记广泛运用于多种动植物的基因定位和遗传多样性等研究方面。k o j i m a 等首先将 i s s r 标记用于一粒小麦遗传作图，结果表明i s s r 标记分布于整个染色体组，并可以 增加r f l p 图谱标记的饱和度【2 2 1 。利用i s s r 标记进行作物基因定位的研究已在小麦 和水稻中取得了一定的成果，a m m i r a j u 等用i s s r 标记找到了7 个与小麦籽粒q t l 连锁的分子标记，3 个标记与小种子性状连锁，。4 个标记与大种子性状连锁，他们认 为i s s r 技术在寻找与控制农艺性状连锁的分子标记中将非常有用【2 3 1 。 1 3 1 4s t s 序列标签位点 3 s t s ( s e q u e n c et a g ss i t e ) 最早应用丁人类皋凶组中。s t s 足根据单拷贝的d n a 片段曲端的序列设计对特异性引物，从基囚组d n a 扩增出段长儿百个b p 的特 异序列，此序列在基冈组- i 往往只现一次，冈i l 能够裕定基冈组的特异位点。s t s 技术稳定性好，操作简单，能对目的皋凼作出快速有效的鉴定和选择，任何单拷贝的 多态性标记都可以作为基囚组的界标转变为s t s 标记。例如可根据f 西拷贝的i 强l p 克隆，特异r a p d 片段的序列、已知座位序列设计0 i 物，都能够转化为s t s 标记。 h u 将与小麦抗白粉病皋凶p m l 连锁的r a p d 标记转成s t s 标记，用丁小麦育种的 h 的基囚的选择和分离。但是形成s t s 标记前期所需的测序及合成引物花费较大i 列j 。 i 3 j 5m r n a 差异显示技术 其原理足利用一系列寡聚核：【j ：酸为引物，其中一种锚定丁m r n a 3 端p o l y ( a ) ， 进 j ：反转录，形成m r n a 、d n a 的杂交分了。在p c r 仪内除加前种引物外，冉加另。 端的随即，j i 物，它可与反转录成的币链c 1 ) n a 相结合，随机进行p c r 扩增以后将所有 扩增片段经序列胶显示出来。这种研究m r n a 差异的技术，排除了非编码区的影响， 使研究范幽缩小剑了表达基囚上，成为研究生命现象的重要领域。m r n a 筹别显示易 产生大晕的表面卜为特异条带i | 实际为假阳性的片段，这归结于众多d n a 片段可存在 丁一条切割条带上。序列胶上差别条带与临近条带的间距很小，切割又需f - 恃助丁川位 素的放射自显影的胶片，从而增加了特异条带切割的难度，敛使假阳性频率大为增加。 差j j 0 显示缺点之二在十条带的短小，大都在1 1 0 4 5 0 b p 之i 口j ，肌且近显示的是3 - l ，j k 序列。而大多数已知皋凶一般不含3 - u t r 序列，若用此短片段进行e d n a 文库的筛选， 势必造成欠效。 1 3 1 6s s c p 分析 s s c p 即d n a 单链构缘多态性，该研究被认为足当d ，j 真核皋i 到突变分析的一种十 分简便和灵敏的方法，有可能突破散和重复序列不能作遗传标记的禁i x l 2 5 1 。自然性状 下的前链d n a 会折叠卷曲，形成一定的空f b j 构象，其特布卜是d n a 链的特定碱基顺序 决定的。在s s c p 分析中，利用p c r 技术定点扩增出基凶组d n a 分子上的某一目标序 列，然后将扩增j 、，= 物进行变性分析，这时，舣链d n a 分丌成单链，冉用非变性的聚内 烯酰氨凝胶电泳分离。如果被扩增的目的片段任一d n a 链i t 碱基序列发生了变异，则 几j 能会由丁这种变异而影响其构琢和电泳迁移率，使其带纹出现存电泳图潜的不同位 置，从而显示不同生物个体的d n a 特异性，达到指纹分析的1 1 的。 1 3 1 7r a p d r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 足以短的随机序列d n a 为引物，对模 板d n a 进行p c r 扩增，h 的是检测扩增片段的多念性。这。技术的原理是建立在聚 合酶链式反应( p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 扩增基础卜。它利用一系列( 通常 数百个) 不l 叫的随机排列碱举顺序的寡聚核c j ：酸单链( 通常为1 0 碱塔) 为引物，对 4 所研究基因组d n a 进行p c r 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺戏琼脂糖凝胶电泳分离， 经b 染色或放射性自显影检测刍增广：物d n a 片段的多态性，这些扩增，沁物d n a 片段的多念性反映了基冈组相应区域的d n a 多念性。r a p d 所用的一系列0 i 物d n a 序列各不椴嗣，但对丁任一特定的引物，它同基因组d n a 序列有其特定的结合位点。 这些特定的结合位点在基因组某些区域内盼分布如符合p c r 扩增反应的条件，鄯弓| 物在模板的两条链卜有互补位置，且0 i 物3 端相距在一定的k 度范闱之内，就可扩 增出d n a 片段。凶此如栗摹因组谯这些区域发生d n a 片+ 段插入、缺失或碱摹突变 就可能导敏这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使p c r ，扯物增加、缺少或发 生分子薮魄改变。透过对p c r 产物的检测酃可测建基阑组d n a 在这些区域勰多念性。 幽丁进行r a p d 分析时几j 崩引物数很大，虽然对每一个引物而占其检测笨凶d n a 多 态性的区域是有限的，但是刹朋系列引物则可以使检测区域儿乎覆靛整个丛斟组。 闲此r a p d 可以对整个基闵组d n a 进行多态性榆测。 r a p d 技术的特点是分析程序简单，快速，对样晶的质量疆求不高和不依赖丁种 籍的特茹性及基因组的结构。h 前，运用r a p d 标避已经对大麦、花生、桃、桑、 洒瓜、烟草、葡萄等植物进行了大齄的分子生物学研究1 2 6 七2 1 。如r a p d 技术可以用 ，分子系统学研究翱系满分析，品孝申或种质鉴定，杂交种子遗传纯度酶鉴定，遗传多 样性分析，连锁图谱的构建，基囚标记，种问基因流动的分析及外源导入基因的追踪， 体缨胞杂种、突变体、嵌合体、珠心苗与合子茁的箍定等。r a p d 榆测受反应条件的 影响较大，稳定性较差。但是，通过优化反应体系和程序，如拄制模板d n a 量及退 火温度和时问等，能提高它的稳定性和可重复性，获得的结果也比较可靠。另外，可 将r a p d 作为初步筛选攀定的一种方法，发现所需要的d n a 扩增产物之后，用等位 特异p c r 或者特殊序列扩增的方法，将r a p d 标记转变为经典的p c r 标记，提高标 记的稳定性。细现己成功地将与p m 2 1 连锁的r a p d 标淀转纯为稳定的s c a r 标 之秘引。 除卜述分子枷：记外，近年水新现的运用十植物遗传育种的还有s n p 等。现代 分子标记技术虽然起步较晚，但发展迅速。我们应该努力将新技术运用于柄楼遗传研 究上，改变栝楼遗传研究水平较低的局而。 1 3 。2r a p d 技术在栝搂种质资源评价中的应用 黄璐琦，下敏等刷耀r a p d 技术对由东长清等主产区的3 个主流农家晶种进行 研究，从7 个引物中筛选出3 个能明显区分r 栝楼、槭栝楼和地栝楼的引物，可以对 栝楼农家配种进行单期箍定l 矧。壬敏等选择了9 个扩增多态健好的0 | 物对仁栝楼、糖 析楼和牛心栝楼的d n a 进行r a p d 扩增，明确了三者的遗传距离，分析结果还表明 牛心捂搂在遗传表现上更接迸于f 据楼瑟5 1 。黄璐琦等利用扩增多念d n a ( r _ a p d ) 技术雅别一l i 药材犬花粉及其类似品，试验结粜表明采用多没对照品，敢大量数掘进行 聚类分析，能够使r a p d 技术很好地崩丁药材鉴别，嗣时也为解决粉未及破碎药材 的鉴定提供了新的方法【3 6 1 。 6 2 引言 目前，国内外对栝楼的研究主要集中在天花粉蛋白的生物合成以及各种类似天花 粉蛋囱的小分子核糖体失活蛋囊的分离、纯化及其性质等的研究，两对栝楼的系统分 类、种质资源的评价和鉴定较少，尤其是对栝楼的品种选育和栽培技术的研究就更少 【3 7 4 l 】 o 当前生产中应用的多为农家品种，由于长期使用又缺乏对其的提纯和复壮，导致 种质退化严重，抗性下降，如山东长清地区栝楼的根腐病发生普遍。因此，采用选种、 引种、常规杂交、远缘杂交等多种手段进行新晶种的选育，已经成为栝楼生产中急需 解决的问题。栝楼的适应性强，在我国广泛分布，野生资源也很丰富，而且在长期不 同栽培条件下出现了多种变异类型。为了获得足够多的栝楼遗传资源，扩大育种基因 池，一方面，我们要广泛收集、保护、研究和利用栝楼栽培品种资源( 包括农家品种) ， 使它们的一含或者多个优良基因资源德以保存；另一方面，栝楼种内的遗传资源毕竟 有限，许多有益的基因资源在栝楼种内缺少甚至不存在。因此，除了在利用现有的品 种资源外，还可以将栝楼与其近缘种属进行远缘杂交，有目的地将野生资源中有益基 因导入栝楼，进行栝楼品种的改良。 近年来，。d n a 分子标记技术( 如r f l p 、a f l p 、s s r 、r a p d 等) 已经广泛运 用于育种霹标性状与分子标记的连锁分析、辅助选择育种、种质鉴定等方面。它较形 态标记、同工酶标记相比，其优越性在于：它们对表型无影响，大多数分子标记是共 显性，对隐性农艺性状的选择十分便利；基因组的变异及其丰富，分子标记的数量几 乎是无限的；在发育的不同阶段不同组织的d n a 都可以用于标记分析，这使得对植 物基因型的早期选择成为可能【4 触。r a p d 技术因具有操作简便、快速、所需样品量少0 不需要预先知道基因组序列及引物的生物普遍牲等特点而被广泛运用。因此，r a p d 技术对于栝楼的系统分类、品种或种质鉴定、杂交种子遗传纯度鉴定、追踪外源基因 及标记基因等方面的研究有着重要的意义。 本研究以来自不同生态区的9 个栽培种和9 个野生种为材料，研究它们的r a p d 分子标记及细胞遗传学特征。通过r a p d 分析不仅可以对不同地区栝楼罴种以及栽 培与野生种进行分子水平的遗传多样性和亲缘关系分析，还可以通过特异性谱带来鉴 别一些待试品种，为标记基毽定位研究以及分子育种奠定一定的基础。同时，应用栝 楼细胞学标记技术，从核型分类来分析栝楼不同品种及栽培与野生种染色体结构上的 差异，确定其亲缘关系远近，可以为栝楼遗传育种、亲本选配等方面提供科学的理论 依据。 7 3 材料与方法 3 1 栝楼的r a p d 分子标记研究 3 1 1 实验材料 将栝楼种子用清水泡一下，去种皮，周湿纱布擦洗于净，放入带有标记的塑料袋 中，4 0 冰箱中保存备用。 3 1 2 设备、仪器和试剂 3 121 设备和仪器 p c r 扩增仪( h e m a4 8 0 0 ) 、凝胶自动成像系统( 美国k o d a k ) 、高速冷冻离心机( h e t t i c h d 7 8 5 3 2t u t t l i n g e n ，德国) 、紫外可见分光光度仪( u v - 1 6 0 0 ) 、电泳仪和电泳槽 ( d y y - i i l 4 ) 、制冰机( s a n y os i m - f 1 2 4 ) 、微波炉( g a l a n z ) 、常温冰箱( m e i l i n g b c d 2 3 6 ) 、立式蒸汽高压灭菌锅( 上海博迅y x q 。l s 一5 0 s 1 ) 、超净工作台( 上海博迅 s b 。j c 1 a ) 、恒温水浴锅( 江苏国胜h h s ) 、手提式紫外检测仪( 上海腈桑u v - 6 h ) 、 连续可调微量移液器( a n 拿大b b i ) 。 3 1 2 2 试剂 十二烷基硫酸钠( s d s ) ，十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 、巯基乙醇、t r i s 。c i 、1 0 b p 随机引物、t a q 酶、d n t p s 、m g c l 2 、p c rb u f f e r 等均购囱上海s a n g o n 生物工程公司。 l a m b d ad n a e c o ri + h i n d i i i m a r k e r 、p c rm a r k e r ( d l 2 0 0 0 ) 购自t a k a r a 生物工程 公司。琼脂糖由上海s a n g o n 生物工程公司分装进阉。其他试齐| j 均为国产分析纯产品。 3 。 。3 方法 3 1 3 1 基因组d n a 的提取 3 1 3 1 1s d s 方法提取栝楼种子基因组d n a l 4 3 郴】 ( 1 称取约0 3 9 种子剪碎后敖入研钵，热适量液氮研成粉末状。 ( 2 ) j n 入2 5 m 1 6 5 预热的s d s 提取液( 1 , 5 s d s 、1 0 0 m m o l lt r i s - h c lp h 8 0 、 5 0 0 m m o l ln a c l 、5 0 m m o l le d t ap h 8 0 、少许b - 巯基乙醇1 11g m 1 ) ，充分磨匀后 倒入7 m l 离心管中，6 5 水浴3 0 6 0 m i n ，每隔1 0 m i n 轻缓混匀。 ( 3 ) 从水浴中取出后，加入2 5 m l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，彻底混匀后室滠静要1 0 m i n ， 1 2 0 0 0 r