（生物医学工程专业论文）改性尼龙亲和膜的制备及其清除亲脂性毒物的研究.pdf

单的方法就能实现胆红素的洗脱和亲和膜的再生，再生膜的机械性能良好，多次 使用后，其拉伸强度变化不大，甚至经长期储存后，仍然具有良好的机械性能。 对胆红素仍然具有较强的吸附能力，可多次重复使用，实际应用中可以大大降低 成本。 关键词：亲和膜色谱，胆红素，尼龙 纤维素，再生，吸附等温线 辛巴蓝，壳聚糖，壳聚糖衍生物，羟乙基 吸附动力学 i i a b s t r a c t a f f i n i t y m e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y ( a m c ) i san e ws e p a r a t i o nt e c h n o l o g y c o m b i n i n gt h ea d v a n t a g e s o fa f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ya n dm e m b r a n et e c h n o l o g y h i g hs p e c i f i c i t ya n do u t p u to fa m c ，i t c a n g e tf a s ts e p a r a t i o np r o c e s su n d e r l o w e r p r e s s u r ed r o p a m c h a sa r ta p p l i c a t i o np r o s p e c ti nv i t r od e t o x i f i c a t i o n an e wk i n d o f a f f i n i t ym e m b r a n es y s t e m w a si n t r o d u c e db y u s i n gn y l o n m e m b r a n ef i l t e r sa ss u p p o r t ； c o a t i n g 、v i 也h y d r o p h i l i c m a e r o m o l e e u l e so fc h i t o s a n c h i t o s a nd e r i v a t i v e sa n d h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e t oe n h a n c et h eh y d r o p h i l i c i t ya n d i m m o b i l i z i n g w i t har e a c t i v e d y en a m e l y c i b a c r o nb l u ef 3 g aa sl i g a n d f o rb i l i r u b i nr e m o v a l p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s o ft h ea f f i n i t ym e m b r a n e sw e r ed e t e r m i n e d s c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ( s e m ) d i s p l a y s t h eu n i f o r mp o r es t r u c t u r ea n dp o r e s i z ed i s t r i b u t i o n ，t e n s i l es t r e n g t hr e v e a l e dg o o dm e c h a n i c a lp r o p e r t y , a n dh y d r a u l i c a n a l y s i ss h o w sf a i r l yl a r g ep o r es i z e ，p o r o s i t ya n dp u r ew a t e rp e r m e a b l ef l u x f t i r a n a l y s i si n d i c a t e sc o v a l e n tc o u p l eo fh y d r o p h i l i cl a y e r sa n dd y er e l e a s ed e t e r m i n e s t h ec o v a l e n tb o n do ft h el i g a n di m m o b i l i z a t i o n a l lt h e s ec h a r a c t e r i s t i c si n c l u d i n ga h y d r o p h i l i cl a y e rc o n t e n t su pt o 9 1 6 m g ga n dl i g a n d c o n t e n to v e r9 0g m o l ga r e s u g g e s t i n g t h ef b r t h e ra p p l i c a t i o n so f t h em e m b r a n e s e f f e c t so nt h eb i l i r u b i n a d s o r p t i o n o ft h em e m b r a n e sw e r e i n v e s t i g a t e d t h e a d s o r p t i o nc a p a c i t ys h o w e dt oi n c r e a s ew i t hi n c r e a s i n gt h el i g a n dc o n t e n ta n di n i t i a l b i l i r u b i nc o n c e n t r a t i o n i tf i r s td e c r e a s e da n dt h e ni n c r e a s e do ft h ec a p a c i t yw i t l lt h e i n c r e a s i n g o fi o n i cs t r e n g t h a n df i r s ti n c r e a s e dt h e nd e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gt h ep h v a l u eo ft h ea d s o r p t i o nm e d i u ma n dap e a ka p p e a r e da tp hr a n g e6 0t o7 0 t h e a d s o r p t i o nc a p a c i t ya n dt h er a t ei n c r e a s e dw i n lt h ei n c r e a s i n go ft e m p e r a t u r e a n da t 3 7 t h ea d s o r p t i o nc o n d i t i o nw a s o p t i m i z e d a tt h ee x p e r i m e n t a lr a n g e c o m p e t i t i v e a d s o r p t i o no ft h em e m b r a n e sw a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h ee f f e c to fb o v i n es c r a m a l b u m i n ( b s a ) m i g h tb ep r o n o n c e ，w h i l et h em e m b r a n e sc o u l ds t i l lg e ta d s o r p t i o n c a p a c i t i e su pt o2 0m g ge v e na th i 曲m o l a rr a t i o ( 5 0 ：1 ) o f b s at ob i l i r u b i n a n da t t h em o l a rr a t i ol e s st h a n0 8 ，t h em e m b r a n e sc o u l da c h i e v eas t r o n g c o m p e t i t i v e a b i l i 锣t oa d s o r bb i l i r u b i nf r o mb s a - b i l i r u b i nc o m p l e xs o l u f i o n t h e a d s o r p t i o n k i n e t i c sa n di s o t h e r mw e r es t u d i e di n t h i s d i s s e r t a t i o n t h e a d s o r p t i o np r o c e s s e sw e r el i k e l yt od i s p l a y ( p s e u d o ) f i r s t - o r d e rk i n e t i c si nt h ep r i o r5 0 m i na n da ( p s e u d o ) s e c o n d - o r d e rk i n e t i ci nt h ep o s t e r i o ra d s o r p t i o n t h ei s o t h e r m f i x e dt h el a n g m u i r - f r e u n d l i c hm o d e lw e l l ，w h i c hi n d i c a t e daf a v o r a b l ea d s o r p t i o n i l l a n dt h eb i l i r u b i na d s o r p t i o no f t h em e m b r a n e sw e r ep o s i t i v ec o o p e r a t e d t h e b r e a k t h r o u g hb e h a v i o r so f t h em e m b r a n es t a c k sw e r es t u d i e d t h em e m b r a n e s t a c k sw e r e e a s i l yb r e a k t h r o u g h a th i g hf e e d i n gr a t ea n di n i t i a lb i l i r u b i nc o n c e n t r a t i o n t h el i g a n du t i l i z a t i o nr a t i oa n dt h ec l e a r a n c eo f b i l i r u b i ni n c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gt h e i n i t i a lb i l i r u b i nc o n c e n t r a t i o n ，w h i l ed e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go ft h ef e e d i n gr a t e n ea d s o r b e db i l i r u b i nc o u l db ee l u t e db ys i m p l yf e e d i n gw i t hn a o h a q u e o u sa n d b s as o l u t i o n r e g e n e r a t i o na n dr e u s eo ft h em e m b r a n e sw e r e p e r f o r m e d t h e r e g e n e r a t i o nm e m b r a n e ss h o w e dg o o dm e c h a n i c a lp r o p e r t ya n dh i g l la d s o r p t i o n c a p a c i t y a l lt h e s es u g g e s t e da b i o m e d i c a l a p p l i c a t i o np r o s p e c t k e yw o r d s ：a f f i n i t ym e m b r a n ec h r o m a t o g r a p h y ；b i l i r u b i n ；n y l o n ；c h i t o s a n ；c h i t o s a n d e r i v a t i v e s ；h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ；c i b a c r o nb l u ef 3 g a ；a d s o r p t i o n i s o t h e r m ；a d s o r p t i o nk i n e t i c s ；r e g e n e r a t i o n i v 日u置 随着生命科学、医学以及生物技术的发展，人们对人体机能的研究更加深入。 人体产生的各种物质对于生命现象都有很大的影响，在正常的浓度范围内，它们 对人体有着重要的生理意义。而且由于人体系统是有机的整体，正常情况下，体 内产生的各种废物可以通过各种代谢途径得以清除，保证机体健康。然而，一旦 超出正常的范围，它们将对人体的健康造成影响，甚至威胁生命。对于各种病征 的临床研究结果表明：由于某些器官的病变，导致血液中各种内源性和外源性的 毒物的淤积，引起机体更严重的病变，最终可能导致机体的死亡，这是一个恶性 循环。如果能及时清除机体内产生的各种毒素而不影响人体内其它各种有用物质 的平衡，不仅能减轻患者的痛苦，更能为疾病的治疗争取时间，而且对于生命科 学技术的发展具有重大意义。 已经出现的各种血液解毒系统对于血液中的很多毒素都有一定的清除能力， 但是这些清除方法不免存在着清除效率低、副作用大等缺点，亟待完善。近年来 发展的亲和膜分离技术是一种新型的生物分离技术，对于生物分子的分离具有选 择性好、特异性高、生物相容性好的特点，不易使生物分子变性失活，而且处理 量大、速度快，能够实现连续性自动化的处理。如能将亲和膜分离技术应用于血 液中毒素的清除，可克服一些常规治疗手段的缺点，在生物医学领域具有广阔的 应用前景。 v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨壅盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 是。蚕蜴 签字日期：) ” 年，1 月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫生盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫韭盘生可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 夏嘭、j ( 签字目期：娜；年，z 月，箩日 导师签名：旗厨必 签字日期：护；年2 月t 而 。 第一章文献综述 1 1 亲脂性毒物及其清除 第一章文献综述 人体内每天产生的各种内源性毒物，大体可分为两类：水溶性( w a t e r - s o l u b l e ) 和蛋白结合性( p r o t e i n b o u n d ) 毒物。水溶性毒物如血液中的氨、肌酐和尿素等， 它们在水中溶解度大，分子量较小，可以直接通过泌尿系统排出体外。而像胆红 素、中链脂肪酸、游离酚等毒物，它们与血液中的蛋自分子强烈结合，是一类亲 脂性( 1 i p o p h i l i c ) 毒物，需通过肝脏的解毒，代谢作用后排出体外i l “。 肝脏是人体内重要的解毒器官，如果肝脏发生病变，将导致人体内毒物的累 积，引发疾病。如急性肝衰竭( a l f ) 、慢性肝病的急性代谢失调( a c l f ) 或 者在肝病末期的慢性代谢失调都可能导致肝衰竭，尽管发展的严重程度和速度各 不相同，最终的临床表现却相似，即出现脑病、严重黄疸、肝肾综合症( h r s ) 和循环系统病变等。这是因为肝脏衰竭造成血液中毒物如胆红素( b i l i r u b i n ) 、 胆酸、铜等毒物( 表1 1 ) 的大量累积，继而影响到其它器官的功能【j 4 j 。 表1 1 一些内源性毒素 t a b i - ls o m e e n d o g e n o u s t o x i n s 蛋白结合性毒物水溶性毒物 芳香族氨基酸尿酸 胆汁酸尿素 胆红索肌酐 吲哚氨 硫醇 苯酚 中、短链脂肪酸 氮氧化含物 前列环素 色氨酸 体外血液解毒技术通常用于各种外源性和内源性毒素引起的疾病，如药物中 毒、肾衰竭、肝衰竭等的治疗，对于亲弋性毒物的清除，临床上已有比较成熟的 方法，如血液过滤( i - i f ) 、血液透析( i - i d ) 、血液灌流( h p ) 【6 】等。亲脂性毒物 虽然也可以用这些方法以及血浆交换( h e ) 去除，但由于这些毒物通常与血液 中的载体蛋白自蛋白( a l b u m i n ) 强烈结合并以白蛋白一配体复合物的形式 存在，导致分离效率差。 第一章文献综述 胆红素是一种典型的亲脂性毒物，血液中胆红素的含量直接反映出人体的健 康状况；胆红素含量过高可能引发其它疾病；临床上常以对胆红素的清除衡量所 用的体外解毒技术对血液中亲脂性毒物的清除性能。 1 1 1 亲脂性毒物胆红素的性质 血液中红细胞不断更新，当红细胞衰老死亡后，血红蛋白分解为血红素，后 者在血红素加氧酶( h o ) 催化下生成胆绿素，再经胆绿索还原酶( 辅酶n a d p h ) 的作用被还原为胆红素( b r ) 【7 ，钔。x 射线衍射( x r d ) 分析表明，胆红素分子 结构上的两个丙酸侧链羧基与吡咯环上的亚氨基氢原子形成6 个较强的分子内氢 键，从而构成特定的脊瓦( r i d g e - t i l e ) 空间结构，如图1 1 所示，这种构象很稳定， 将分子上的极性基团封闭在分子内部，因而显示出较强的亲脂性归j 。胆红素的 p k a 值为4 2 4 9 【l o “】，在溶液中通常显负电性。血浆中的胆红素主要以胆红素 白蛋白复合物的形式存在和运输。血清白蛋白( m f 6 6 5 0 0 ) 是血液中的主要载 体蛋白，其分子结构上存在多个脂肪酸、胆红素的结合位点。血液中的亲脂性毒 物基本上都是以白蛋白结合的方式运辕进入肝脏的。白蛋白分子上有1 2 个胆红 索的强烈结合位点，同时还存在9 1 3 个较弱的结合位点，结合常数约为5 5 l o 7 l m o l i l2 1 3 。有研究发现，胆红素与白蛋白之间的强亲和作用位点主要在白蛋白 分子上的赖氨酸和组氨酸残基上，作用力主要是疏水作用和静电作用【l4 1 。白蛋 白与胆红素的这种结合一方面改变胆红素的脂溶性，更有利于胆红素的运输；另 一方面限制其自由通过各种生物膜的能力，不致有大量游离胆红素进入组织细胞 而造成细胞的损伤。 图1 1 胆红素的分子构型 f i g 1 - 1c o n f o r m a t i o no f b i l i r u b i nm o l e c u l a rs t r u c t u r e 胆红素的代谢过程如图1 2 所示。血液中与白蛋白结合的胆红素在肝血窦表 面细胞脱去蛋白进入肝细胞，在肝细胞中葡萄糖醛酸转移酶的作用下，胆红素与 葡萄糖醛酸结合形成单酯或二酯( 在胆汁中约占8 0 ) 。胆红素在肝细胞内结合 转化后，其理化性质发生变化，从极性很低的脂溶性的未结合胆红素变为极性较 强的水溶性结合物，从而不易通过生物膜。这样既起到了解毒作用，又有利于胆 第一章文献综述 红素从胆道排泄。结合胆红素( 葡萄糖醛酸) 随胆汁排泄至肠管，经水解、还原 成为胆素原，排除体外。 单核巨 噬细胞 血液 肝细胞 图1 - 2 胆红票的生成和代谢 f i g ，1 - 2f o r m a t i o n a n dm e t a b o l i s mp r o c e s so f b i l i r u b i n 血液中的胆红素含量可以通过重氮化试剂、钒酸、胆红素氧化酶( b o d ) 1 5 1 、 荧光反应试剂【16 等定量反应检测，也司以采用薄膜分析、色谱等方法确定。 胆红素是一种内源性的抗氧化剂，起着生理的断裂抗氧剂作用，对肝细胞的 再生具有积极的作用。当血红素转变为胆绿素后，又耗能从毒性较低的胆绿素转 变为有潜在毒性的胆红素并从肝脏排泄，这具有其特殊的生理意义。胆红素可以 切断过氧化脂质引起的连锁反应，防止细胞破坏，属于非酶类抗自由基系统。胆 红素还能直接清除氧自由基，于早期阶段终止自由基引起的细胞损害。 胆红素也是一种内源性的毒素。在正常情况下，人体内胆红素含量约为 1 0 - 1 0 m g l ，能与白蛋白完全结合( 每1 0 0 m l 血浆中自蛋白能结合2 0 2 5 m g 胆 红素) ，经肝脏排出。而当血液中胆红素累积过多，超过肝脏的处理能力时，将 导致高胆红素血症，出现黄疸：皮肤、巩膜和粘膜组织黄染。病毒性肝炎引起的 肝细胞性黄疸约占病例总数的1 0 5 0 ，此时肝细胞受到损害，其摄取、结合及 排泄胆红素的功能都发生障碍，血清中的胆红素含量升高，形成高胆红素血症。 黄疽的出现往往是病情加重的一种表现，肝细胞损伤越重，黄疸就越深。高胆红 素血症的病人，不仅肝脏黄染，还可发生胆汁性肝硬化，其他脏器也会不同程度 地被胆红素黄染而影响功能。例如，胆红素在肾小管内可形成胆栓，从而引起肝 肾综合症：胆盐成分会引起心脏传导系统的抑制，发生心动过缓，房室传导阻滞； 胆盐成分会刺激皮肤的感觉神经，引起皮肤瘙痒。病毒性肝炎出现高胆红素血症， 若不及时救治，会很快发展成重症肝炎，重症肝炎的死亡率高达8 0 。新生儿由 于肝脏器官发育不完全，细胞内葡萄糖醛酸转移酶活性不高，结合胆红素的蛋白 第一章文献综述 缺乏，摄取和转化胆红素能力差等原因，使得新生儿体内更容易形成胆红素的聚 积，产生高胆红素血症，可能导致各种组织器官的细胞死亡，临床上胆红素可能 导致新生儿精神发育不全、大脑性麻痹，甚至死亡等【l7 ，”】。动物实验发现，不 仅游离的、未结合胆红素能够进入脑细胞，而且白蛋白结合的胆红索也能进入脑 细胞导致脑病和核黄疸的发生【1 9 。刘湘陶等【2 0 】认为，胆红素对细胞的损伤作用 主要是由于其自由基( 结合在胆红素分子上的氧自由基) 使细胞膜磷脂过氧化， 膜蛋白降解、粘度降低，细胞不能维持其正常的生理环境和生物功能。这可能是 造成胆红素毒性的主要原因之一。 1 1 2 毒物的清除 体外血液解毒通常是将患者的血液从动脉引入体外解毒装置，血液中的毒物 被去除后，再经体外循环流回患者体内的过程。对于血液中亲脂性毒物胆红素的 清除，通常用光疗法或广义人工肝支持系统进行解毒。 1 1 2 1 光疗法【2 1 2 4 胆红素在光子作用下，能够转化为胆绿素。光疗法就是将高胆红素血患者景 于一定波长光照射下，将有毒的胆红素转化为无毒的胆绿素的治疗过程。其治疗 效率受到光波波长的限制。研究发现，在蓝光( 波长4 2 5 4 7 5n m ) 下治疗效果 较好，其次是绿光( 波长5 1 0n m 左右) ，而红光( 6 5 0r l n l 左右) 则几乎没有效 果。 光疗时可能造成不显性失水、腹泻、皮疹以及潜在的眼损伤等副作用，还可 能导致核黄素的分解、血小板数量下降。因此在治疗时应注意及时补充体液、避 免光线直接照射眼睛等。 1 1 2 2 人工肝支持系统 人工肝脏是借助体外机械、化学或生物性装置，暂时部分替代肝脏功能，从 而协助治疗肝功能不全或相关疾病的方法。由于人工肝以体外支持和功能替代为 主，故又称为人工肝支持系统( a l s s ) 。通过人工肝支持，为肝细胞再生创造环 境并为后续治疗争取时间，通常将a l s s 作为肝移植或特殊、应急情况下的辅助 治疗手段 2 5 2 7 】。 以解毒功能为主的a l s s 包括h p 、i - i d h f 等。血液透析滤过只对水溶性的小 分子毒物有较好的清除效果，对于蛋白质结合毒物的去除能力和选择性均较差， 而且处理时间长。血液灌流是将患者的血液由动脉引入体外血液灌流器，利用具 有广谱解毒效应的吸附剂来清除毒物，该法对农药中毒、药物中毒、肝昏迷引起 第一章文献综述 的高胆红素血症有显著疗效。血液灌流的关键在于吸附剂的选择，通常所用的吸 附剂包括活性炭和树脂两大类。其中树脂类吸附剂有大孔树脂( m r ) 幽j 、x a d 系列i2 9 1 、载酶系列【1 7 , 3 0 1 、壳聚糖系列 3 1 3 2 及含氨基阳离子的系列树脂 3 3 - 3 5 等。 这些非特异性吸附剂或离子交换剂直接与血液或者血浆接触，对于毒物的清除率 较高，但由于吸附剂的血液相容性差，会造成纤维蛋白原含量下降，而且由于吸 附剂与血浆蛋白直接接触，使得肝细胞生长因子、荷尔蒙、甲状腺素、类固醇等 也被部分清除f 3 6 】。为了减小上述不良反应，采用微囊化技术、改用血浆灌流等 可以避免吸附剂与血细胞直接接触，这样做虽改善了肝性脑病患者疗效，但吸附 剂本身的选择性并没有改变，因而死亡率并未有明显下降。为克服上述缺陷，目 前临床上通常将血液灌流与其它a l s s 联合使用。如p r o m e t h e u s 系统( b i o t e c s y s t e m s k r e m s g m b h ，a u s t r i a ) 由两部分构成：一是血浆分级分离与吸附( f p s a ) ， 用于脂溶性毒物的清除；另一是高通血液透析器，用于分离水溶性毒物【3 7 3 8 】。 p e ( 或王) 是较为成熟的肝脏替代疗法，它是用血浆分离器将患者的血浆 分离出来，代之以新鲜冷冻血浆或人体白蛋白溶液，这样既可以去除血液中的有 毒物质又补充了多种生物活性物质。但该法需消耗大量新鲜冷冻血浆，易发生病 毒的经血传播，以及免疫和过敏反应等，置换过程中还会去除患者机体内有益物 质 3 6 i 。 生物型人工肝是8 0 年代后期出现的新型a l s s ，它是将肝细胞悬液、培养 肝细胞等与生物合成材料组装成某种形式的a l s s ，它不仅具有肝的特异性解毒 功能，而且还具有其他效能，如参与物质代谢、具有生物转化功能、可清除毒性 物质、能分泌具有促进肝细胞生长活性物质等口9 1 。该系统是将培养肝细胞置于 体外循环装置生物反应器中，当患者血液血浆流过生物反应器时，通过半透 膜或直接接触与培养肝细胞进行物质交换，从而起到理想的人工肝支持作用4 0 1 。 肝细胞是生物型人工肝的核心部分，昌前使用最多的是猪肝细胞1 4 ”。由于存在 着种属差异、免疫反应、活性差以及细胞来源困难等问题，其使用受到限制。将 h p 、h d 等与a l s s 相结合，组成混合型生物人工肝( b a l ) ，可使人工肝的生 物合成、转化及解毒功能更加完善 4 2 】，最近已有关于将血液透析滤过、血浆交 换、活性炭吸附等方法与生物型人工肝相结合的研究报道 4 3 , 4 4 l 。 近年来，种基于体外白蛋白透析( e c a d ) 原理制成的a l s s 分子吸 收再循环系统( m a r s ) ( t e r a l d i n a g ，r o s t o c k ，g e r m a n y ) 在欧美受到广泛重 视1 4 。”j 。m a r s 包括三个循环：血液循环，白蛋白循环和透析液循环。高通透 析器膜的一侧与含毒物的血液接触，另一侧为1 0 2 0 的白蛋白透析液。白蛋白 结合毒物及水溶性毒物透过m a r s 膜进入含白蛋白的透析液循环回路中，而透 析液中与自蛋白结合的毒物可通过活性炭吸附或阴离子交换吸附被清除，由此白 第一章文献综述 蛋白透析液得以再生；水溶性小分子物质，如尿素、尿酸、肌酐等通过透析回路 被清除h 7 ，4 8 1 。m a r s 的优点在于血浆不与活性炭或阴离子树脂直接接触，不会 发生凝血因子和蛋白质的吸附和破坏，也不会丢失肝细胞生长因子及其它营养成 分，具有血液动力学稳定、可持续去除中小分子毒物及维持电解质平衡的优点。 m a r s 的不足在于解毒能力不及血浆置换，也不能补充凝血因子，每次治疗的材 料消耗费用较高等。m a r s 人工肝主要用于熏型肝炎的辅助治疗，对伴有血氨增 高、肝性脑病、电解质紊乱及肝肾综合征等的患者较p e 更适合。国外近期把 m a r s 用于治疗多脏器功能衰竭、全身炎性反应综台征等，取得了较好效果【5 。 为了改善体外解毒的传质过程，应用膜技术分离吸附血液中的毒物成为 a l s s 的一个重要发展方向。采用非特异性膜如纤维素膜分离血液中的毒物，虽 然对严重肝脑病患者有一定的效果，但其对于白蛋白结合的毒物分子的去除效率 不高【4 9 1 。另一种方法是制各具有一定孔径的膜，该膜可使白蛋白结合的毒物透 过，其它的生物大分子和血细胞等则被截留。但这种膜对于与白蛋白分子量接近 的有用物质如免疫球蛋白g ( i g g ) 、免疫球蛋e h m ( 1 9 m ) 、高密脂蛋白( h d l p ) 以及纤维蛋白原等截留率不高，造成这些物质的流失【5 叭。总之，分离体系选择 性和特异性低、生物相容性差、传质阻力大等都是亟待解决的问题。亲和膜分离 技术的出现，能够很好的解决这些问题，为膜法a l s s 指出了新的发展方向。 1 2 亲和膜技术研究进展 1 2 1 引言 随着生物工程和生命科学的迅速发展，对生物大分子纯化分离的要求越来越 高。尽管采用传统的分离方法如沉淀、结晶、层析等可使产品获得较高的纯度， 但在很多情况下，存在工艺复杂、活性回收率低等问题。近年来发展的亲和色谱 技术部分解决了这些问题，它是根据生物分子与特定的配基之间的亲和作用发展 起来的。该法具有较高的选择性、特异性和纯化倍数。但是由于传统的亲和色谱 柱采用多孔的粒状填料如葡聚糖、琼脂糖凝胶等作为配基载体，在凝胶颗粒内目 标产物向配基扩散传质的阻力大，分离周期长，有些目标产物和配基结合后必须 在极端的溶液环境下解脱，洗脱时间过长，往往导致配基、目标产物变性失活。 琼脂糖凝胶极易压缩，吸附柱的放大也受到限制【5 ”。膜分离技术的出现和快速 发展，极大地推动了生物大分子的纯化和分离技术的发展【5 2 。膜分离是利用分 子量大小进行分离的技术，其特点是表面积大、扩散路径短、操作压降低、处理 量大。然而这些特点并不能完全满足生物分子的分离与纯化要求。 亲和膜色谱( a m c ) 是膜分离与亲和色谱技术相结合形成的一种新型分离 6 第一章文献综述 纯化技术。亲和膜是以孔径较大的微孔膜作为配基的载体，在膜内外表面偶联配 基，当流体以对流方式流过膜孔时，目标产物与膜上圃载的配基产生特异结合； 而当用洗脱液洗脱时，被吸附的目标产物又能很快解离，因此分离周期短、配基 利用率高，对于具有特异性相互作用的生物分子来说，分离纯化倍数高、不易变 性失活。另外由于膜具有良好的流体透过特性和机械稳定性，所以设备操作压降 低、易于实现规模化纯化分离口3 1 。目前，亲和膜色谱己被广泛应用于干扰素、 单克隆和多克隆抗体、胰蛋白酶及其抑制剂、白蛋白、纤维蛋白等多种生物医药 制品的分离纯化p 。 1 2 2 亲和膜作用原理 1 2 2 1 原理 生物分子大都具有与某一对应分子专一可逆性结合的特性，即亲和作用。亲 和分离技术就是利用生物分子的这种特性而发展起来的一种分离方法：固定其中 一种分子作为配基，去吸附另一种分子，然后采用合适的方法进行洗脱分离。亲 和分离技术的高效特异性，使其成为实验室很多生物活性物质分离纯化的重要手 段【5 4 1 。 卜十古。 6 图1 - 3 亲和膜分离原理 f i g 1 - 3p r i n c i p l eo f a f f i n i t ym e m b r a n es e p a r a t i o np r o c e s s s u b s t a n c e s ：1 m e m b r a n em a 打i ) 【，2 1 i g a n d ，3 a f f i n i t y m e m b r a n e ，4 m i x t u r es o l u t i o n ，5 l i g a n d l i g a t ec o m p l e x , a n d6 t a r g e tm o l e c u l e p r o c e s s e s ：i i m m o b i l i z a t i o n ，i i a d s o r p t i o na n dw a s h 岫g ，1 1 1 e l u t i n g ，a n di v r e g e n e r a t i o n 亲和膜分离过程如图1 - 3 所示。将制得的亲和膜基质组装成膜组件如膜堆或 中空纤维膜。当料液以一定的流速流过膜时，料液中的目标分子在一定条件下， 高度特异性地结合到共价偶联的配基上，形成络合物。其余与亲和膜没有特异性 相互作用的物质被排阻，经清洗后，体系中便只含有亲和膜与目标分子形成的络 合物。然后选择合适的洗脱液，使络合物解离洗脱下来，经过后处理即可得到纯 化的产物。亲和膜介质经再生、平衡后可重复使用。 1 2 2 2 亲和相互作用 第一章文献综述 生物分子之间的作用力包括氢键、静电作用、疏水作用、分子间作用力( 范 德华力) 等，生物分子间的亲和相互作用就是这些作用力的综合表现，由于目标 分子与膜上配基之间的亲和作用而发生吸附现象即为特异性吸附。在a m c 过程 中，特异性相互作用可能表现为亲和作用( 即相当于传统的“锁钥”模型，包括 较强的免疫亲和作用、染料配基的拟亲和作用以及金属离子与氨基酸之间形成的 相互作用力) 、离子交换、疏水作用甚至反相作用等口”。 实际分离过程中由于溶液中其它分子与亲和膜和膜上配基之间的相互作用 力造成的吸附为非特异性吸附。通常，由于膜基质或配基的非极性侧链、基质表 面配基分布不均匀以及非选择性的长链间隔臂等引起的疏水作用，或者由于基质 和配基本身以及活化方法造成的离子交换中心都可能造成非特异性相互作用的 发生。a m c 的基础是亲和膜上的配基分子与目标分子之间的特异性相互作用， 非特异性吸附的发生不仅会使分离过程变得复杂，还会降低产品纯度，因此应该 尽量减小非特异性相互作用的发生p 。 1 2 3 亲和膜分离过程 1 2 3 1 亲和膜分离设备 在用亲和膜分离纯化生物分子时，对亲和膜的要求很高，分离纯化过程中所 用的设备也很特殊。其中最为关键的是要使纯化分离的物质在整个过程中不失 活、不变性，并有尽可能高的回收率。膜分离器是亲和分离的核心部分。原则上 各种形式的膜分离器都可以作为亲和膜分离器，但实际应用中应考虑到亲和膜的 制备和分离过程的各种要求。目前在亲和分离过程中已经得到使用的有平板膜、 中空纤维膜及卷式膜分离器等。 平板膜是使用最为广泛的一种，一般为微孔膜。平板膜分离器结构简单、使 用方便，便于推广。中国科学院化学物理研究所研制了一种膜分离器已经在人血 清白蛋白( h s a ) 的纯化、碱性磷脂酶的分离等方面获得成功的应用口7 1 。在我 们的实验中也将采用这种膜分离器。j i a 等 5 8 1 发明了一种能与高效液相色谱 ( h p l c ) 相兼容的膜分离器，与传统的膜分离器相比，其死体积小、柱效高。 同时能防止泄漏和非均一分布【5 ”。 中空纤维膜具有流动性好、通透量大、操作压力低、样品负荷大的特点。通 常将中空纤维膜束置于陶制管状容器中。卷式膜分离器采用径向流动的方式，配 基利用较为充分，同时亲和容量也可p j 根据膜的缠绕圈数调节，已经在h s a 等 生物大分子的分离纯化中得以应用。此外还有d e g e n 等设计的折叠式亲和膜分 第一章文献综述 离器1 6 0 1 ，m i l l i p o r e 公司研制的小型蝶式分离器等。 1 2 3 2 亲和膜操作方式 根据所使用的膜分离装置的不同，亲和膜分离的操作方式也有所不同，常用 的有死端( d e a d e n d ) 、错流( c r o s s f l o w ) 以及径向流动( r a d i c a lf l o w ) 方式等。 错流方式下，溶液循环流过膜一侧，大分子被滞留，同时在压力的驱动下，小分 子及溶剂则会透过膜。中空纤维膜分离器通常采用这种操作方式。而死端操作方 式则常用于平板膜的亲和分离过程。两种操作方式的流体力学性质相似。研究结 果表明，两种操作方式下，与膜厚和分散系数( d i s p e r s i o n c o e f f i c i e n t ) 相关的心 数( p e e l e r 数) 和传质系数( m a s s t r a n s f e rc o e f f i c i e n t ) 基本处于同一数量级垆”。 径向流动法通常用于卷式亲和膜分离器中。其主要优点在于可增加样品溶液与膜 的接触面积。 1 2 3 - 3 洗脱和再生 亲和膜操作时，除要选择适宜的加料速度和操作温度外，洗脱方式的选择、 洗脱液的组成亦是分离成败的一个重要因素。洗脱可分为特异性洗脱和非特异性 洗脱。特异性洗脱是在洗脱液中加入对配基有更强亲和力的物质，将目标蛋白质 置换下来。而改变缓冲溶液中的盐浓度、p h 值、温度等的洗脱过程则属于非特 异性洗脱。非特异性洗脱较为经济，但会导致纯度下降以及产品的变性失活。实 际应用时，应根据体系的性质加以选择。 由于亲和膜分离对膜的要求高，通常其制备过程比较复杂。通过洗脱再生增 加膜的使用次数可以大大降低成本。亲和膜的再生，不仅要求再生过程简便易行、 所用洗脱液便宜，再生过程不引起膜的化学、物理性较大的变化，同时还要求再 生膜具有较大的吸附容量、不致引起生物分子的变性失活等。 1 2 4 亲和膜的制备 理想的亲和膜应该满足以下基本要求：结构均匀、具有高的孔隙率、较大的 内外表面积；较高的化学、生物、机械稳定性；一定的亲水性、低的非特异性吸 附；存在可反应的基团、高结合容量；耐溶剂冲洗；成本低、复用性好：化学无 毒：便于贮存并在一定时间内性质不发生明显的变化等旧】。 亲和膜分离最重要的环节是亲和膜的制备，膜材料的选择与制备是影响 a m c 的主要因素。其制备过程包括膜材料的选择、膜基质的制备、活化以及间 隔臂、配基的固载化等。 m i l l i p o r e 产品目录。 第一章文献综述 1 2 4 1 亲和膜材料及其改性 膜基质材料的获得主要是通过直接对材料进行加工制膜和在成膜上进行化 学改性两种方式。按照膜材料来源可将亲和膜基质材料分为天然材料与人工合成 材料两大类。天然高分子材料主要包括纤维素、多糖介质及其衍生物等，这类材 料一般都具有良好的生物相容性和亲水性，并且含有大量的活性基团，是良好的 亲和膜基质材料，但往往难于成膜，并且其强度和材料的物理结构差，因此其应 用受到限制。人工合成的高分子材料包括聚砜( p s ) 、聚酰胺、聚乙烯以及一些 无机材料如多孔硅胶、金属氧化物、玻璃等介质。这些材料具有良好的机械、化 学稳定性。良好的成膜性能，而且制膜过程中，膜的物理结构可控。但是材料生 物相容性、亲水性差、表面活性基团含量少，因此使用中需要加以改性。以下对 这两类材料作综合评述。 纤维素是自然界中存在最为广泛的一种天然高分子材料，其衍生物包括乙酰 纤维素、硝基纤维素、羟乙基纤维素( h e c ) 等都已经广泛应用于亲和膜的制备。 例如，再生醋酸纤维素或硝基纤维素膜可以通过相转化的方法得到，再通过交联 结合配基后制成离子交换膜6 3 ，删；g u o 等删采用滤纸作为基质，交联后制备了 大孔纤维素膜，其孑l 径为1 - 2 岬，孔隙率约为6 0 。由于纤维素的半结晶结构， 使其具有相当的机械强度，但同时这种结构也妨碍了功能基团的引入，因此配基 含量少，吸附容量低。在纤维素中加入一定量的其它材料如将缩水甘油甲基丙烯 酸酯( g m a ) 、壳聚糖( c t s ) 等制备复音膜可以在很大程度上改进膜的性能1 6 “j 。 c t s 也是一类常用的天然制膜材料之一，其成膜性能良好，亲水性、化学和机械 性能良好，并具有很高的反应活性。多用相转化法、溶出法等制膜( 聚乙二醇、 硅胶粒子作为致孔剂) 6 9 - 7 1 】。 人工合成材料中应用较多的主要有尼龙和聚砜：尼龙微孔滤膜机械性能良 好，孔径分布窄。但端氨基少，而且由于疏水性和混合离子结合位点作用使得非 特异性吸附严重”2 j ：聚砜具有良好的成膜性、热稳定性和生物稳定性，分子结 构上含有可化学改性的基团，因此有利于引入取代基团，制成各种改性膜而不改 变膜的结构【7 。此外还有聚丙烯、聚乙烯、聚丙烯腈、三羟甲基酰胺以及一些 无机材料等。由于这些材料通常都是疏水性的，且能够用于生物分离的活性基团 较少，因此其改性主要集中在改善材料的亲水性和增加活性功能基团两方面，通 常是对聚合物表面进行生物化处理【7 4 ，7 5 j 和偶联多羟基、氨基的物质如h e c 、c t s 、 葡聚糖、聚乙烯醇( p v a ) 等7 2 ，7 6 越 。经过改性后，膜的亲水性大大增强，膜上 活性基团的含量也大为增加，膜上的羟基和氨基可以进一步固载化配基。 另一类人工合成材料是直接用含有大量活性基团的材料应用接枝、共聚后制 膜。例如g m a 与乙烯基二甲基丙烯酸酯膜( e d m a ) 共聚制各大孔 第一章文献综述 p ( g m a