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酸性蛋白酶产生菌的选育及其在 羊毛减量细化中的应用 摘要 用含有酪蛋白的初筛筛选培养基与含有羊毛部分水解液的复筛 筛选培养基，主要以蛋白酶对羊毛的减量能力来衡量蛋白酶的活力， 从烂羊毛中筛选出9 株菌株，用这9 株菌株发酵产生的酸性蛋白酶对 羊毛有一定的减量细化作用。以这9 株菌株中产酸性蛋白酶活力较高 的三株菌株d h - 1 、d h 一5 、d h - 8 以及本实验室保藏的产酸性蛋白酶的 菌种a s p n i g e r6 0 1 为出发菌株。用亚硝基胍对其进行诱变处理，得 到一株产酸性蛋白酶活力更高的菌株并命名为d h - c 4 ，用其发酵产生 的酸性蛋白酶适合羊毛减量细化。对菌株d h - c 4 发酵产酸性蛋白酶的 条件进行考察，发现在发酵温度为3 2 、发酵时间为8 0 h 时，所产 酸性蛋白酶的活力最高。 对用菌株d h - c 4 发酵所得酸性蛋白酶的性质进行考察，其最适作 用温度为4 0 、最适作用p h 值为3 0 。一些金属离子如z n 2 + ，对所 制酸性蛋白酶有明显的抑制作用，而n i 2 + 、c a 2 + 、m 9 2 + 在低浓度下可 以提高其活力。一些多羟基物质及表面活性剂虽然对自制酸性蛋白酶 的活力没有明显影响，但是它们在一定的条件下能够提高其对羊毛的 减量能力。 分别用自制酸性蛋白酶、市售酸性蛋白酶及碱性蛋白酶对羊毛进 行减量细化，结果发现单独用蛋白酶处理羊毛纤维，减量效果并不好。 用h z o 。对羊毛纤维进行氧化预处理或用n a h s o 。对羊毛纤维进行还原预 处理后，蛋白酶对羊毛纤维的减量得到一定的提高，但这种先预处理 后蛋白酶处理即“两步法”增加了羊毛减量细化的成本。采用“一浴 法”即用氧化剂h 2 0 。或还原剂n a h s o 。与蛋白酶同时作用，可大大提高 蛋白酶对羊毛纤维的减量作用，但也造成羊毛纤维强力较大的损失9 通过处理后羊毛扫描电镜图可以看出：在对羊毛纤维水解减量 时，蛋白酶容易从羊毛结构疏松区和无定形区进入羊毛纤维内部进行 催化水解，造成处理后羊毛纤维弱节；另外，因蛋白酶催化反应的专 一性，对羊毛纤维的催化水解并不是均匀的。这也引起了处理后羊毛 纤维强力较大的损失。对羊毛纤维预先浸n i c l ：处理，用保护剂进行 保护预处理，可提高蛋白酶对羊毛纤维处理均匀性，对减小强力损失 有一定效果。 在蛋白酶对羊毛纤维进行减量细化中，发现羊毛经碱性蛋白酶处 理后，强力损失比较大。与市售酸性蛋白酶相比，在相同的条件下， 自制的酸性蛋白酶对羊毛的减量大，而强力损失比较小，因此，自制 的酸性蛋白酶更适合羊毛的减量细化。 对羊毛水解液进行初步利用，用其制成的洗发水洗发后，头发有 光泽、柔软又富有弹性。羊毛水解液在制造营养洗发水、在化妆品方 面具有很大的应用价值。 关键词酸性蛋白酶，菌种选育，羊毛，减量，细化 s c r e e n i n go fs t r a i np r o d u c i n ga c i d p r o t e a s ea n di t sa p p l i c a t i o n i ns l e n d e l u n gw o o l a bs t r a c t n i n es t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mp u t r i dw o o lt h r o u g hs c r e e n i n g t h e p r i m a r y s e l e c t e dm e d i u mc o n t a i n s c a s e i n ；t h er e s e l e c t e dm e d i u m c o n t a i n sh y d r o l y s i sl i q u i dw h i c hw a so b t a i n e db yh y d r o l y z i n gw o o l p a r t l y t h 一a c t i v i t yw a sm a i n l y 。b yi t sa b i l i t yydrolyzinge e n z y m ea c t i v i t ym a i n l ym e a s u r e db yt sa b i l i t yo fh v d r o l v z i n g i w 0 0 1 t h ea c i dp r o t e a s ew h i c hw a sp r o d u c e db yt h e s en i n es t r a i n s b y f e r m e n t a t i o nw a ss u i t e df o rs l e n d e r i n gw 0 0 1 t a k et h r e eo ft h es e l e c t e d s t r a i n sd h 一1 ，d h - 5 ，d h 一8a n da s p n i g e r6 01 a sp r i m a r ys t r a i n s t h e e n z y m ea c t i v i t yo ft h ea c i dp r o t e a s ep r o d u c e db yt h e s et h r e es t r a i n sw a s v e r yh i g h a s p n i g e r6 0 1w a sp r e s e r v e db yo u rl a bw h i c hc o u l dp r o d u c e a c i d p r o t e a s eb yf e r m e n t a t i o n t r e a t e dt h ef o u rs t r a i n s b y 1 - m e t h y l - 3 - - n i t r o 一1 - n i t r o s o g u a n i d i n ef n t g ) ；as t r a i nw a sa c q u i r e da n d n a m e dd h - c 4 t h ea c i dp r o t e a s ep r o d u c e db yd h - c 4w a so fh i g h a c t i v i t ya n ds u i t e df o rh y d r o l y z i n gw o o lf i b e r p r o d u c t i o no fa c i dp r o t e a s e b yd h c 4u n d e rl i q u i ds t a t ef e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e d ；t h ea c i dp r o t e a s e g o ti t s m a x i m u me n z y m ea c t i v i t yu n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n so f t e m p e r a t u r e ( 3 2 。c ) ，o f t i m e ( 8 0 h ) t h ep r o p e r t i e so ft h ea c i dp r o t e a s ep r o d u c e d b yd h - c 4w e r es t u d i e d i t so p t i m u mt e m p e r a t u r ei s4 0 ca n dp h3 0 s o m em e t a li r o n sl i k ez n + e x e r t e dai n h i b i t i o nt ot h ea c i dp r o t e a s e ；s o m ei r o n ss u c ha sn i 2 + 、c a + 、 m 9 2 + c o u l da c t i v et h ea c i dp r o t e a s e s o m ec h e m i c a l sw i t hp o l yh y d r o x y l s a n ds u r f a c e a c t i v ea g e n t sh a dn oa p p a r e n te f f e c to nt h ee n z y m ea c t i v i t y , b u t t h e yc o u l dh e l pt h ea c i dp r o t e a s et oh y d r o l y z ew o o lf i b e r w o o lf i b e rh y d r o l y z e db yd i f f e r e n tp r o t e a s e ，t h eh o m e m a d ea c i d p r o t e a s ew h i c hi sp r o d u c e db yd h - c 4b yf e r m e n t a t i o n ，t h ea c i dp r o t e a s e s o l di nm a r k e t ，t h ea l k a l i n ep r o t e a s e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep r o t e a s e a l o n ec o u l dn o th y d r o l y z ew o o lf i b e rw e l l ；t h e h y d r o l y s i sc o u l db e e n h a n c e dt h r o u g h p r e t r e a t i n g t h ew o o lb yh 2 0 2o rn a h s 0 3 t h i s “t w o - s t e pm e t h o d t h a tf i r s tp r e t r e a t m e n tt h e nt r e a t e db ye n z y m ea d d e d t h ec o s to f t r e a t i n gw 0 0 1 t a k e “o n e - b a s i nm e t h o d t h a ta d dp r o t e a s et o g e t h e rw i t hh 2 0 2o r n a h s 0 3t ot h es o l u t i o nt ot r e a tw 0 0 1 b yt h i sm e t h o dt h ew o o lw a s s l e n d e r e dg r e a t l y , b u tt h es t r e n g t h - l o s sw a s v e r yh i g h f r o mt h ep i c t u r eo fw o o lt a k e ns c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ，i tc a n b eo b s e r v e dt h a tt h ep r o t e a s et e n d e dt oe n t e rt h ei n n e ro ft h ew o o lf i b e rt o c a t a l y s tt h er e a c t i o n i na d d i t i o n ，a st h es p e c i f i c i t yo fe n z y m e ，t h e p r o t e a s ec o u l dn o th y d r o l y z et h ew o o lf i b e re v e n l y i ta l s oc a u s e dt h e s t r e n g t h l o s s p r e t r e a t i n gt h ew o o lf i b e rb yn i c l 2o rp r o t e c t i v ea g e n t ，i t h e l p e dt h ep r o t e a s et oh y d r o l y z ew o o lf i b e re v e n l y ；i tw a sh e l p f u lt o r e d u c et h es t r e n g t h l o s s i nt h es t u d yo fs l e n d e r i n gw o o lf i b e rb yp r o t e a s e ，i tw a sd i s c o v e r e d t h a tt r e a t e db ya l k a l i n e p r o t e a s e ，t h ew o o l ss t r e n g t h l o s sw a sh i 曲 c o m p a r e dt oa c i dp r o t e a s es o l di nm a r k e t ，t h eh o m e m a d ea c i dp r o t e a s e c o u l do b t a i nh i g hw e i g h t - l o s sw h i l et h es t r e n g t h - l o s sw a sl o wa tt h es a m e c o n d i t i o n s ot h eh o m e m a d ea c i dp r o t e a s ew a sm o r es u i t e df o rs l e n d e r i n g w 0 0 1 i na d d i t i o n ，t h eh y d r o l y s i sl i q u i do fs l e n d e r i n gw o o lw a su s e dt o m a k es h a m p o o w a s h e db yt h es h a m p o o ，t h ea i rw a sb r i g h t ，s i l k e n ，a n d f u l lo ff l e x i b i l i t y i ti s p r o s p e c t i v et oa p p l y t h es o l u t i o ni n m a k i n g s h a m p o o a n dc o s m e t i c z h a n gy a n g ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) s u p e r v i s e db yc h e nd e z h a o k e yw o r d s ：a c i d p r o t e a s e ，b r e e d i n g ，w o o l ，w e i g h t - l o s s ，s l e n d e r i n g 硕士学位论文 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导 师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲 自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：认蜘 日期：m 年厂月日 硕士学位论文 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密曰，在三年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名：吼弋 场 指导教师签名： 日期：m i 年j 月6 日 2 e 啪训l 日期：p 巧年，月日 东华大学硕士生研究论文 1引言 第一章前言 羊毛是一种重要的纺织原料，它具有弹性好、吸湿性强、保暖性好、不易 玷污、光泽柔和等优良特性，这些特性使毛织物具有广泛的用途一1 。近年来， 随着人们生活质量的提高和消费理念的转变，衣着的厚重保暖观念已经淡化， 人们对服装的追求是美观大方、轻便舒适、高档化及功能化等口1 ，这种变化要 求羊毛织物轻薄化。发展细支羊毛及超细支羊毛是满足服装轻薄化的基础。自 然界中生长的超细羊毛纤维( 直径小于1 9 “m ) 主要产在澳大利亚，又因为细 支羊毛及超细支羊毛的生产能力低、成本高，不能满足人们的需求h 1 ，于是， 羊毛的人为加工细化成为人们关注的问题。在羊毛细化的研究中，人们研究较 早的是减量细化哺3 。传统的化学减量法因使用了氯，会产生可吸附的有机氯化 物和环氧丙烷等有害物质，造成严重的环境问题，对人体也有不可逆的侵害， 这一方法已经受到许多限制呻7 1 7 1 。羊毛的酶法细化作为一种“清洁、无污染” 的绿色加工技术，备受人们关注。目前，已有市售纺织用蛋白酶，但多数为碱 性蛋白酶。用碱性蛋白酶处理羊毛很容易造成羊毛纤维较大的强力损失，不利 于羊毛的后加工处理。与碱性蛋白酶相比，酸性蛋白酶对羊毛的水解相对比较 温和，显示出其在羊毛处理应用上的优势。现在羊毛蛋白酶细化的研究多集中 在蛋白酶的复配、羊毛预处理工艺的优化、蛋白酶处理工艺的优化方面阳】，而 对羊毛细化所用的蛋白酶产生菌的研究比较少。 1 1 羊毛的组成 羊毛纤维属于天然蛋白质纤维，其基本组成物质是线性蛋白质。其中蛋白 质占羊毛总重的9 7 以上m 。从化学组成来看，羊毛纤维是一类复杂的蛋白质 东华大学硕士生研究论文 化合物，这类蛋白质化合物称为角质蛋白，角质蛋白属于高分子化合物。在各 种蛋白质中都含有碳、氢、氧、氮四种元素，而这种角蛋白和其它角蛋白的主 要区别就在于它含有较多的硫，硫在羊毛中主要存在于胱氨酸和蛋氨酸中口们。 测试结果表明：羊毛纤维是由大约二十种不同a 一氨基酸构成的，其中含量较 高的有胱氨酸、谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、苏氨酸和酪氨酸，而最主要的还要 算胱氨酸，胱氨酸含有二硫键，对坚固鳞片层的形成起着重要作用。 1 2 羊毛的形态结构 在组织结构上，羊毛纤维是由一些微小盼单细胞组成。羊毛纤维可分为鳞 片层、皮质层和髓层三层结构，它们的细胞由细胞间质c m c ( c e l lm e m b r a n e c o m p l e x ) 相互隔离n 1 1 。 鳞片层是羊毛纤维的最外层，是由鳞片细胞形成的“鳞片形状的薄的外 壳，约占羊毛总量的1 0 。鳞片细胞呈扁平状，无核，其排列类似屋顶上的瓦 片，一个重叠一个。因鳞片的边缘从纤维的表面突出，所以，由纤维的尖端到 根端的方向有一定的摩擦力。羊毛鳞片层由鳞片表层、鳞片外层和鳞片内层组 成。鳞片表层以连续性的外膜包围在整个鳞片层的表面，主要含有磷脂化合物、 角质化蛋白质及一些 少量碳水化合物，具 有极好的化学惰性， 耐一般化学物质的作 用n 耵；鳞片外层是典 型的角质化蛋白，胱 氨酸残基含量相当丰 富，是羊毛结构中含 硫量最高的部位，其 细瞻间质 图1 - 1 羊毛鳞片层形态结构n 幻 b 层 片内屡 结构紧密，难以膨化；鳞片内层属于非角质蛋白，其极性基团如- c o o h 、- n h a 含量相当丰富，因而化学性质活泼，膨润性极高，对化学试剂敏感。 皮质层位于鳞片层的里面，它是羊毛纤维的主体部分，皮质层由锭状的角 质化细胞构成，含有在活细胞时期的细胞核残余。 2 东华大学硕士生研究论文 髓层位于羊毛纤维中央，为海绵状角质，由菱形、立方形或多角形细胞组 成，髓层常因纤维的直径不同而所占的比例也不同，一般情况下，纤维越细， 髓层越少或无髓，纤维越粗，髓层越多。 c m c 结构存在于羊毛细胞之间( 包括鳞片细胞和皮质细胞) 之间，在整 个羊毛结构中呈网状分布，是羊毛细胞连接的桥梁，因而对羊毛纤维的机械性 能起着至关重要作用n 羽。 羊毛纤维的坚牢度和机械性质、纺纱性和粘合性以及羊毛的光泽与羊毛的 鳞片层结构有很大关系，因此，羊毛的鳞片层是羊毛纤维细化改性的主要对象。 1 3 羊毛细化方法 细羊毛的获得，早期主要通过选择细羊毛的羊种饲养和增加其存栏只数与 单产，但羊毛细化步骤缓慢，且只是增加了1 8 2 0 i - t m 羊毛的产量。目前，获得 细化羊毛主要有两种方式：拉伸细化与减量细化。 1 3 1 拉伸细化 羊毛拉细细化技术是九十年代羊毛科学和工业中的前沿技术，以澳大利亚 联邦工业与科学研究院( c s i r o ) 的研究为代表。拉伸细化法以不破坏纤维鳞 片为前提，对纤维施以预处理、拉伸和定形，以达到改变纤维分子间结构，并 使整体纤维变细伸长。羊毛纤维肽链主要呈n 一螺旋结构，肽链间有相当数量 的二硫键形成的网状结构，此外还有盐式键和氢键，这些键使肽链保持稳定的 空间结构。当破坏这些键的作用并施以外力拉伸时，羊毛纤维肽链可由a 型转 变成伸长的d 型结构，这些键在新的位置上重新建立起联系并固定下来，达到 伸长拉细的效果。羊毛拉伸细化在生产应用中还有许多具有相当难度的问题需 要研究，而且拉伸细化后羊毛的性质有很大的变化，在纤维的应用、纺织加工 和染整处理均存在许多技术问题h j 副。 1 3 2 减量细化 羊毛减量细化是利用化学物质对羊毛纤维的作用，使羊毛纤维部分被剥除 而达到细化效果。传统的减量细化方法是羊毛毛条的氯化一h e r c o s e t t 减量工 东华大学硕士生研究论文 艺，主要是利用氧化剂( c 1 2 、d d c a 等) 的氧化氯化作用对羊毛鳞片层中的二硫 键进行氧化水解反应，同时主链肽链也被氧化断裂，羊毛纤维被破坏、部分剥 除而变细。但是，这种传统的氯化处理技术由于使用大量含氯物质，产生的可 吸收卤化物和环氧丙烷等有害物质，毒性很高，造成严重的生态环境污染，对 人体也有不可逆的侵害阳 坩】。 利用蛋白酶对羊毛进行减量处理并不是近年来才出现的新技术，早在1 9 4 1 年m i d d l e b r o o k 和p h i l l p s 就报道了用蛋白酶对羊毛进行处理以达到防毡缩效果 的研究成果n 。由于当时生物技术的局限，酶的品种极少而且价格昂贵，酶 处理技术未能获得进一步推广。近年来，随着生物技术的飞速发展，酶的品种 不断增加，价格不断下降，不但可以大规模的生产各种高性能酶，还可以按照 需要设计、培养和提取具有特殊功能的酶，为酶的广泛应用奠定了基础。国内 外研究人员对羊毛蛋白酶处理中蛋白酶的选择、工艺条件、影响因素、以及处 理后羊毛的各项性能的改变报道较多。由于酶作用的专一性以及羊毛结构的特 殊性，蛋白酶的选择在羊毛减量处理过程中显得尤为重要。在蛋白酶的选择方 面，研究多集中在已有的市售蛋白酶上，而在通过菌种选育获得适合羊毛减量 细化的酸性蛋白酶方面的研究还比较少。 2 本课题的主要目标、研究内容、创新点及选题的意义 2 1 本课题的主要目标 本课题的主要目标为： ( 1 ) 筛选得到一株菌种，用该菌种发酵产生的酸性蛋白酶对羊毛减量细 化有很好的效果。因酶催化反应具有专一性特点，不同的蛋白酶对羊毛的减量 细化效果不同，有时甚至差别很大。因此，在用蛋白酶对羊毛进行减量细化时， 对蛋白酶的选择十分重要。目前，市售纺织用蛋白酶大多是碱性蛋白酶，对羊 毛纤维有较大的破坏作用。因此，筛选得到一株适合羊毛细化的酸性蛋白酶产 生菌显馒十分必要而有意义。微生物具有易变异、适应性强特点，并且代谢产 物比较广泛，这就为我们筛选适合羊毛细化的蛋白酶产生菌提供了可能与依 据。采用添加了羊毛粉及羊毛部分水解液的特殊培养基，从烂羊毛中筛选适合 4 东华大学硕士生研究论文 羊毛细化的酸性蛋白酶产生菌。另外，还可对所得的菌株进行诱变，以获得产 酸性蛋白酶性能更好的菌株。 ( 2 ) 影响羊毛酸性蛋白酶减量细化效果因素的考察。在用酸性蛋白酶对 羊毛进行减量细化的过程中，许多因素对减量细化的效果有影响。这些因素主 要有：酸性蛋白酶的用量、处理温度、处理时间、处理液p h 值、浴比等。另 外，一些化学物质及表面活性剂对减量细化效果也产生一定的影响。考察这些 因素影响羊毛酸性蛋白酶减量细化的原因，研究酸性蛋白酶对羊毛纤维减量细 化的过程与机理。 ( 3 ) 水解液的利用。酸性蛋白酶对羊毛纤维减量细化的水解液可用作菌 株发酵产酸性蛋白酶的发酵培养基，水解液主要为较低分子的蛋白质和氨基酸 类，具有较高的利用价值，可将其用于生产营养护肤品、洗发用品等。 2 2 本课题的研究内容 本课题的主要研究内容分为三部分：一部分是产适合羊毛细化的酸性蛋白 酶菌种的选育，另一部分是所制得的酸性蛋白酶在羊毛减量细化中应用的研 究，第三部分为羊毛水解液的利用。 在菌种选育方面，考虑到筛选所得的菌株发酵产生的酸性蛋白酶适合羊毛 减量细化。主要以酸性蛋白酶水解羊毛的能力来衡量酸性蛋白酶酶活力，采用 加入羊毛粉或羊毛部分水解液的特殊筛选培养基，从烂羊毛中筛选适合羊毛减 量细化的酸性蛋白酶产生茵。为了提高菌株发酵产酸性蛋白酶的能力、改善菌 株发酵产酸性蛋白酶的性能，对筛选所得到的菌种及已有酸性蛋白酶产生菌 a s p n i g e r6 0 1 用亚硝基胍进行诱变处理，筛选产酸性蛋白酶性能更好的菌株。 在利用微生物发酵生产酸性蛋白酶中，考察发酵温度、发酵时间对产酶的影响， 考察温度、p h 值、金属离子、表面活性剂等对酸性蛋白酶活力的影响。 在影响羊毛酸性蛋白酶减量细化因素的考察方面，于酸性蛋白酶最适作用 温度、p h 值下，用自制酸性蛋白酶、市售酸性蛋白酶、碱性蛋白酶对羊毛进 行减量细化，测定减量率、处理后羊毛的细度、强度等，综合考察酶加入量、 处理时间、浴比、表面活性剂的选择及不同处理工艺对处理效果的影响。为了 减少工序将预处理与酶处理合为一步即采用“一步法 对羊毛进行水解。 东华大学硕士生研究论文 对于水解的液利用，一方面，将水解液用作产酸性蛋白酶菌种发酵培养基 的一部分：另一方面，因水解液主要是短链多肽和氨基酸，具有营养价值和功 能，可用水解液制备营养洗发水、化妆品等。 2 3 本课题的创新点 本课题的创新点主要有三点： ( 1 ) 从酸性蛋白酶产生菌菌种选育出发，主要是用自制的酸性蛋白酶对 羊毛进行减量细化。 目前，在用蛋白酶对羊毛进行细化研究中，人们研究主要集中在市售的不 同蛋白酶酶种的选择、羊毛预处理工艺、羊毛酶处理工艺方面。羊毛是一种蛋 白质纤维，可以被蛋自酶催化水解，但是，因氨基酸组成及序列差别，肽链空 间结构的不同，不同的蛋白质之间有时存在着很大的差别，又因为酶催化反应 具有很强的专一性，因此，不同的蛋白酶对羊毛纤维的水解能力、水解方式相 差很大。本课题从蛋白酶产生菌菌种选育出发，筛选适合羊毛减量细化的酸性 蛋白酶产生菌，利用制得的酸性蛋白酶对羊毛纤维进行减量细化。 ( 2 )通过对一些因素影响羊毛蛋白酶减量细化效果的考察，研究酸性蛋 白酶对羊毛减量细化的过程与机理。 因羊毛的结构非常复杂，又由于羊毛纤维表面有高度交联的二硫键，能阻 碍蛋白酶大分子进入羊毛纤维内部进行催化反应，因此，只靠蛋白酶的作用是 非常困难。在没有其他化学助剂的活化作用下，蛋白酶主要从纤维表面最薄弱 的地方进攻，直到把碎块从纤维表面剥离，因此必须研究化学预处理的化学助 剂和处理工艺，尽可能地将羊毛纤维表面的胱氨酸转化为半胱氨酸。采用氧化 和还原两种不同的打开羊毛纤维表面的胱氨酸二硫键的方法。为减少工序，用 氧化剂或还原剂与蛋白酶同时处理羊毛，提高处理效果。 ( 3 ) 对羊毛细化副产物进行利用。 用酸性蛋白酶对羊毛纤维进行减量细化，副产物主要为较低分子的蛋白质 和氨基酸类。它们具有较高的利用价值，可用于生产营养护肤品、洗发用品等。 另外，水解液用作菌株发酵产酸性蛋白酶的发酵培养基。与化学细化法相比， 由于副产物的利用，不仅没有废水污染，而且降低了羊毛蛋白酶细化成本。 6 东华大学硕士生研究论文 2 4 选题的意义 本课题涉及到生物、纺织、化学学科，是生物技术在纺织领域的应用。近 些年，随着人们环保意识的增强及对自身健康的重视，纺织品绿色加工的浪潮 正在兴起，对羊毛用蛋白酶处理改性来代替目前产生大量有毒物质的羊毛氯化 改性方法已是大势所趋。在目前羊毛改性处理研究中，大都集中在酶种的选择、 预处理工艺的选择、处理工艺条件的优化方面，而在蛋白酶产生菌选育方面的 研究非常少。本课题从菌种选育出发，然后用所得菌种发酵产生的酸性蛋白酶 对羊毛进行减量细化，它是生物技术在纺织领域应用的深入，将扩大生物技术 的应用范围，将扩展纺织“绿色加工”的领域，对生物学科与纺织学科的交叉 与融合也有一定的促进作用。 通过羊毛酸性蛋白酶减量细化的研究，可以认识蛋白酶催化水解反应的 过程，进一步认识酸性蛋白酶对羊毛减量的机理。另外，羊毛经过酸性蛋白酶 减量细化后，许多性能得到改善，品质得到提高，将产生一定的经济效益。 7 东华大学硕士生研究论文 1引言 第二章酸性蛋白酶产生菌的选育 蛋白酶是酶制剂工业的重要酶种，广泛应用于饲料、皮革、医药和酿造中， 具有广泛的市场潜力n 羽。近年来，蛋白酶在纺织工业上的应用也越来越广泛， 用蛋白酶代替氯化工艺已经成为羊毛防毡缩的热点，用蛋白酶对羊毛进行处 理，不但可以取得一定防缩效果，而且处理后羊毛的性能得到改善，如提高了 染色速率，提高了染料的上染率，降低染色温度n 钉。在生丝脱胶方面，蛋白酶 对生丝的丝胶具有较大的水解能力，而对生丝的丝素没有水解活力或者水解活 力很低，所以蛋白酶对丝素的损伤要比碱精练小的多，精练产品富有弹性，手 感、光泽均有明显的提高。由于蛋白酶对丝素的水解仅可能集中在表面，真丝 织物经蛋白酶处理后，机械强度损伤相对较小，而且微绒比较均一，形成比较 好的砂洗效果。通过蛋白酶复洗处理，可以消除或减缓纤维素返旧整理中的返 沾色程度n 羽。 1 1酸性蛋白酶的性质与分类 蛋白酶是指能催化水解蛋白质肽键的一类水解酶。根据其水解肽键位置的 不同可分为内肽酶( 内切酶) 与端解酶( 外切酶) ；根据其作用的最适p h 值 不同又可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶汹一。 酸性蛋白酶在许多方面与动物胃蛋白酶和凝乳蛋白酶相似，其最适作用 p h 值为2 6 ，分子量3 0 0 0 0 - - 3 5 0 0 0 ，等电点较低( p h 3 5 ) ，大多数酶在其活性 中心含有两个天冬氨酸残基船羽。 多数酸性蛋白酶在p h 2 5 范围内稳定，若在p h 为7 、温度7 0 ，处理3 0 分钟后立即失活。斋藤曲霉酸性蛋白酶在p h4 0 的培养液中稳定，但在p h 为 2 7 ，温度3 0 可引起严重的失活效应，从溶液中游离氨基酸的增加，可以看 出酶的失活是由于自溶，在p h6 7 酶发生变性失活，添加2 m o l l 1 的n a c i 8 东华大学硕士生研究论文 可以增加酶的稳定性2 4 】。 一般霉菌酸性蛋白酶在5 0 以上很不稳定，斋藤曲霉酸性蛋白酶在p h 5 5 ， 温度5 0 ，黑曲霉3 3 5 0 的酶在p h 2 5 、温度6 0 处理2 0 分钟可引起完全失 活。但是紫微青霉酸性蛋白酶在6 6 ，杜邦青霉k 1 0 1 4 酸性蛋白酶在6 0 历 时一小时仍不会失活，黑曲霉大孢子变异株d b d 0 4 0 6 酸性蛋白酶a ，其适应 温度为7 0 。c 。有些酸性蛋白酶不耐低温，许多酸性蛋白酶分子中含有5 1 0 多糖对酶稳定性有益乜毛嚣】。 酸性蛋白酶根据来源不同可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白 酶；根据其活性温度的高低又可以分为高温蛋白酶、中温蛋白酶和低温蛋白酶。 酸性蛋白酶按其性质不同可分成四种类型，如表2 1 所示： 表2 - 1 酸性蛋白酶的分类阱1 1 2 产酸性蛋白酶微生物的来源及微生物产酶的特点 在酶制剂工业发展早期，酶多取自动植物原料，但是它们的生长周期长、 同时还受地理、气候和季节等各种因素的限制，不适于大规模工业生产，近年 来，都转向微生物发酵制取酶乜。能够产生蛋白酶的微生物菌种分布很广，属 于原核生物和真核生物的许多微生物都能用于蛋白酶制剂的生产。往往许多微 生物在产生蛋白酶的同时还产生别的酶。如黑曲酶( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 即能产 9 东华大学硕士生研究论文 生蛋白酶，又能产生淀粉酶和纤维素酶，即使是蛋白酶，实际上也是多种酶的 混合物心5 j 。 酸性蛋白酶是酶制剂工业的重要酶种。许多真菌酸性蛋白酶已经提纯并进 行了鉴定。商品酸性蛋白酶的生产菌主要是黑曲霉、黑曲霉大孢子变株、斋藤 曲霉根菌、杜邦青霉、血红色陀螺孔菌和微小毛霉( 凝乳酶) 等少数菌种。其 中高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉、斋藤曲霉根霉、青霉、拟青霉以及米 曲霉、血红色陀螺孔菌、粘红酵母等汹脚1 。 利用微生物产酶有以下优点乜“驯： ( 1 ) 微生物产酶种类繁多，凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找 到，可根据应用特点和要求，筛选出最佳的产酶菌种。 ( 2 ) 可以通过改变微生物的遗传性质和优化培养条件而大大提高产酶水 平，通过产酶菌种的选育，可以使产酶活力提高成百上千倍。 ( 3 ) 微生物发酵的生产周期短，培养基价格低廉，酶制剂可以大规模、低 成本的工业化生产。 ( 4 ) 微生物的筛选方法比较简单，而且已经成熟，因此有可能在较短的时 间内从成千上万个菌株中筛选出高产菌种。 ( 5 ) 微生物发酵生产的酶比活比较高，有利于酶的分离与提纯。 1 3 诱变育种剐幻 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵产品的产量和质量 有较大的改善，首先必须选择性能优良的生产菌种。菌种选育包括根据菌种自 然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法，人为引起的菌种 变异或基因重组，如诱变育种、杂交育种，原生质体融合和基因工程等技术。 自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防治菌种退化，稳 定生产，提高产量的目的。但是自然选育的效率低，因此经常于诱变选育交替 使用，以提高育种效率。 诱变育种是基于基因突变的菌种改良。其理论基础是遗传性状的变异，包 括染色体基因突变和染色体外基因的突变，前者指染色体结构改变和染色体数 目的改变；后者指质粒等染色体外遗传因子的变化。 i o 东华大学硕士生研究论文 诱变育种主要通过物理诱变剂和化学诱变剂处理均匀分散的微生物群体 细胞，促使其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从 中挑选少数符合育种目的的突变株。诱变育种不仅可以提高菌株的生产能力， 而且还可以改进产品的质量、扩大品种、简化工艺；从方法上来说，它具有速 度快、收效显著和方法简便等优点；因此，在科学实验和生产上都得到了广泛 的应用。 1 4 亚硝基胍诱变剂的作用机制口羽 亚硝基胍( n t g ) 是一种诱变效果非常好的化学诱变剂，有“超诱变剂 之称其结构式为： 卜哆一一z 名f 一三二，写太 n on h i c h 3 一n c n h n q 亚硝基胍含有一个活性烷基，它可以转移到其它分子中电子密度较高的位置， 亚硝基胍的诱变作用是其与d n a 分子中的碱基或磷酸作用，使d n a 分子中的 碱基或磷酸部分被烷化，d n a 复制时导致碱基配对错误而引起突变。 o h n t g 鸟嘌呤烷基化的鸟嘌呤 碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤n 7 是最容易起反应的 位点，此外还有鸟嘌呤0 6 、胸腺嘧啶0 4 、鸟嘌呤n 3 、腺嘌呤n 2 、n 7 和胞 嘧啶n 3 。鸟嘌呤n 7 等位点被烷化后，它和核糖结合键发生水解反应，引起鸟 嘌呤从d n a 分子上脱落下来，使d n a 链上的碱基空缺，在以后的复制过程中 其它游离的碱基有可能错误掺入。这时由于烷基化后的鸟嘌呤易离子化，由原 来的酮式变成不稳定的烯醇式，不能和胞嘧啶配对，而与胸腺嘧啶错误配对， 结果发生g ：c a ：t 转变及g ：c c ：g 或g ：c t ：a 颠换而导致突变。 东华大学硕士生研究论文 2 实验部分 2 1 实验方案的设计 本课题采用两步来筛选适合羊毛细化的酸性蛋白酶产生菌。第一步是从烂 羊毛堆中选能够产适合羊毛细化的酸性蛋白酶的菌株；第二步是以筛选的菌株 及本实验室保藏的a s p n i g e r6 0 1 为出发菌株，用亚硝基胍对其进行诱变，以期 获得产适合羊毛细化的蛋白酶性能更优越的菌株。具体实验过程如下图所示： 1 从烂羊毛中筛选产酸性蛋白酶的菌种 ，- 、，- 、r - 、 f 取样l 匕= = = = = 冷i 富集培养l 匕= = = = = 今l 平板分离 i l j 、- - - ，、- - - - - - - 圃仁一臣至圃仁一 ，_ _ 。、，_ o 。、 l 第三次富集培养 l 匕= 令i 第三次平板分离i 匕= = a - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ ，- _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ - _ _ 一， ，。一、，_ 、 i 诱变处理 lg = = 了l 摇瓶再复筛l 车= = = 3 -_-_-_-_-_7、-_-_-一， 2亚硝基胍诱变处理 ，- i _ _ _ - - 、，- _ _ _ _ _ _ _ _ 。、，。、 l 原始菌株 l 匕= = = 今i 纯化 i 亡= = = = = i 斜面培养 i-_-_-_-_。 o ，_ _ ：_ 、，- - 、r l 平板涂布 i c = = = i诱变处理lc = = = = = = l孢子悬液l _ _ 。- _ 。_ _ _ _ 一1 。一、- - _ - _ _ _ - _ ， 0 厂而丽广 日两可令 l 平板计数 i 匕= = 哥i 初筛l 亡= = = = = - - _ i _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - i - _ _ _ _ ，- _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ 一 j _ _ - _ _ 。1 0 o o o o - _ - o 、 i 目标菌株lc = = = = = = = = = = = = 1 o o _ _ - _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 i菌种发酵条件考查l 1 2 守 守 东华大学硕士生研究论文 2 2 实验材料、仪器与药品 2 2 1 实验材料 羊毛粉： 将羊毛剪短剪碎，然后用装有1 0 0 目筛的粉碎机进行粉碎，即得羊毛粉。 羊毛部分水解液： 将羊毛放于装有6 m o l l 以h c l 的2 5 0 m l 圆底烧瓶中，小火回流2 h ，使羊毛 部分水解。冷凝过滤，得滤液。用2m o i l ln a o h 中和到p h7 0 。所得溶液即 为羊毛部分水解液。 2 2 2 实验仪器 1 3 东华大学硕士生研究论文 1 4 东华大学硕士生研究论文 2 2 4 实验试剂 p h 值为6 0 的0 2 m o l l _ 的n a 2 h p 0 4 一l ( h ：p 0 , 缓冲溶液口3 1 分别配置0 2 m o l l j 的n a 2 h p 0 4 溶液与0 2 m o l l j 的k h 2 v 0 4 溶液，取一定 量0 2 m o l l j 的n a 2 h p 0 4 溶液于大烧杯中，往烧杯中加0 2 m o i l 。的k h 2 p 0 4 ， 边k h 2 p 0 4 加边搅拌，用精密p h 计测定其p h 值。 乳酸- $ l 酸钠缓冲溶液 具体配置方法同上 f o l i n 试剂【3 4 】 于2 0 0 0 m l 磨口回流装置中加入钨酸钠( n a 2 w 0 4 2 h 2 0 ) 1 0 0 9 、钼酸钠 ( n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 ) 2 5 9 、水7 0 0 m l 、8 5 磷酸5 0 m l ，浓盐酸1 0 0 m l ，小火沸 腾回流1 0 h ，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂( l i 2 s 0 4 ) 5 0 9 、水5 0 m l 和数滴浓溴水( 9 9 ) ，再微沸1 5 r a i n ，以除去多余的溴( 冷却后仍有绿色需再 加溴水，再煮沸除去过量的溴) ，冷却，加水定容到1 0 0 0 m l 。混匀，过滤。制 得的试剂应该呈金黄色，贮存于棕色瓶内。 使用溶液：l 份福林溶液与2 份蒸镏水混和，摇匀。 2 3 实验方法与过程 2 3 1 培养基 斜面培养基 5b r i x 麦芽汁， 2 琼脂，调其p h 值为5 5 富集培养基( ) ： 豆粉 3 6 ；玉米粉o 6 ；鱼粉o 6 ；c a c l 2o 5 ；n h 4 c l 1 0 ； p h 值5 5 干酪素筛选培养基( ) ： 干酪素1 0 ； n a c l0 5 ； 琼脂 2 0 ： n a 2 h p 0 4 * 7 h 2 00 2 ； m g s 0 4 7 h 2 00 1 ；p h 值5 5 含羊毛