（生物化学与分子生物学专业论文）香蕉asr基因抗逆功能的研究.pdf

， 、0。l jk， 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑畦声明： 所m 交的学能论文，琏禾人和锌邮的攒! 手卜独、) 边 j ：研究l ：作所取 得的成粜。除文中已经注明引f | j 的内箨外，本论文彳i 禽任何其他个人成集体己经发袭或撰t j 过的作品或成果。对本文的研究做出m 耍贡献的个人和袋体均已往文中以明确方式枷：明。 本声明的法律结果| 臼本人承担。 论文作者签名： 厂、 立剧 川l f j ：协年占j l j 学位论文版权使用授权说明 本人完全j 。解海粥人。浮犬1 二收锭、佩撑、使；l l 伊沦文昀斟定，即：学 爻订敉保翻并向 国家仃火酃| j 或机构送交沦义的复印什和i i l 三f 版，允 ，r 沦文铍舟i j ； | = l i 借阅。本人授权海南人 学可以将本学伊论文的令部或部分内容编入订天数箍i 阵进 j ：扮索，可以采川影印、缩印或 j 描等复制手段保存和i 【i 编奉学f 沦丈。本人纯 蜥j 持吁卜久： 茂的论文成果知i j t e - ：权归属海 南人学嗣l 巾l q 热带农业科2 院。 保崧论文矗懈密后遵- i ：此规j z ， 沦文f 1 请签名： 爿訇 导师签名 只嬲：年月 翻 r 期：) 巾7 口年占j 。j ；c 日 本人l 二经认a 阅读“c a ll st 投p 玲义令义故j ：l ：m 发而i 馥靴”， 丈键交“c a ll s 高校忙沦文全义数捌m j ”i i 令殳技，订nj 1 - j 按“囊 权i ； 。阿盛洽义提窑匝霄压：口卫生；口尘：吖二 ：z 乏和。 论文作占签名：h ：师掺钐： 愈将4 、人的。似沦 科! ”- l - 娥定宰受捆父 j ! ；j j ：弘7 口q ：j i j ”t 9m 2 洲8删8971删y 习u川川 摘要 a s r ( a b a ，s t r e s s ，r i p e n i n gi n d u c e dp r o t e i n ) 基因是一类高等植物中特有的功能 基因，在番茄、杏、葡萄和马铃薯等物种中以小的基因家族形式存在。该基因家 族成员编码带有大量极性氨基酸的单体蛋白，这些单体蛋白之间以非共价键形式 结合形成同源二聚体并识别特定的d n a 序列，调节相应基因的表达。所以，a s r 基因被普遍认为是一种新型的植物转录因子。本实验室前期从香蕉果实( m u s a a c u m i n a t al 允“g r o u p 烈b r a z i l i a n ) 的e d n a 文库中获得了一个a s r 基因 ( m a a s r l ，登录号为a y 6 2 8 1 0 2 ) 。经序列比对和系统进化分析发现，m a a s r i 具有该家族基因共有的保守结构域，即n 端的依赖于z d + 的d n a 结合位点和c 端的核定位信号。和玉米，水稻等单子叶植物中的同源基因进化距离较近。 对m a a s r j 基因在香蕉各主要器官的表达进行分析后发现，m a a s r l 在香蕉 的各个器官中都有表达，在根、叶和果实中的表达量较高。说明它在这些器官中 可能发挥较为重要的作用。用盐和干旱对香蕉植株进行胁迫后，该基因在根部和 叶片中的表达被强烈地诱导，而在低温胁迫下的表达变化不明显，说明m a a s r l 主要参与干旱和盐胁迫应答途径，对低温胁迫无响应。 在香蕉果实采后的自然成熟过程中，m a a s r l 的m r n a 水平在采后2 d 时达 到高峰后急速降低。其表达峰位于果实内源脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 含量的峰值 之前，在内源a b a 含量达到顶峰时( 采后8 d ) ，该基因的表达受到抑制。而且 用外源a b a 处理能显著抑制该基因在整个香蕉果实成熟过程中的表达。以上结 果说明，a b a 对m a a s r l 在香蕉果实中的表达有抑制作用，而m a a s r l 可能就 是通过参与香蕉果实采后早期的a b a 途径来影响果实的成熟过程。 用外源乙烯和乙烯抑制剂1 - m c p ( 1 - - m e t h y l c y e l o p r o p e n e ) 处理果实分别能 小幅度提高和降低m a a s r l 的表达水平。这说明m a a s r l 对乙烯信号有应答，但 应答强度较低。 为了深入了解m a a s r l 在植物抗逆协迫中所具有的功能及其抗性机制，将 m a a s r i 构建到3 5 s 启动子驱动的植物表达载体p b l l 2 1 中，在拟南芥中过量表 达。以期利用拟南芥清晰的遗传背景来研究m a a s r l 的胁迫应答途径机制。 通过浸泡法将p b l l 2 1 - m a a s r l 植物表达载体转入拟南芥中，在r l 代获得 4 5 株抗性棺株，p c r 检测其中3 4 株为m a a s r l 阳性植株。t 3 代获得纯合株系 p 。1 。一 后，经s 。u m 锄检测选取两株独立表达的株系进行n 。吡锄和w ，e s 。锄检测，对 这两株转基因植株分别命名为3 5 s ：m a a s r l 4 和3 5 s ：m a a s r 3 8 ( 简称l 1 4 和 l 1 8 ) ，l 1 4 中m a a s r j 基因的表达量要高于l 3 8 中。 通过对转基因植株的表型观察发现，该基因的转入使得植株的叶片面积与野 生型相比更小、更厚，植株开花期明显延迟。在种子萌发期，l 1 4 和l 3 8 的种子 除了表现出对渗透胁迫的抗性外，还表现出对外源和内源a b a 的不敏感性。而 且在用干旱和3 0 0 m m 的n a c i 对各株系成年植株进行胁迫时发现，l 1 4 和l 3 8 在两种逆境胁迫条件下的存活率均强于野生型植株。另外，从各株系干旱胁迫下 的生理指标测定结果中可以看出，转基因植株的抗旱能力与m a a s r l 基因的表达 量有关。这些证据说明m a , 4 s r l 基因能够增强拟南芥抗旱性和抗盐性，并且这种 抗胁迫的能力与m a 4 s r l 基因的表达水平成正相关。 、 为了深入了解m a a s r l 所介导的植物抗逆性增强的分子机制，我们分析了胁 迫处理下各株系中a b a 胁迫信号途径下游响应基因的应答情况。植物在逆境条 件下，体内会迅速合成大量的内源a b a 来诱导相关应答基因的表达，以使植物 体产生胁迫防御系统。另外，胁迫信号还可以以独立的不依赖于a b a 信号途径 的方式传递，激活下游的应答基因。所以，a b a 胁迫应答基因中的一部分基因 对a b a 和胁迫信号都有响应，而另一部分只对胁迫信号响应。但是，在胁迫条 件下，这些响应基因的表达都应该是被高水平诱导的。但是，实验结果显示，在 高盐和干旱胁迫条件下，无论是胁迫信号单独响应的基因，还是a b a 信号和胁 迫信号共同响应的基因，在转基因植株里的应答强度都远远低于野生型。这个现 象说明，m a a s r l 的转入降低了植物中这些胁迫应答基因对外界胁迫信号和胁迫 条件下所产生的内源a b a 信号的应答程度。 为了排除m a a s r l 转基因植株中的这种低水平的a b a 和胁迫信号应答现象 是由于植株对胁迫条件下所产生的内源a b a 信号不敏感所致，我们又分析了 a b a 信号转导途径上游元件a b i ! 的表达。结果发现，胁迫条件下，各株系中 a b l l 基因的表达都提高了，但在转基因植株中的表达量要大于野生型。这说明 m a a s r l 并没有降低拟南芥对内源a b a 信号的敏感度，反而在a b a 信号传递途 径上游增强了植物体对胁迫条件下所产生的内源a b a 信号的感受。 上述实硷证据之间的相互矛盾使得我们有兴趣进一步探究m a a s r l 的转入 对转基因植株a b a 信号转导途径所产生的影响。用外源a b a 对各株系籽苗进 行处理后，检测a b a 胁迫应答基因和a b a 信号转导途径上游元件4 肋的表达 的情况。结果显示，a b a 胁迫应答基因和a b l l 在l 1 4 和l 3 8 中的应答程度均 高于野生型。这说明，m a a s r l 基因的转入能提高植物体对外源a b a 信号转导 途径的感受和应答。 另外，在胁迫和外源a b a 处理条件下，a b a 生物合成途径中关键基因a a 0 3 在野生型和m a a s r l 转基因植株中的表达量变化一致，说明m a a s r l 基因不影响 拟南芥的a b a 生物合成途径 以上证据表明，无论是对于胁迫条件下所产生的内源a b a 还是外源的a b a 信号，m a a s r l 基因的转入都能提高拟南芥对a b a 信号的感受( a b i 应答程度 升高) 。但是，在面临非生物胁迫时，m a a s r l 转基因植株中胁迫应答基因的表， 达变化和外源a b a 处理下各应答基因的应答变化趋势不同，这说明m a a s r l 并 不是通过影响胁迫条件下的a b a 信号途径来调控胁迫应答基因的表达，而是可雾 能通过调控其他的不依赖于a b a 信号通路的胁迫信号转导途径来调控植物的抗 逆应答，进而赋予植物的抗逆能力的。 关键词香蕉( m u s aa c u m i n a t el a a ag r o u p 以b r a z i l i a n ) ；拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a n f 口以，c o l u m b i ac c o t y p e ) ；a s r 酆i ( a b a ，s 仃e s s ，r i p e n i n g - r e l a t e dg e n e ) ：a b a ；誊 非生物胁迫 i i i a b s t r a c t a s r ( 出a ，s t r e s s ，r i p e n i n gi n d u c e dp r o t e i n ) g e n ei s ac l a s so fp l a n ts p e c i f i c g e n e s ，e x i s t i n gi nt o m a t o ，g r a p e ，p o t a t oa sas m a l lg e n ef a m i l y a s r sa r ec h a r a c t e r i z e da s ag r o u po fs m a l l b a s i cp r o t e i n sw i t hs t r o n gh y d r o p h i l i e i t y m o r e o v e r , t h e s en u c l e a r b a s i c p r o t e i n s c a nb i n dd n aw i t hh o m o - d i m e r i es t r u c t u r ea n dh a v e s t r o n g n o n - c o v a l e n ti n t e r a c t i o n sb e t w e e nm o n o m e r sw h i c hp r o n et os e l f - a s s e m b l e , r e s u l t i n g r e g u l a t i n ge x p r e s s i o no fd o w n s t r e a mg e n e s s o ，i tw a sp r o v e dt h a ta s r i san e wk i n d o ft r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r w eh a v eo b t a i n e dan e wa s rf r o mb a n a n af r u i te d n a l i b r a r y , n a m e dm a a s r l ( a c c e s s i o nn u m b e ra y 6 2 810 2 ) a n a l y s i so fm u l t i p l ea l i g n m e n t a n dp h y l o g e n e t i er e v e a l e dt h a tm a a s r ip o s s e s s e st h ec o n s e r v e dd n a b i n d i n gs i t e o l ln t e r m i n a la n da p u t a t i v e n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a lo nc t e r m i n a l ，a n di ts h o w e d t h eh i g h e s ts i m i l a r i t yw i t ha s ri nm a i z ea n dr i c e w h e na n a l y s i n gt h em a a s r la c c u m u l a t i o ni nd i f f e r e n to r g a n so fb a n a n a , t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f m a a s r li sh i g h e ri nb a n a n ar o o t ，l e a f a n df r u i t s ，s u g g e s t i n gi tm a yp l a yi m p o r t a n tr o l e i nt h e s et i s s u e s w h e nt r e a t e db y d r o u g h ta n ds a l ts t r e s s ，t h ee x p r e s s i o no fm a a s r lw a ss h a r p l yi n d u c e di nb a n a n ar o o t a n dl e a f , b u th a dn or e s p o n s et oc o l ds t r e s s ，i n d i c a t i n gt h a tm a a s r lg e n em a i n l y p a r t i c i p a t ed r o u g h ta n ds a l ts t r e s sr e s p o n s i v ep a t h w a yr a t h e rt h a nc o l dr e g u l a t i v e p a t h w a y d u r i n gt h ep r o c e s so fb a n a n af r u i tp o s t h a r v e s tr i p e n i n g , m r n al e v e lo fm a a s r l g e n ee n h a n c e di nf i r s tt w od a y sa n dp e a k da tt h e2d , t h e nd e c r e a s e dt ot h em u c hl o w l e v e l o nt h eo t h e rh a n d ，e n d o g e n o u sa b a ( a b s e i c i ca c i d ) c o n t e n tr e a c h e dm a x i m a l l e v e la t8 d a tt h es a m ef u n e , m a a s r la c c u m u l a t i o no b v i o u s l yr e d u c e d a g a i n , w h e n t r e a t i n gf r u i tw i t he x o g e n o u sa b a ，e x p r e s s i o no fm a a s r lw a sg r e a t l yi n h i b i t e d t h i s c o n s e q u e n c es h o w e dt h a ta b a c a ni n h i b i tt h em r n aa c c u m u l a t i o no fm a a s r li n b a n a n af r u i t i ti sp r o p o s e dt h a tm a a s r li n v o l v ei np r o c e s so ff r u i tr i p e n i n gt h r o u g h a b a p a t h w a y e x o g e n o u se t h y l e n ea n di t se x c l u s i v ei n h i b i t o rc a ns l i g h t l yi n d u c e da n di n h i b i t e x p r e s s i o no fm a a s r li nl a t e rs t a g eo ff r u i tr i p e n i n g t h i sp h e n o m e n o ni n d i c a t et h a t i v b u tt h er e s p o n s ei sm o r ew e a k e r a n dw ec a l la l s o i sd i r e c to rn o t t ou n d e r s t a n dt h e 黝s r l l sf u n c t i o ni ns t r e s sa n di t sm o l e c u l a rm e c h a n i s m ，w e h a v ei n s e r t e dt h ec o d i n gr e g i o no fm a a s r lt ot h ep b l l 2 1p l a n te x p r e s s i o n c o n s t r u c t i o nd r i v e nb y3 5 sp r o m o t e r w h e no v e r e x p r e s s i n gm a a s r li nw i l d - t y p e a r a b i d o p s i st h a n i a n ，b o t ho fo e ( m a a s r lo v e r e x p r e s s i n g ) l i n e sd i s p l a y e dar e l a t i v e s m a l l e ra n dt h i c k e rl e a fa n dm o r ed e l a y i n gf l o w e r i n gt i m et h a nw i l d - t y p e d u r i n gt h es t a g eo fs e e d sg e r m i n a t i o n ，o el i n e se x h i b i t e ds t r o n g e rr e s i s t e n c et o o s m o t i cs t r e s s ，a sw e l la saw e a k e rs e n s i t i v i t yt ob o t he n d o g e n o u sa n de x o g e n o u s a b a w h e nt r e a t i n ga d u l tp l a n t so fa l lt h el i n e sw i t h3 0 0 m mn a c la n dd r o u g h t ，t h e l a r g e ra m o u n to fo el i n e ss u r v i v e dt h a nw i l dt y p e i na d d i t i o n ，t h em e a s u r e m e n to f p h y s i o l o g i c a lp a r a m e t e ro fw i l dt y p ea n do e l i n e su n d e rd o u g h ts t r e s ss h o w e dt h a t t h ed e g r e eo fs t r e s st o l e r a n c ei no el i n e si sr e l a t e dt om a a s r le x p r e s s i o nl e v e l a l l t h ee v i d e n c e s p o i n to u tm a a s r lc a n i n d e e ds t r e n g t h e ns t r e s st o l e r a n c ei n a r a b i d o p s i s ，w h i c hd e p e n do nm a a s r le x p r e s s i o nl e v e l t od e e p l ye x p l o r et h ew h e t h e ro rn o tt h em a a s r lc o n f e r r i n gs t r e s st o l e r a n c ei n a r a b i d o p s i sd e p e n do na b as i g n a lp a t h w a y ，w ea n a l y s ec h a n g eo fa b a s t r e s s r e s p o n s i v eg e n ee x p r e s s i o nu n d e rd r o u g h ta n dn a c ls t r e s s t h er e s u l t ss h o wt h a t e x p r e s s i o no fb o t hg e n e sw h i c he x c l u s i v e l yr e s p o n dt os t r e s sa n do n e st h a tc a nb e i n d u c e db ya b aa n ds t r e s si sm u c hl o w e ri no el i n e st h a ni nw i l dt y p e ，w h i c hr e v e a l t h a tm a a s r lc a nr e d u c et h ep l a n t ss e n s i t i v i t yt os t r e s s t ou n d e r s t a n dw h e t h e rt h e l o we x p r e s s i o nl e v e lo fa b a s t r e s sr e s p o n s i v eg e n er e s u l tf r o mr e d u c e da b a s e n s i t i v i t yo fo el i n e s ，w ee x a m i n ee x p r e s s i o no f a b hu n d e rs t r e s s ( u p s t r e a me l e m e n t o fa b as i g n a lp a t h w a y ) i ti sf o u n dt h a ta b lll e v e lw a sh i g h e ri no el i n e st h a ni n w i l dt y p e ，i n d i c a t i n gt h a ta b as e n s i t i v i t yi sn o td e c r e a s e di no el i n e s o nq u i t e c o n t r a r y , t h ea b as i g n a li se n l a r g e d t of u t h e r 吲矽t h em a a s r lc a ne n h a n c er e s p o n s et oa b ai na r a b i d o p s i s ，w e m o n i t o rt h ea b a s t r e s sr e s p o n s i v eg e n eu n d e re x o g e n o u sa b at r e a t m e n t t h er e s u l t s r e v e a lt h a ta l lt h e s eg e n ee x h i b i tm u c hh i g h e rl e v e li no el i n e s ，s u g g e s t i n gt h a t f ， m a a s r lt r a n s g e n i cl i n e si n d e e dh a v eh i g h e rs e n s i t i v i t yt oa b a s i g n a l v a l lt h ee v i d e n c em e n t i o n e da b o v ed e m o n s t r a t et h a t , m a a s r lc a l le n h a n c e e n h a n c e r e s p o n s e t ob o t h e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s a b a s i g n a l i n a r a b i d o p s i s h o w e v e r , w h e nc o n f r o n t e dw i t ha b i o t i cs t r e s s , m a a s r lc o n f e rt h es t r e s s t o l e r a n c ei n d e p e n d e n to fr e g u l a t i n gt h ea b ap a t h w a yi na r a b i d o p s i s ，b u tl i k e l y d e n p e n d i n go no t h e rb i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a lw a y s ，s u c h 弱c h a n g eo fl e a f t h i c k n e s sa n da r e a , t oi m p r o v et h ep l a n tr e s i s t a n c et os t r e s sa n dt h e ne n a b l ei tp o s s e s s s t r o n g e rd e f e n s i v es y s t e m t h i sp r o t e c t i v es y s t e mm a k eo el i n e sg i v en or e s p o n du n t i l m o r es e r i o u ss t r e s sa p p e a r k e y w o r d sm u s a a c u m i n a t e三 a a a g r o u p c v b r a z i l i a n ：a s r g e n e ( a b a ，s t r e s s ，r i p e n i n g - r e l a t e dg e n e ) ；a r a b i d o p s i st h a n i a n ( c o l u m b i ae c o t y p e ) ： a b a ( a b s c i s i ca c i d ) ：a b i o t i cs t r e s s 二 v i 目录 摘要i a b s t r a c t i v 1 前言1 1 1 香蕉生产的重要性1 1 1 1 香蕉的经济价值。l 1 1 2 香蕉抗逆品种改良的重要性1 1 2 植物抗性基因表达与其在基因工程中的应用2 1 2 1 低温、干旱和高盐诱导的基因表达与鉴定2 1 2 2 低温和渗透胁迫诱导的基因表达产物的功能3 1 2 3 胁迫应答基因表达过程中信号的传递途径4 1 2 3 1 对刺激信号的感应器一4 1 2 3 2c a 2 + 和活性氧等信号分子的信号传递5 1 2 4 胁迫应答基因表达过程中信号的传递途径5 ； 1 2 4 1 依赖a b a 的胁迫信号传递。7 1 2 4 2 干旱和高盐渗透胁迫诱导a b a 生物合成基因的表达7 1 2 4 3 依赖于a b a 与不依赖a b a 转导途径间的交叉联络8 1 2 5 抗性基因的交叉诱导与表达( 交叉抗性) 8 1 2 6 转录因子基因的基因工程9 1 3a s r 基因的研究现状1 0 1 3 1a s r 基因与果实成熟1 1 1 3 2a s r 基因与非生物胁迫研究l l 1 3 3 a s r 基因与a b a 通路的研究1 3 1 4 在拟南芥中研究m a a s r l 的必要性1 4 1 4 1 拟南芥的普通生物学特性1 4 1 4 2 拟南芥的遗传学特性1 5 1 4 3 拟南芥的分子生物学特性1 5 1 5 本研究的目的和意义1 6 1 6 技术路线17 2 材料与方法1 8 2 1 植物材料、试剂与仪器18 2 1 1 材料l8 2 1 2 试剂18 2 1 3 所用引物1 9 2 1 4 仪器2 0 2 2 方法2 1 2 2 1m a a s r l 基因的生物信息和系统发生分析2 l 2 2 2m a a s r l 基因在果实成熟过程中的表达2 1 2 2 2 1 果实采后的处理方法2 1 2 2 2 2 香蕉果实采后乙烯释放量的测定2 1 2 2 2 3 香蕉果实采后内源a b a 的测定2 2 2 2 2 4 果实采后不同阶段总r n a 提取2 2 2 2 3 m a a s r l 在非生物胁迫处理下的香蕉植株中的表达2 3 2 2 3 1 香蕉植株的干旱处理2 3 2 2 - 3 2 处于不同干旱胁迫处理程度下的香蕉叶片水势的测定2 3 2 2 3 3 香蕉植株的高盐胁迫处理2 3 2 2 3 4 香蕉植株的低温胁迫处理2 3 2 2 3 5 香蕉不同器官总r n a 提取2 4 2 2 4 c d n a 第一链的合成2 4 2 2 5 荧光定量p c r 分析香蕉各器官中m a a s r l 在m r n a 水平上的表达 ：! z i 2 2 5 1 荧光定量p c r 的引物设计2 4 2 2 5 2 荧光定量p c r 的反应体系和反应程序2 4 2 2 5 3 荧光定量p c r 的定量方法2 5 2 2 6m a a s r l 植物表达载体的构建2 5 2 2 7m a a s r l 基因转化拟南芥一2 5 2 2 7 1 拟南芥培养2 5 2 2 7 2 农杆菌介导的浸泡法转化拟南芥2 6 2 2 7 3 拟南芥种子抗性筛选及分离比例计算2 6 2 2 7 4 转基因t 2 代拟南芥培养2 6 2 2 8m a a s r l 转基因拟南芥的分子检测一2 7 2 2 8 1 野生型和m a a s r l 转基因拟南芥叶片总d n a 的提取2 7 2 2 8 2 野生型和m a a s r l 转基因型拟南芥叶片总r n a 的提取2 7 2 2 8 3 野生型和m a a s r l 转基因型拟南芥叶片总蛋白的提取一2 7 2 2 8 4 m a a s r l 转基因拟南芥的p c r 检测2 7 2 2 8 5m a a s r l 转基因拟南芥的s o u t h e r nb l o t 检测2 7 2 2 8 6m a a s r l 转基因拟南芥的n o r t h e r nb l o t 检测2 8 2 2 8 7 m a a s r l 转基因拟南芥的w e s t e r nb l o t 检测2 8 2 2 9m a a s r l 转基因植株种子对a b a 的敏感度以及对渗透压胁迫的抗 性测试2 8 2 2 1 0 m a a s r l 转基因植株对干旱和盐胁迫的忍耐力2 9 2 2 1 0 1m a a s r l 转基因植株对干旱胁迫的耐受能力测试2 9 2 2 1 0 2m a a s r l 转基因植株对盐胁迫的耐受能力测试2 9 2 2 1 1m a a s r l 转基因植株在干旱胁迫条件下的生理变化2 9 2 2 1 1 1 叶片的失水率测定2 9 2 2 1 1 2 脯氨酸含量的测定2 9 2 2 1 1 3 丙二醛含量的测定3 0 2 2 1 2m a a s r i 转基因植株中a b a 胁迫相关基因的表达分析一3 0 2 2 1 2 1 对野生型和m a a s r l 转基因型籽苗的外源a b a 处理3 0 2 2 1 2 2 对野生型和m a a s r l 转基因型籽苗的n a c l 处理3 0 2 2 1 2 3 对野生型和m a a s r l 转基因型籽苗的干旱处理3 0 2 2 1 2 4 野生型和m a a s r i 转基因型拟南芥r n a 的提取。3 l 2 2 1 2 5e d n a 第一链的合成。3 l 2 2 1 3 荧光定量p c r 分析各株系中a b a 胁迫相关基因在m r n a 水平上 的表达3l 2 2 1 3 1 荧光定量p c r 的引物设计3 1 2 2 1 3 2 荧光定量p c r 的反应体系和反应程序3l 3 结果3 2 3 1m a a s r l 基因推导氨基酸序列的结构分析3 2 3 1 1m a a s r l 推导氨基酸序列与其他物种中a s r 序列的比对3 2 3 1 2m a a s r l 的系统发生分析3 2 3 2m a a s r l 基因在香蕉各器官中的相对表达量分析3 4 3 3m a a s r l 基因在果实成熟不同时期表达分析3 4 3 3 1 香蕉果实采后成熟过程中内源乙烯释放速率的测定3 4 3 3 2 香蕉果实采后成熟各时期的内源a b a 含量测定3 5 3 - 3 3m a a s r i 基因在香蕉果实成熟过程中的表达分析3 6 3 4m a a s r l 对香蕉非生物胁迫的应答3 8 3 4 1m a a s r l 对香蕉干旱胁迫的应答3 8 3 4 2m a a s r l 对香蕉盐胁迫的应答。3 8 3 4 3m a a s r l 对香蕉低温胁迫的应答。3 9 3 5m a a s r l 在拟南芥中过量表达4 0 3 5 1m a a s r l 植物表达载体的构建4 0 3 5 2m a a s r l 转基因株系的p c r 检测4 0 3 5 3m a a s r l 转基因株系的s o u t h e n i 检测4 1 3 5 4l 1 4 和l 3 8 的n o r t h e r n 检测。4 2 3 5 5l 1 4 和l 3 8 的w e s t e r n 检测阿2 3 5 6l 1 4 和l 3 8 的表型特征4 3 3 6l 1 4 和l 3 8 种子对a b a 的敏感度，对盐和渗透压的抗性测试4 4 3 6 1l 1 4 和l 3 8 种子对a b a 的敏感度测试4 4 3 6 1 1l 1 4 和l 3 8 种子对内源a b a 的敏感度测试珥4 3 6 1 2l 1 4 和l 3 8 种子对外源a b a 的敏感度测试。4 4 3 6 2l 1 4 和l 3 8 种子对n a c l 的抗性测试4 6 3 6 3l 1 4 和l 3 8 种子对非离子渗透胁迫的抗性测试。4 9 3 6 4l 1 4 和l 3 8 种子对7 蔗糖的敏感度测试4 9 3 7l 1 4 和l 3 8 的抗胁迫能力测试5 0 3 7 1l 1 4 和l 3 8 的抗旱能力5 0 3 7 2l 1 4 和l 3 8 对高浓度n a c l 胁