（应用化学专业论文）罗丹明类衍生物的合成及表征.pdf

摘要 为提高罗丹明荧光染料的荧光强度、发射波长、增大斯托克斯位移、扩大荧 光对p h 值的敏感范围、增加对一些过渡或重金属离子的识别响应，本文设计并 合成了一系列底环修饰，n 端基固定，不对称，双发色团以及离子识别型罗丹明 衍生物，并通过紫外可见光谱和荧光光谱对所得罗丹明衍生物进行荧光性能检 测，总结出其结构特点与其光学性能之间的关系。主要包括以下内容： 合成了硝基和氨基罗丹明，并通过氨基的重氮化，桑德迈尔反应得到了一系 列5 ( 6 ) 位卤代罗丹明衍生物；合成并分离出底环不同位置单氯代、全氟( 或 氯) 代罗丹明衍生物以及底环上无羧基的“r h o s 锄i n e ”类衍生物。光谱性能研究 表明，与母体罗丹明b 相比，硝基的罗丹明荧光强度明显减弱，氨基罗丹明荧 光强度增强，k 一和k m 红移；罗丹明b 底环上引入不同的卤原子使k 辨“ 和入懈；姗有所增长，随着卤代基个数的增加，又m 找椎和a 们。；锄红移，斯托克斯位 移降低；底环上的的羧基对荧光性能几乎没有影响。 合成了氧杂蒽母环末端n 固定的五个罗丹明衍生物，经紫外可见光谱及荧 光光谱检测，五个罗丹明衍生物的k 和k 龇m 明显向长波偏移2 0 n m 以上， 由所处的可见光区红移至近红外光区，斯托克斯位移明显增大，荧光量子产率增 加，成为近红外荧光标记试剂，结果证明n 端基固定可以增加分子共平面性和 刚性，对荧光的产生有利，可使荧光增强。 设计合成了氧杂蒽母环端基氨不对称的罗丹明衍生物b d c 1 b d c 1 l ，与对 称结构罗丹明相比较，不对称罗丹明衍生物的激发光谱和发射光谱的重叠变少， 斯托克斯位移明显增大，顶环结构不对称性越明显，斯托克斯位移增大就越显著。 其中b d c 4 、b d c 5 的k 船伽明显向长波发生迁移，是很好的近红外荧光染料试 剂。b d c 1 0 改变了对p h 值的敏感范围，在酸性和碱性环境下具有不同的吸收、 发射波长。 通过桥链将在不同p h 值条件下进行荧光检测的罗丹明、荧光素结构连接在 一起，合成了具有双发色团的两种罗丹明衍生物，不同p h 值时两种罗丹明衍生 物荧光光谱有明显差别，拓宽了p h 的适用范围，可以作为检测细胞内部的p h 值的荧光探针。 为增加对一些过渡或重金属离子的识别响应，本文将罗丹明衍生物键合到杯 【4 】芳烃骨架上，合成了两种罗丹明杯【4 】芳烃衍生物，对产物结构、光谱性能和 对一些金属离子的识别进行了研究，两个衍生物与c u 2 + 、z n 2 + 混合溶液的紫外 吸收发生明显变化，最大吸收峰强度降低，k 红移，与铜离子、锌离子在甲 醇溶液中存在明显的络合现象。 关键词：罗丹明，底环修饰，不对称，n 端基固定，双发色团，离子识别，荧光 性能 a b s t r a c t l nt h i st h e s i s ，5s e r i e so fr h o d a m i n ed e r i v a t i v e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d i n c l u d i n gb o t t o mr i n gm o d i f i e d ，n s t a b i l i z e d ，a s y m m e t r i c a l ，c o n s i s t e do fd o u b l e f l u o r e s c e n c eg r o u p sa n di o nb i n d i n gr h o d 锄i n ed e r i v a t i v e si no r d e rt oi m p r 0 v et h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ) ，a n dq u a n t u my i e l d ，l o n g e r - w a v e l e n 舀h s ，p h - s e n s i t i v er a n g e ，t h e 1 a 唱es t o k e ss h i ra n di o nb i n d i n gs p e c i f i c i 锣t h ef l u o r e s c e n c ep r o p e r i t i e so ft h e o b t a i n e dc o m p o u n d sw e r ei n v e s t i ga _ t e db yu v 二v i ss p e c t r aa n dn u o r e s c e n c es p e c t i a t h er e l a t ；o n s h i pb e 撕e 翎t h e i fs t r u c t u r e sa n dp h o t o p h y s i c a l p r o p e r t i e s w e f e s u m m a r i z e d t h ed e t a i l sw e r ed e s c r i b e db e l o w ： n i t r o r h o d a m i n e锄da m i n o - r h o d 锄i n ew e r c s y n t l l e s i z e d as e r i e s o f5 ( 6 ) - h a l o r h o d a m i n e 、v e r co b t a i nf 硒m a n l i n o - r h o d a m i n e t h r o u g hd i a z o t i z a t i o n ， s a n d m e y e rr e a c t i o n s y n t h e s i sa n d i s o l a t i o no fm o n oa n df u l is u b s t i n l t e d c h i o m r h o d a m i n e s ，f u u f l u o r 0s u b s t i t u t e dd l o d a m i n e s 锄dr h o s a m i n ew i t h o u tc a 廊x y l g r o u po nt h eb o t t o mr i n gw e r ci n v e s t i g a 钯di nt h i sp a p e r c o m p a “n gw i t hr h o d a m i n e b ， a l t h o u g ht h e n u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f 锄i n o r h o d a m i n ew a si m p r o v e d ，t h i s p r o p e r 眵o fn i t r o r h o d a m i n eh a dw e a l ( e n e d ，ka n dk mw e r er c ds h i r t h ei n t r o d u c t i o n o fh a l oe i e m e n tt 0r h o d a m i n es t 】r l l c t u r ee n i a 唱e d 枷a x - e x 锄d 梳a x _ e ma st h e n u m b e ro fh a l o - a t o mi n c r e a s i n 岛k 姒壤a n dk 棚w e r er e ds h i 允s t o k e ss h i rh a d d e c r e a s e d c a r b o x y lg r o u po nt l l eb o t t o mr i i l gh a da l m o s tn oi n f l u e n c et of i u o r e s c e n c e p r o p e n i e s f i v ens t a b i l i z e df h o d a 胁i n ed e r i v a t i v e sa tx 绷t h e n ew e r es y n t h e s i z e da n dt h e i r n u o r e s c e n c ep r o p e r t i e s 、耽r et e s t e db yu v - v i ss p e c 妇锄df l u o r e s c e n c es p e c t r a i tw 嬲 f o u n dt h a tk a n dk l a x 吒mw e r er e ds h i f tm o f et h a n2 0 肿f b mv i s m l el i g h ta r e at 0 i r a r 髓n s t a b “z a t i o n j n c r e a s e di nc 0 - p j a n a r 卸dr i 画d 毋w h i c hj e a dt 0t l e e n l a 唱e m e n to fs t o k e ss h i r 醐di n t e n s 毋o f f l u o r e s c e n c ei n t e n s i 够 a s y m m e t r i cd l o d a m i n e sb d c - l b d c 一1 1w 嬲d e s i g n e d 锄ds y n t h e s i z e d t h eo v e r i 印 b e t 、e e n 九m a x e x 锄dh l a x e mf o r 协e s ec o m p o u n d sd e c r e a s e d ，a ts a m et i m es t o k e s s h j f ti n c r e 嬲e d t h eg r e a t e ra s y m m e 仃i cd e 伊c e ，t h el a 唱e ro ft h es t o k e ss h i r t h e 九m a x - e mo fb d c 一4a n db d c 一5w e r er e ds h i f t b d c l0s h o w e dd i f f e r e n ta b s o r p t i o na n d e m i s s i o nw a v e i e n 舀h si na c i da n db a s es o l u t i o n 鼬o d a m i n ea n df l u o r e s c e i nw e 陀l i n k e dt oo b t a j nd o u b l ef l u o r e s c e n c eg r o u pb y c h e m i c mb o n d t h en u o r e s c e n c es p e c t r u m0 ft h ec o m p o u n d ss h o w e do b v i o u sv a f i e 够 i nd i 骶r e n tp hs o l u t i o n r h o d a m i n e c a i i x 【4 】a r e n ew a sl i n k e dt o g e t h e rb ya m i d eg r o u p i t sf l u o r e s c e n c e a n dm e t a li o nb i n da b i l i t yw e r et e s t e d 1 1 1 eu v 二v i sa b s o 巾t i o nc h a n g e dw h e nt h e a d d i t i o no f t h i sc o m p o u n di n t ot h em e t h a n o i i cs o l u t i o nc o n t a i n i n gc u 2 + a n dz n 2 + k e yw o r d s ：r h o d a m i n e ，b o t t o mr i n gm o d i n e d ，n s t a b 订i z e d ，u n s y m m e t r y ，d o u b l e n u o r e s c e n c eg r o u p ，i o nb i n da b i l i t ) ，f l u o r e s c e n c ep r o p e r i t i e s 独创性声明 本人声明所毕交的学位论文是本人住导师指导f 进行的研究l ：作和取得的研究成 果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含为获得墨叠盘兰或其他教育机构的学位或证1 5 而使用过的材料。与 我同：f 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：锄 签字眦z 。卿年月功日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤盗盘堂有关保留、使崩学位论文的规定。特授权 苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供夯阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交 论文的复印什和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适刈本授权说明) 学位论文作者签名： 签字日期：压i ) 7 年，月勿日 导师签名： 飞轨神 辑醐：年咖日 前言 刖舌 大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较差，因此人们用强荧 光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的 共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低，这就是荧光探针技术。荧光分析 方法因其灵敏度高、选择性好和试样量少，在分析化学，特别是生物分析中有广 泛的应用。随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞 检测及免疫分析等方面显现出巨大的潜能。近年发展起来的荧光化学传感器和分 子信号系统更是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和扩充。如今，它的 应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学等诸多领域。随着生命科学 的飞速发展，对活性高、特异选择性好、灵敏度高的新型荧光探针的需求就显得 越来越迫切了。 目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有罗丹明类、荧光素类、邻苯二甲醛 类等，其中罗丹明类化合物在生物研究领域中占有极其重要的位置，一百多年来 一直是化学及生物分析领域中的研究热点。虽然国外对荧光探针合成及应用研究 进行地非常深入，但我国在该领域的研究起步较晚。由于探针技术的研究涉及到 化工、生物化工、医学、信息科学等领域，各学科的交叉比较多，因而使其研究 具有一定的难度，目前尚未形成完善的理论体系。为此，在原有的基础上开展研 究工作，克服目前存在的不足，在理论上和实际应用方面都具有重要意义。 本论文针对罗丹明类化合物底环上不同基团对其荧光性能影响的规律性、荧 光量子产率较低，荧光发射波长短，斯托克斯位移小，适用p h 值范围窄等缺陷， 通过底环上不同性质基团的引入改善其荧光性能，总结不同基团对罗丹明结构荧 光性能改变的规律性；将氧杂蒽母环上3 ，6 位取代的n 端基固定使其最大激发4 和发射波长红移，并增加罗丹明结构的荧光量子产率和荧光强度；通过两步缩合 向氧杂蒽母环上3 ，6 位引入不对称基团来提高罗丹明斯托克斯位移；将碱性条 件下用于荧光分析检测的荧光素与罗丹明结构链接，合成在酸性和碱性条件下都 有荧光的双发色团罗丹明衍生物，改善了罗丹明结构p h 值的敏感范围；将罗丹 明衍生物引入到杯【4 】芳烃骨架上，以增加对过渡或重金属离子的识别功能等五 方面进行修饰，设计合成出包括底环修饰、n 端基固定、不对称、双发色团以及 离子识别型的5 种不同系列罗丹明衍生物。并且通过紫外可见光谱和荧光光谱 对这些衍生物进行荧光性能检测，总结出其结构特点与其光学性能之间的关系， 筛选出性能优异的荧光探针，为今后更全面的研究设计新型荧光探针提供参考。 第一章文献综述 第一章文献综述 物质的分子吸收可见紫外光后，能级可跃迁至激发态，激发态分子在返回 基态时以辐射的方式全部或部分地释放出所吸收的能量，其发射光的波长与所吸 收的光的波长相同或者更长，这种现象称为光致发光，荧光是最常见的光致发光 之一。自然界有许多荧光物质存在，1 6 世纪人们就在矿物和植物提取液中观察 到荧光现象。随着科学研究的深入和生产实践的发展，荧光的本质逐步为人们所 认识，有关荧光的理论和应用也得到长足发展。有机荧光物质是一类具有特殊光 学性能的化合物，它们能吸收特定频率的光，并发射出低频率( 较长波长) 的荧 光以释放所吸收的能量。自l8 6 7 年g o p p l e s r o d e r 首先利用桑色素与铝生成螯合 物进行铝的荧光分析测定以来，有机荧光试剂在荧光分析中的应用日益广泛。由 此建立了众多的荧光分析方法用于鉴定或测定无机物、有机物及生物大分子，并 具有较低的检测下限和一定的选择性，且能使用普及型仪器。与无机分析试剂比 较，有机试剂应用于荧光分析可供选择的品种较多，一般灵敏度较好，因而可以 为荧光分析的发展提供良好条件【l 棚。 近年来荧光分析方法和技术也取得了重要的进展，其应用领域也正在不断拓 宽，如阴离子荧光光谱法。荧光检测与色谱法联用，提供了高灵敏度，高分辨率 和高选择性的分析方法，微分或导数荧光法、多维荧光光谱法、同步荧光法、同 步导数荧光法、偏振荧光法、相分辨与时间分辨荧光光谱法、免疫荧光监测、固 体表面检测、催化和非催化动力学荧光、激光诱导荧光光谱法等新兴复合联用方 法和技术的出现又为荧光光谱法的发展注入了新的动力。现在荧光光谱法可以通 过荧光法鉴定和测定的有机物、无机物、生物物质、医药、农药、污染毒物等的 数量与日俱增，已广泛应用于化学、化工、生物、医药、卫生、农业、轻工、冶 金、地质以及环境保护等各个领域中1 7 。1 引。 荧光光谱特性可用来作为定性分析和定量分析的手段，荧光光谱法具有灵敏 度高、选择性高、方法简便快速、试样量少等优点，但也有其不足，许多物质本 身不会发出荧光，使荧光分析技术的应用受到了限制【j4 1 。为解决此问题随后发 展起荧光探针技术，所谓荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学 特征，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的 结构及物理性质的方法。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏 度较低，人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂与待测物进行标记或衍生，即 第一章文献综述 利用某些试剂与非荧光或弱荧光化合物以共价键或其它形式结合形成发荧光的 络合物或聚集体进行测定，其基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态响应时 间。荧光探针技术可以使研究人员高灵敏和高选择性地检测复杂生物分子，包括 活细胞中的特定成分，尤其近年来发展起来的荧光化学传感器和分子信号系统更 是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和拓宽，如今它的应用已深入到药 物学、生理学、环境科学、信息科学等多个领域【1 4 17 1 ，随着生命科学的飞速发展， 使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向推进，对活性高、特异选 择性好、灵敏度高的新型荧光探针的需求就越来越迫切。 1 1 荧光概述 1 1 1 荧光的发现及发展 当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就发射出波长和强度各不相 同的光线，停止照射时，这种光线马上或逐渐消失，这就是荧光。最早记录荧光 现象的是i6 世纪西班牙的内科医生和植物学家n m o n a r d e s 。l5 7 5 年，他提到 在含有一种称“l i g n u mn e p h r i t i c 啪”的木头切片的水溶液中，有天蓝色出现。 1 7 世纪，b o y l e 和n e 叭o n 等著名科学家再次观察到荧光现象，并且给予了更详 细的描述。虽然在l7 世纪和l8 世纪中还发现了其他一些发荧光的材料和溶液， 但是在解释荧光现象方面却几乎没有进展，对荧光的产生原理和条件直到1 9 世 纪中期才清楚。s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，发现它们 的荧光波长比照射光的波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，并且波 长不同，荧光是发射光就这样被证实了。根据“萤石”能发出这种光，提出了“荧 光”这一名称。此外，s t o k e s 还对物质的荧光强度与浓度之间的关系进行了研究。 到2 0 世纪初，人们已经知道包括罗丹明、稠环芳烃及荧光素等在内的6 0 0 余种 化合物有荧光。随后，w a w w i l l o u s 在1 9 2 4 年开始进行荧光产率的测定，1 9 2 6 年g a v i i a 又对荧光寿命进行了测定。讨至今日，由于荧光的高灵敏度和高选择 性，荧光分析法及荧光检测已经成为分析化学中的一类重要方法i l 引。 1 1 2 荧光的发光原理 荧光是处在激发态的分子和原子返回基态过程中伴随着放射出来的一种光 能。荧光产生的过程如图1 1 所示1 3 】。一般来说，荧光试剂分子处于基态，吸收 光以后，试剂分子处于电子激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两类，大 多数有机物分子的基态是处于单重态的。我们以s o 、s l 、s 2 分别表示分子的基态、 第激发单重态和第二激发单重态，能量由低到高。用t l 、t 2 分别表示三重态 第一章文献综述 的第一激发态和第二激发态。分子中的电子从基态单重态s o 跃迁至激发单重态 s l 、s 2 比较容易发生，进行很快( 约l 矿秒) ，而从基态单重态到激发态三 重态却不易发生。高能量的单重激发态分子( s 2 ) 可以与其它同类分子或溶剂分 子碰撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级s 1 ，这一过程为l o 。2 秒，处于激发态最低能级的分子寿命一般为1 酽l o 8 秒，它们会放出光子返回 基态，这时产生的光就是荧光。简而言之即激发态分子的激发单重态直接或者再 经过振动弛豫达到激发态的最低振动能级后，如果以发射光量子方式跃迁到基态 的各个不同振动能级( 包括最低能态) ， 称为荧光发射。 筚垂态 又经振动弛豫回到最低基态，这个过程 ：蔓獯态 、 r iv r 。烹r 厂i 托 ， jl ，次 l c = o ，_ n 0 2 ，_ c o o h ，- c h o ，_ c o r ( r h 3 ，_ c 2 h 5 等) ，州卧i _ ，卤素( c l ，b r ，i ) 等吸电子基。荧光减弱的 原因各不相同：有些基团发生预解离，如硝基苯；有些基团有“重原子效应”而影 响系间跨越跃迁的速度。当重原子引入万共轭体系时，系间跨越速度增加，从而 减弱荧光。 ( 3 ) 影响不明显的取代基。如，_ r ，一s 0 3 h 等。因为这些基团与万共轭 体系作用较小，所以对荧光影响一般没有显著的变化。 此外，取代基在试剂分子中的位置及取代基的数量对物质的荧光影响视其具 体情况而定。只有一个吸电子取代基，处于空间位阻最小或无空间位阻的位置时， 可使荧光增强。双取代和多取代基团对荧光的影响较难预测。对于不同的发光母 体，同类取代基所处的位置不同所表现出的荧光强弱变化规律也不同。 1 2 3 有机荧光探针的结合方式 荧光探针与被测物质之间通常是以共价或非共价两种方式结合。非共价标记 通常包括静电吸引或疏水作用，在传统的生物分子检测中，通常是利用非共价方 式完成标记工作。随着具有活性反应基团探针的出现，利用共价方式( 即化学键 合) 进行标记的方法被广泛采用，其检测原理是：通过活性基团( 如：n h se s t e r 、 n c s 或邻苯二甲酰亚胺等) 与蛋白质、d n a 、核酸或其他生物大分子中的羟基、 l o 第一章文献综述 氨基或巯基以化学键的方式键合，使染料荧光特性发生变化，借此提供大分子结 构和性能的信息。与非共价方式相比，经过化学键合后所得标记物相对稳定，更 能方便地研究其物理及化学特性。当荧光探针与被测物结合后，某些荧光参数会 发生明显地变化，利用结合前后参数的变化，可以研究被测物的性能。如1 苯氨 基萘8 磺酸( 1 8 ) 和2 对甲基苯胺基萘6 磺酸( 1 9 ) 在水中几乎无荧光，但在 和牛血清蛋白及变性蛋白结合后则产生强荧光。溴化乙啶( 简称e b ，1 1 0 ) 其 结构如下所示，它可以结合单链、双链及多链d n a ，与核酸结合后，其荧光增 强2 0 3 0 倍，激发波长红移3 0 4 0 倍，发射波长发生蓝移，而且它与核酸中双 链区的结合是具有专一性的，利用它与各种构象核酸的结合比率的不同及所产生 荧光强度的变化，可以把各种构象的核酸区分开。因此，该物质能鉴别天然核酸 和变性核酸，区分线状d n a 、环状d n a 和超级线团d n a ，已成为应用较广的 d n a 荧光探针。除利用荧光强度的改变进行检测外，荧光偏振、峰位及谱带宽 度、荧光寿命的改变也都是荧光探针技术的基础。 3 8 m n h o 呲 1 2 4 有机荧光探针的分类 有机荧光探针按荧光发射波长分为紫外可见光区荧光探针( 如丹磺酰氯) 和 近红外荧光探针( 如吖啶) ，作为荧光探针的有机荧光物质结构可划分为以下三 类：( a ) 具有刚性结构的芳香稠环化合物；( b ) 具有共轭结构的分子内电荷转 移化合物；( c ) 某些金属有机配合物。其中( b ) 类具有较好的辐射衰变能力， 是目前研究得最为广泛和活跃的一类。因为当其吸收光被激发而处于激发态时， 分子内原有的电荷密度分布发生了变化，发生了分子内光诱导电荷转移，引起分 子极化，使其电荷密度分布主要集中于分子的两端，从而不容易发生光异构化反 应，因此成为一类有较高荧光量子产率的化合物。 目前最常用的有机类荧光探针有以下几种： 第一章文献综述 ( 1 ) 香豆素类 香豆素的衍生物已被众多的荧光化学研究者所熟悉，大多数的香豆素荧光染 料为黄色，带有绿色荧光。但香豆素的母体结构是无色的，且在常温下没有荧光。 取代后的香豆素衍生物，特别是给电子基团的取代，将增加其荧光量子产率。如 4 甲基7 羟基香豆素、7 二甲氨基香豆素，在它们的分子结构中不但含有六元环， 而且含有羰基，在一定条件下也可与被标记物发生反应，用于细胞内p h 的测定、 牛血清蛋白检测。m p i t s c h k e 通过自由基聚合的方法合成了一种香豆素荧光团的 高分子染料，分子量介于2 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 ，这种用聚合物上连有大量荧光团的高分 子荧光染料进行标记，通过染料上的羧基和蛋白质的氨基形成肽键完成染料和蛋 白质的接合，其灵敏程度大大提高，它在量子产率、s t o c k 位移、光稳定性、分 子均匀性、对蛋白质配对产率及对生物活性的干扰等方面均满足要求【2 2 彩】。 ( 2 ) 萘酰亚胺荧光染料【2 4 2 6 】 萘酰亚胺类有机荧光染料是一类非常重要的功能染料，近年来在国际和国内 研究非常活跃。本类荧光染料的分子结构具有共平面性、较大的共轭体系，分子 结构中一端具有强的给电子基团，另一端具有强的吸电子基团，这种“吸供电子 共轭体系”中电子很容易受到光的照射跃迁产生荧光，其中l ，8 萘二甲酰亚胺是 一类良好的荧光发色体，其4 小眦2 等供电子基团的衍生物大都具有强烈的荧光。 含酰肼和乙烯砜活性基团的活性萘酰亚胺染料，在适当的p h 和温度下，对微生 物着色有专一选择性，由于无毒，可用于活细胞的细胞内染色。 ( 3 ) 菁类 菁染料近年来应用在红外激光染料、非线性光学材料和生物大分子荧光标记 等方面，是一类由两个杂环体系及中间次甲川链组成的染料，主要是以吲哚环和 苯丙噻唑、苯丙嗯唑或苯丙吲哚等含氮杂环为骨架珏刀二不对称菁染料合成及性 能测定的文献很多，此类染料本身基本无荧光反射，而当与d n a 或r n a 结合后， 其光学性质发生明显变化，如荧光增强，吸收曲线向长波方向移动5 2 0 n m ，s t o k e 位移约为1 5 3 0 n m ，此类荧光探针对不在活细胞内的少量细胞也很敏感，在水溶 液中基本不会光退化，因此其水溶液可长期、连续地用于核酸测定。这些染料与 双链核酸结合时( 包括d n a 和r n a ) ，其荧光增强，当专门用于标记d n a 时， 必须先加入r n a 酶进行处理，菁染料也可与寡聚核苷酸探针同时使用，以显示 和定量分析细胞中的特定核酸序列【2 黏捌。 第一章文献综述 ( 4 ) 酞菁类 在酞菁的基本结构中，周边取代的官能团可以是烷基、苯并基团、杂环等， 中心可容纳n i 、z n 、p t 、p d 、s i 、g e 等原子【3 l 】，酞菁有2 个主要吸收带：紫外区 的b 带和近红外区的q 带，q 带受稠环个数、取代基数目的影响，一般分布于6 5 0 8 5 0 n m ，如l 4 j o l l ab l u e 是一种硅酞菁衍生物( k m = 6 8 0 n m ，量子产率7 0 ) 具有 很好的光稳定性，可用于荧光免疫分析中标示蛋白质。水溶性酞菁也以独特的吸 收和荧光特性在生化分析中的应用正日趋广泛，其较深的色光和对蛋白质非特异 性的强吸附使其被用作新型的蛋白质染色剂；较高的荧光量子产率和较大的 s t o c k 位移( 3 0 0 n m ) 使其在荧光免疫分析中被用来标识抗体或在d n a 杂交中 作d n a 探针。酞菁类染料的缺点是合成中溶解度小、体积大，会影响生物分子 其他性能p 引。 ( 5 ) 罗丹明、荧光素及其它荧光染料 罗丹明类染料是以罗丹明为母体，经过多种官能团进行修饰的系列衍生物。 罗丹明类染料的荧光量子产率较低，而其最大吸收和发射波长较长，一般在 6 0 0 n m 左右，受样品背景干扰相对较少，是常用的荧光探针。荧光素类染料母体 结构为荧光素，具有较好的荧光量子产率以及良好的水溶性，荧光素最大激发波 长在5 0 0 n m 左右，适用于氩离子激光器的4 8 8 衄光谱线，但存在s t o c k 位移小，容 易光致褪色，光猝灭率高，p h 敏感性强等缺点【3 3 】。 用n 原子取代咕吨染料的中心氧原子，可得到以吖啶为母体的吖啶类染料。 这一类荧光染料可与r n a 及d n a 结合，其阳离子形式还可以与蛋白质、多糖和 粘多糖等大分子静电结合，对活细胞具有渗透性，在高浓度下与蛋白质结合后荧 光量子产率降低，是较常用的碱基对嵌入荧光分析染料i 用n 原子取代咕吨染料的中心碳原子，可得到嗯嗪类染料，由于n 原子的吸 电子作用，能使波长红移8 0 n m ，但同时造成了量子产率和摩尔消光系数的下降。 该类荧光染料已被用作生物探针瞰】。 在众多有机荧光探针种类中，用于标记或衍生的罗丹明类荧光探针在生物 领域的研究中占有极其重要的位置，一百多年来一直是化学及生物分析领域中 的研究热点。 1 3 罗丹明类荧光探针的合成与应用研究 1 3 1 罗丹明类化合物概述 第一章文献综述 罗丹明系列荧光染料是一种以氧杂蒽为母体的碱性咕吨染料，最初是从古老 的纤维用染料中筛选出来的，应用于无机荧光分析已有1 2 0 余年的历史。是一类 具有强荧光，且有高激光输出效率的染料，它们的发色团是带有3 ，6 位取代氨 基及其衍生物的氧杂葸母体( 以下简称项环) 。两个芳环间“氧桥”( o ) 相连， 碳与氧处在对位上形成一个六元环，分子中具有一个很长的共扼体系，具有刚性 ( 僵硬性) 平面结构，容易吸收入射光的能量而发射长波，从而产生荧光，并且 可以减少分子内部的热运动，减少激发态能量的耗损，提高荧光发射效率。氨基 氧杂蒽型衍生物的发色团是铵离子和氧豁的共振杂化体系，核磁共振研究表明罗 丹明染料中的氧杂葸型分子3 ，6 位的氮原子上带有不大的正电荷，9 位碳原子 也参与共轭7 c 电子体系。 。 r 4 r 3 n r 1 r 2r 4 r 3 n r n r l r 2 3 ，6 位取代氨基及其衍生物的扭转运动会对染料的荧光量子效率产生较大 的影响。9 位上的碳原子与芳环相连，比较活泼，容易发生氧化、还原等反应， 它可有以下几种存在形式： 醌构隐色体内酯及其它 第三芳环( 简称为底环) 可通过活性基与蛋白质、核酸等生物大分子及组成 单体分子中的- n h 2 ；o h ；s h 等形成共价键后，其荧光特性发生变化，得到的 标记物具有稳定、选择性和灵敏度较好等优点，从而可反映有关大分子结构和性 能的信息，为荧光分析和光度分析奠定了理论基础。由于特殊的结构及相应的荧 光特性，使罗丹明类荧光染料已成为化学和生物分析领域中研究较为广泛的课题 【3 5 3 9 1 。有关罗丹明类荧光染料的合成、离子化及结构、光学特性及分析等方面的 报道已有很多【似卯】。与其它常用的荧光染料相比，罗丹明类荧光染料具有光稳定 性好、对p h 不敏感、较宽的波长范围和较高的荧光量子产率等优点，因此被广 泛应用在药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、环境化学、 1 4 艮 、 一 h吨l 一 札l 第一章文献综述 单个分子检测、信息科学、荧光标记、激光染料等方面【5 1 彤1 ，是分析化学和生物 医药科学等生物技术领域中最常用的荧光染料。 随着应用范围越来越广泛，罗丹明类荧光染料的研究发展迅速且受到了更多 的重视，近几年来科学家们又设计合成了一系列新型罗丹明类荧光染料，现以罗 丹明结构的修饰方式为轴线，着重介绍其合成及应用的最新进展，并对今后的研 究趋势作简单的评述。 1 3 2 母环修饰的罗丹明荧光染料的合成及应用 罗丹明类荧光染料的典型制备方法是通过合适的氨基酚与各种苯甲酸、邻苯 二甲酸、苯酐、磺基苯甲酸及其酸酐反应，在浓硫酸、无水氯化锌及其它l e w i s 酸作催化剂缩合【“粕】。由于分子结构中含共轭兀键和较活泼的助色基团，通过引 入不同的官能团对罗丹明的结构进行修饰，可以设计合成出许多罗丹明类衍生 物，这些修饰可以在缩合反应之后进行，也可以在合成之前对芳环或杂芳环修饰， 经过修饰的罗丹明很好地弥补了亲脂性差、特异选择性不好、量子产率不能满足 某些探针检测需要、发射波长较低等缺点。 罗丹明的基本骨架主要由带有3 ，6 位取代氨基的氧杂蒽母体( 以下简称顶 环) 和9 位碳原子所连接的芳环( 以下简称底环) 两个片段组成。其中带氨基的 氧杂蒽母体是最重要的一个结构片段，此类化合物的荧光特性与它的结构有着密 切的关系。许多合成工作都围绕着顶环的修饰而展开。母环上引入不同的取代基， 如烷基、芳基、卤素、磺酸基等反应性基团，不仅可以影响这类化合物的最大吸 收、发射波长，也直接影响它们的应用性能：氨基修饰包括添加水溶性基团，使 结构刚化以及不对称修饰，对增色及荧光效应都有较大的影响。 1 3 2 1 氧杂蒽环上的修饰 在罗丹明衍生物中，结构刚性弱是非发光失效的主要原因，c l a u d i n e 等人脚】 合成出一种新型咕吨环上取代的罗丹明染料，它是罗丹明5 7 5 和罗丹明6 g 的异 构体。 日奄 囝h 第一章文献综述 h c o o h - - - - - - - - - - - - - - + 户c 。m e o h o h e t h n m e c o n d e n s a t i o n 其关键中间体3 乙氨5 甲基酚是由3 甲基5 酮2 已烯甲酯与n 乙基苯甲氨制 得，与苯酐类衍生物缩合后在项环的c l 和c 8 位各引入了一个甲基，抑制了由 于羧基苯环部分的自由旋转而引起的非放射过程，从而获得高的荧光产率。 h a u g l a n d l 67 】对罗丹明的磺化进行了研究，在室温下用浓硫酸可以磺化母环上 带有单侧链甲基，如果4 ，5 位没有取代基，用发烟硫酸进行的磺化还可以发生 在母环4 ，5 位上。d e n i s f 6 8 j 在l o u i s 【6 9 】i 作的基础上，将商品化的罗丹明衍生物 如罗丹明l l o 、罗丹明1 2 3 等还原，然后经溴化、氧化得溴代产物，合成4 位芳 环取代的及2 ，7 位卤代罗丹明衍生物，变换反应条件还可以得到2 烷基取代及 4 ，5 位卤代衍生物，这一类罗丹明制成的光学活性衍生物能够诱使细胞衰亡， 而非活性衍生物对细胞无毒，用合适波长的光激发后破坏癌细胞或治疗白血病， 可用于光动力学治疗。其合成路线如下所示。 r r n r r n r r n r r r r n n r r r r n 呈坐盟! 堕趔q g = c i b r 除了对引入基团的吸电子能力进行控制外，人们还利用基团扭转受阻的方法 来提高罗丹明的荧光强度，防止由于分子内电荷转移引起的t i c t 现象出现f 彻。 1 6 第一章文献综述 在b e l l f 7 1 1 工作的基础上，b e n s o n 等人1 7 2 - 7 3 铡用l ，3 二羟基萘酚制成的3 甲氧基 1 羟基萘酚经多步反应制得一些比较有特点的间氨基萘酚类中间体，用1 氨基 3 甲氧基萘酚经类似方法合成n 上被一个甲基( 乙基) 取代的刚化间氨基萘酚。 典型结构如下： 巧 ( e t ) 2h o 典型合成路线如下： h 、rh o r = m e ，e t ，p hr = m e ，( c h 2 ) 3 s 0 3 羹籍 m e t ) 2 h o - - - - - - - - m r = h 。c h 3 、p hm e 9 ( e t ) 2 第一章文献综述 用这些间氨基酚与苯酐类化合物进行缩合反应，可以得到兀共轭体系扩大的 二苯基罗丹明染料，由于分子内兀共轭度得到提高，使荧光波长向长波方向移动， 其最大吸收波长在5 8 5 n m 以上，最大发射波长在6 1 4 7 6 0 n m 以上，可以用波长 超过6 3 0 n m 的激发光源如固态二极管激光、氦氖激光光源激发，可用于多色荧 光检测，特别适用于自动四色d n a 序列测定【7 4 】。其中有代表性的二苯基罗丹明 染料结构如下： e t 1 3 2 2 母环上氨基的修饰 r r = m e 、c h 2 c h 2 c h 2 s 0 3 h 、e t 、p h d r e x h a g e 【7 5 】发现罗丹明类染料末端氨基的扭转运动会使s l s 0 内部转换加 剧，氧杂葸母环的刚性平面被破坏，导致它们的荧光量子产率降低，实验证明， 罗丹明b 的荧光量子产率与温度有关就是受氨基扭动影响，若将罗丹明类染料 末端氨基固定，使t l c t 不能形成，则荧光量子产率与温度变化无关了，可有效 地提高分子的刚性，从而使荧光量子产率提高。所以特殊结构罗丹明的合成，尤 其是结构刚化及不对称合成一直是化学家颇感兴趣的课题之一【7 卯丌。 l l i n d a 【7 8 】发明了新型水溶性罗丹明类荧光染料，这些染料及标记连接物广泛 用在细胞、蛋白质染色，核酸分析等方面。刚化及不对称型的合成路线分别如下 所示： 第一章文献综述 o m e o h c o n d e n s a t i o n 不对称型的合成路线分别如下所示： p 洲 c o o h f h a m m o n d 【7 9 】先将喹啉上的n 烷基化，还原后再经过磺化、碱融的方法合成 一系列具有特殊结构的间氨基苯酚，代表性的间氨基酚有n 上取代的羟基喹啉 或吲哚。利用这一关键中间体可以合成具有刚性结构的罗丹明衍生物，r 和r ” 可以是h 或1 1 0 个碳的烷基。 一幻一幻茜 1 9 第一章文献综述 j 一 0 莎s 。逝 0 h 3 ! ! 囝冬勰 h a u g l a n d 【8 m 8 1 】通过扩展兀共轭体系用以增加刚性，设计并合成出新类型的强 荧光罗丹明染料，这一系列染料在5 8 1 6 3 l n m 处有较强吸收，量子产率在o 6 4 0 8 9 之间，可以广泛用于生物分析领域。其制备是用4 溴3 硝基茴香醚及五种 不同的芳香硼酸为原料合成，心部分可以是苯环、萘、噻吩、苯并噻吩，其合 成路线如下所示： 0 2 h0 2 nh 2 n 、 鲫o h ) 2 + b r 心啪一叫珍o m e 业唑咄，o m e h 3 c o c h n 一心o m e 趟蚴 地妣一烙。二议 。m e 一心。h 港瀚一避讹心瀚一掣，洲e 由于氧杂葸环上氨基及其衍生物的引入，分子减少了酸性，增加了碱性。在 3 ，6 位上引入磺酸基可增加罗丹明分子的酸性及在水中的溶解度，近年来文献 中报道过这类酸性罗丹明品种( 黄光红：r l = h 、r 2 = c h 2 c h 2 s 0 3 h ，有荧光：蓝 光红：r l = c 2 h 5 、r 2 = c h 2 c h 2 s 0 3 h ，有荧光；红紫色：r 1 = c 2 h 5 ，r 2 = p h - s 0 3 h ， 无荧光) ，氮上的氢被烷基替换后颜色加深，而芳环替换了烷乙基的结果是使颜 色加深得更明显，但荧光削弱甚至消失。它们的合成大部分采用邻磺酸基苯甲醛 与间苯二酚缩合得到3 ，6 二羟基取代的氧杂葸衍生物，进一步氯化后再与相应 的胺类反应而得。h a m m o n d 【8 2 】发明了n 上带有单磺化侧链的磺酸基罗丹明新型 第一章文献综述 水溶性染料，原料间氨基酚主要是3 氨基4 甲基苯酚( r l = c h 3 ，r 2 = h ，r 3 = h ) ； 7 羟基1 ，2 ，3 ，4 四氢喹啉( r i - r 2 = ( c h 2 ) 2 ，r 4 = h ) ；6 羟基二氢吲哚 ( r 1 r 2 = ( c h 2 ) 2 - ，r 4 = h ) ；2 甲基3 氨基苯酚( 黜= c h 3 ，r 2 = h ，r l - h ) ，与l ， 3 丙基磺内酯( m = 3 ) 或2 溴代乙基磺酸钠( m = 2 ) 反应生成氨基酚磺酸，然后 用3 0 硫酸催化与2 ，4 二磺酸基苯甲醛缩合成“隐色酸”，在9 0 硫酸作用下 关环，最后用硫酸铁或亚硝酸钠氧化得目的产物。这类罗丹明衍生物在水中有很 好的溶解性，弥补了大分子量的罗丹明在水中的溶解性很差、甚至不溶的缺点， 作为激光染料时不需要加有机溶剂溶解，还可用在示踪剂、荧光标记、娱乐设旋 以及医疗诊断等一系列荧光物质可以应用的领域。 村、口 n 2 r 1 c h 2