生物化学实验课件.ppt

生物化学实验课件,西北农林科技大学生命学院生物技术系,概述,通过实验课，掌握比色、层析、电泳等基本实验方法的原理和操作技能，学会选择正确的方法进行生物材料中多种物质的分离、提纯及鉴定。通过实验加深对生物化学基本原理的理解。,实验内容,蛋白质的两性性质和等电点测定3蛋白质含量测定（考马斯亮兰）4酶的基本性质5转氨酶活性鉴定（纸层析法）6淀粉酶活力测定6过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳6质粒的提取、电泳6酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究(综合性实验)50实验时间：双周，第二周开始！要求：勤于动脑、善于动手！,生物化学实验技术郭蔼光郭泽坤主编高等教育出版社生物化学实验方法与技术陈毓荃主编科学出版社,参考书目,蛋白质的两性性质和等电点测定,1.实验目的1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。,蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可解离基团除N-端-氨基与C-端羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如Phe、Thr、Ser的羟基、Cys的巯基、Arg的胍基、His的咪唑基，Asn、Gln的酰胺基和Lys的-氨基等都能解离为带电基团。在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阴离子两性离子阳离子pHpIpH=pIpHpI电场中：移向阳极不移动移向阴极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大。配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可大致确定蛋白质的等电点。在pH梯度电泳中，蛋白质泳动到其相应的等电点时则停止泳动，据此可分离等电点不同的蛋白质。,2.实验原理,2.1氨基酸的两性解离和等电点2.1.1氨基酸的两性解离,酸性溶液中的AA水溶液中的AA碱性溶液中有AA（阳离子）（兼性离子）（阴离子）,在一定pH值时，氨基酸以兼性离子存在，在电场中不会向正、负酸极移动，此时的pH值称氨基酸的等电点（pI）。pI=1/2(pK1+pK2)酸性氨基酸pI=1/2(pK1+pKR)碱性氨基酸pI=1/2(pK2+pKR),2.1.2氨基酸等电点（isoelectricpoint),2.2蛋白质的两性电离及等电点,2.2.1蛋白质的两性电离蛋白质是由AA组成的高分子化合物，具有许多游离的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巯基、酚基等，因此与AA一样，能象酸一样解离，也能象碱一样解离，也是两性电解质。,当溶液在某一pH值时，蛋白质所带正、负电荷相等，即总净电荷为零，此时溶液的pH称该蛋白质的等电点(isoelectricpoint)。,2.2.2蛋白质的等电点,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书,5.结果处理,用、+、+、+等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。6.注意事项缓冲液的pH值必须准确。,7.思考题,1）解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。2）该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？,蛋白质含量测定（考马斯亮蓝法）,1.实验目的1）通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理。2）了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。,考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）染料，在游离状态下溶液呈棕红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色。蛋白质含量在01000g范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的蛋白质常用分析方法。,2.实验原理,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书,5.结果处理,根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g），按下式计算：6.注意事项比色应在出现蓝色后2min1h内完成。,7.思考题,1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？2）如何正确使用分光光度计？3）测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理有哪些不同？,酶的基本性质,1.目的酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，生物体内的化学反应基本上都是在酶催化下进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。,过氧化氢酶广泛分布于生物体内，能将代谢中产生的有害的H2O2分解成H2O和O2，其催化效率比无机催化剂铁粉高10个数量级。酶的另一特点是具有高度的特异（专一）性，淀粉酶和蔗糖酶虽然都催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。通过比较淀粉酶在不同pH，不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。,2.实验原理,2.1pH对酶促反应速度的影响,2.2温度对酶促反应速度的影响,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书.,5.结果处理,具体参见实验指导书.6.注意事项1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验3、4、5应随时检查反应进行情况。如反应进行太快，应适当稀释唾液；反之，则应增大唾液淀粉酶浓度。2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。,7.思考题,1）何谓酶的最适pH和最适温度？2）酶有哪些催化特性？3）影响酶促反应速度的因素有哪些？,转氨酶活性鉴定（纸层析法）,1.实验目的熟悉纸层析法分离和鉴定生物分子的原理和操作方法，掌握转氨基作用和转氨基反应及其鉴定的方法，了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。,转氨酶是生物体氮代谢的重要酶类，动物肝脏和豆类植物萌发种子中存在着丰富的转氨酶。转氨酶催化-氨基酸的-氨基与-酮酸的-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。生物组织中转氨酶种类甚多，其中以谷氨酸-丙酮酸转氨酶(谷丙转氨酶)和谷氨酸-草酸乙酸转氨酶(谷草转氨酶)的活力最强。通过转氨基作用形成的氨基酸可通过展层层析检测。氨基酸的纸层析属于分配层析，滤纸为支持介质，滤纸上所吸附的水为固定相，有机溶剂为流动相。把混合氨基酸样品点于滤纸上，使流动相经样品点移动，混合氨基酸在两相溶剂间进行分配，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度慢；在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度快。由于各种氨基酸的分配系数不同，在一定时间内，逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后显色，使氨基酸显色形成斑点。氨基酸的比移值（Rf）表示如下：由于各种氨基酸都有其特征的Rf值，因此可根据Rf值来鉴定被分离的氨基酸。,2.实验原理,影响纸层析迁移率Rf值的主要因素1.样品本身的性质和结构2.溶剂的性质3.PH值4.温度5.滤纸性质,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书,5.结果处理,依据层析图鉴定-酮戊二酸和丙氨酸是否发生了转氨基反应，测量点样原点到各氨基酸层析斑点中心的距离，计算各氨基酸的f值。6.注意事项1）展开剂应该现配，并充分摇匀。2）点样量不可过多，点样过程中应注意不要造成滤纸污染（手和唾液都含有氨基酸）。3）点样线不能浸入展开剂，层析缸应密封，防止展开剂挥发。4）若分离不好，可适当浓缩样品或用不加茚三酮的展层剂展层后，再用0.1的茚三酮乙醇喷雾显色。,7.思考题,1）滤纸为什么要在层析缸中预先悬空密封饱和30min？2）展开时为什么要调节滤纸使溶剂前沿线平行于点样线？3）实验结果为什么有时会产生拖尾、相邻氨基酸分不开等异常现象？,淀粉酶活力测定,1.实验目的掌握测定淀粉酶活力的原理和方法，熟练掌握分光光度计的操作方法，了解注意事项。,淀粉酶广泛存在于植物中，特别是萌发的禾谷类种子淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。-淀粉酶随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、糊精等；-淀粉酶从淀粉的非还原性末端进行水解，生成麦芽糖、极限糊精等。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。淀粉酶水解淀粉生成的还原糖可将棕黄色的3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖量成正比，用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定反应生成的还原糖量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖量表示酶活力。,2.实验原理,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书,5.结果处理,-淀粉酶活力（mg麦芽糖/g鲜重5min）-淀粉酶活力（mg麦芽糖/g鲜重5min）：处理管-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的平均值（mg）0：对照管-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的平均值（mg）：处理管（+）-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的平均值（mg）0：对照管（+）-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的平均值（mg）n：淀粉酶原液稀释倍数；Vt：淀粉酶原液总体积（ml）；Vu：反应时所用酶液体积（ml）；W：样品重（g）,6.注意事项,1）淀粉酶原液的稀释倍数，根据不同材料酶活力的大小而定。2）试管、移液管、比色杯应清洗干净，操作中严防交叉污染。3）精确吸取试剂，按顺序加入；反应温度、时间、冷却时间应准确统一。,7.思考题,1）简述淀粉酶活力测定实验的原理和设计思路？2）测定样品酶活力时，为什么要用标准曲线1号管调零？3）为什么要将淀粉酶液和1%淀粉溶液分别置于40水浴中保温？,过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.实验目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶，是DNA上遗传信息表达的结果。同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都具有一定的关系。过氧化物酶是植物体内存在的活性较高的一种酶，与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，而且在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此测定过氧化物酶的活性或其同工酶，具有重要的意义。酯酶同工酶在脂代谢中有重要作用，目前除在脂类代谢中测定酯酶同工酶组分变化外，在油料种子纯度鉴定中也被普遍使用。用电泳技术分离鉴定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶和油菜萌发种子的酯酶同工酶。通过本试验掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及其操作。,聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合成的多孔介质。控制凝胶的浓度和交联度可获得符合需要孔径的凝胶。在由浓缩胶、分离胶组成的碱性不连续体系中，存在着浓缩效应（仅在浓缩胶中）、电荷效应和分子筛效应，同工酶分子在这三种效应的共同作用下，经过电泳被有效地分离，最后染色，显现出不同的酶带，比较不同材料酶谱的差异，可对其遗传特性等进行研究。,2.实验原理,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书,5.结果处理,于日光灯下观察记录酶谱，绘图或照相。6.注意事项1）Acr、Bis是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用。操作时戴乳胶手套或指套，避免与皮肤接触。2）如室温过高，可适当减小电流，延长电泳时间，最好将电泳槽置冰箱中电泳或接上冷却装置，以免温度过高使酶失活。,7.思考题,1）简述聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。2）上、下槽电极缓冲液用过一次后，是否可以混合后再用？为什么？3）凝胶的化学聚合与光聚合有何不同？4）什么叫同工酶？研究它有何意义？5）过氧化物同工酶显色时要先加pH4.7的溶液，说明为什么？,质粒的提取、电泳,1.实验目的1）学习碱裂解法提取质粒的原理。2）学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。,利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，细菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白质和DNA发生变性，但是染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当pH=4.8的乙酸钾将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性的蛋白质会形成大量沉淀以及十二烷基磺酸钾沉淀，染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上。离心后，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，质粒DNA留在上清里。,2.实验原理,琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。,3.仪器、试剂和材料,4.操作步骤具体参见实验指导书,5.结果处理,利用凝胶成像系统进行检测.,6.注意事项,1）实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生物有关书籍。2）细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。3）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。4）加入醋酸钾溶液后，可用小玻棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。5）用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单独使用酚或氯仿更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。6）提取的各步操作尽量在低温条件下进行(冰浴上）。7）为进一步除去残留蛋白质，可将DNA沉淀溶于适量TE缓冲液后，加入等体积酚/氯仿进行多次抽提，离心，吸取水相，再用乙醇沉淀DNA。8）有文献报道，煮沸法不适用于表达核酸内切酶A的E.coli菌株(endA+菌株，如HB101)，因为煮沸法不能使核酸内切酶A完全失活，限制性内切酶解保温时，在Mg2+存在下，质粒DNA可被降解。为避免这一点，在乙醇沉淀后，用少量TE缓冲液溶解DNA，加入等体积酚/氯仿抽提，取水相再用乙醇沉淀DNA。,7.思考题,1）碱法提取质粒过程中，EDTA、溶菌酶、NaOH、SDS、乙酸钾、酚/氯仿等试剂的作用是什么?2）质粒提取过程中，应注意哪些操作，为什么?3）用碱裂解法提取的质粒DNA通常都污染有细菌RNA分子，你采用什么策略能够去除RNA污染？4）如果你提取的质粒DNA污染有少量的染色体DNA，那么你在操作过程中哪几步最可能出现了问题？5）如果两种核酸的核苷酸残基数目相近，是否在同一块琼脂糖