硕士论文-人参花蕾中人参皂苷的分离纯化与生物转化.pdf

北京化工大学 硕士学位论文 人参花蕾中人参皂苷的分离纯化与生物转化 姓名：王冠 申请学位级别：硕士 专业：微生物与生化药学 指导教师：袁其朋 20100609 摘要 人参花蕾中人参皂苷的分离纯化与生物转化 摘要 人参是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著饼农衣苒经芦。 人参皂苷作为人参中的主要成分，在心血管系统、肿瘤、中枢神经系 统等疾病的治疗中有显著的疗效。人参花蕾是人参的生殖器官。近年 研究表明，人参花蕾中含有二十种皂苷活性物质，其总皂苷含量比人 参根高5 倍以上。并含有十七种氨基酸、十几种多糖组分、多种微量 元素、蛋白和挥发油组分。许多学者利用现代化的提取和分离技术， 如：超声波辅助提取、微波辅助提取、C 0 2 超临界萃取、大孔吸附树 脂法、高效液相制备色谱法和高效逆流色谱法，从西洋参、人参或者 三七的根中分离出了人参皂苷、人参多糖等活性成分，而对于人参花 蕾中的有效成分提取和分离的研究却很少。本文主要展开对人参花蕾 中有效成分定性和定量的分析，创建了人参花蕾中的人参总皂苷和人 参总多糖的联合提取工艺，采用正相低压制备色谱法分离人参花蕾中 两类主要的人参皂苷一原人参二醇型和原人参三醇型皂苷，发现并通 过实验证明了活性炭对不同种类人参皂苷有选择吸附性，将这种选择 吸附性与制备型高效液相色谱技术相结合，从人参花蕾中分离出高纯 度的人参皂苷R e ，并对人参皂苷的生物转化进行了探索性的研究。 通过泡沫实验和S a l k o w s k i 反应对人参花蕾提取物的定性分析，检 测出人参花蕾中含有大量的人参皂苷。建立了人参总皂苷和总多糖的 定量分析方法。采用高效液相色谱法对人参花蕾中人参单体皂苷的含 北京化_ T 大学硕，l j 学位论文 量进行了分析。该分析方法可以达到很好的分离效果，测定方法简便、 快捷。结果表明，人参花蕾中主要含有原人参二醇型皂苷( 人参皂苷 R b l 、R b 2 、R e 、R d ) 和原人参三醇型皂苷( 人参皂苷R e 、R 9 1 ) 。 建立了行之有效的人参花蕾总皂苷和人参花蕾总多糖的联合提 取工艺。此工艺利用了人参多糖类组分溶于水但不溶于浓度较高的醇 溶液的原理，从人参花蕾中获得人参总皂苷和总多糖，从而实现了资 源的良好应用。采用了超声辅助提取法，大大缩短了实验时间的同时， 提高了有效成分的提取率。并通过对超声辅助提取时间、次数、正丁 醇萃取次数和沉降多糖时乙醇的加入量等影响因素进行优化，最终建 立了一个稳定，快速的实验工艺流程，此工艺获得人参花蕾总皂苷粗 粉中人参皂苷含量高于9 0 ，人参花蕾总多糖粗粉中多糖组分含量为 9 2 。 利用正相低压制备色谱技术，将人参花蕾中两种主要的人参皂苷 ( 原人参二醇和原人参三醇) 分离。首先通过薄层层析技术，筛选出 适合本实验的流动相：正丁醇乙酸乙酯水。通过选取合适的分离介 质，流动相配比，流速和进样量，得到了最优的条件为：选取2 0 0 3 0 0 目的硅胶，流动相为正丁醇：乙酸乙酯：水( 4 ：l ：5 ，v ：v ：v ) 的体系，最优 的流速和进样量分别为8m L m i n 和4 0 0m g 。此分离条件下，原人参 三醇类皂苷的纯度及收率为81 9 和8 1 3 。 利用活性炭对人参皂苷具有选择吸附性的原理对人参花蕾总皂 苷粗提液进行预纯化，与传统的方法相比较，本方法具有操作简单， 分离效率高，有机溶剂消耗率低的特点。采用制备型高效液相色谱纯 摘要 化人参皂苷R e 。在反相制备型高效液相色谱上优化参数，确定了最 适合制备色谱纯化G R e 的流动相为乙腈：水( 2 3 ：7 7 ，v ：v ) 。在流速 为6m L m i n ，上样量为1 0m g 时，人参皂苷R e 的纯度最高可达9 8 5 ， 人参皂苷R e 的纯度随着流速和上样量的增加而下降。 对人参花蕾总皂苷的生物转化进行了探索性的研究。分析了产紫 青霉( P e n i c i l l i u mp u r p u r o g e n u m ) p D 葡萄糖醛酸苷酶的作用机制和 人参皂苷生物转化的原理，通过产紫青霉p D 葡萄糖醛酸苷酶对人参 皂苷中葡萄糖苷键的水解作用，将人参花蕾中人参二醇类人参皂苷 R d 水解成为人参皂苷R 9 3 。在温度为4 5 。C ，p H 值= 5 0 ，酶浓度为2 m g m L 的条件下，反应时间对p D 葡萄糖醛酸苷酶催化人参皂苷有 着很大的影响。反应1 2h 时，产紫青霉p D 葡萄糖醛酸苷酶对人参 花蕾总皂苷的转化率为4 9 5 。 关键词：人参花蕾；人参皂苷；活性炭；制备色谱；生物转化 北京化T 人学硕卜学位论文 S e p a r a t i o n ，P u r i f i c a t i o na n dB i o t r a n s f o r m a t i o no f G i n s e n o s i d e sf r o mG i n s e n gB u d G i n s e n O S i d e sl r o mG i n s e n gU A B S T R A C T P a n a xg i n s e n gC A M e y e r ( A r a l i a c e a e ) ，w h i c hw a sf i r s tr e c o r d e di n S h e nN o n g sH e r b a lC l a s s i c ，i so n eo ft h ef a m o u sa n dp r e c i o u sC h i n e s e t r a d i t i o n a lh e r bm e d i c i n e s A st h em a i ni n g r e d i e n to fP a n a xg i n s e n g , g i n s e n o s i d e sh a sb e e nu s e da sas a t i s f a c t o r yd r u gf o rt h et r e a t m e n to f t u m o r ，f a t i g u e ，c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s ，s t r o k ea n dS Oo n G R e ，ak i n do f t h em o s tc o m m o ng i n s e n s i d e ，h a st h ep a r t i c u l a re f f e c to na n t i d i a b e t i c a n dc e n t r a ln e r v o u ss y s t e md i s e a s e s G i n s e n gb u d ，t h er e p r o d u c t i v eo r g a n o fP a n a xg i n s e n g , i sc o n s i d e r e da s u n i v e r s a li m m u n eh e a l t hp r o d u c t s T h ec o n t e n to fG R ei nG i n s e n gb u di sf i v et i m e sh i g h e rt h a nt h a ti n g i n s e n g ，w h i c hi s t h er o o to fP a n a xg i n s e n g I nr e c e n ty e a r s ，l o t so f m o d e mm e t h o d sh a v e b e e nd e v e l o p e dt os e p a r a t ea n dp u r i f yg i n s e n o s i d e s f r o m g i n s e n g ，A m e r i c a ng i n s e n g a n d S a n q ir o o t ，s u c h a s u l t r a s o u n d a s s i s t e de x t r a c t i o n ，m i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o n ，u l t r a h i g h p r e s s u r ee x t r a c t i o n ，C 0 2s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，m a c r op o r o u sr e s i n ， P r e p H P L Ca n dH S C C C H o w e v e r , f e wr e s e a r c h e sh a v eb e e nd o n eo n s e p a r a t i n ga n dp u r i f y i n ga c t i v ei n g r e d i e n t sf r o mg i n s e n gb u d I no r d e r t o i m p r o v et h eb i o a v a i l a b i l i t yo fg i n s e n gb u d ，i ti sn e c e s s a r yt o o b t a i n r e a s o n a b l yl a r g eq u a n t i t i e so fh i g h l yp u r i f i e dc o m p o u n d sf r o mg i n s e n g A B 盯R A C T b u d Ah i g hc o n c e n t r a t i o no fo v e r a l lg i n s e n o s i d e sa n dp o l y s a c c h a r i d e sw a s d e c t e c t e db yS a l k o w s k ir e a c t i o na n df o a me x p e r i m e n t si ng i n s e n gb u d A h i g he f f e c t i v ea n ds t a b i l i t ym e t h o df o ra n a l y s i s i n gt h eg i n s e n o s i d e si n g i n s e n gb u dw a se s t a b i l i s h e d A ne f f c t i v em e t h o do fe x t r a c t i n gb o t ht h e g i n s e n o s i d e sa n dp o l y s a c c h a r i d e si ng i n s e n gb u dw a se s t a b i l i s h e d T h e p u r i t ya n do fg i n s e n o s i d e sa n dp o l y s a c c h a r i d e sc a nr e a c ht o9 0 a n d 9 2 P r o t o p a n a x t r i o ls a p o n i n sa n dp r o t o p a n a x d i o ls a p o n i n sh a v e b e e n s e p a r a t e db yn o r m a l p h a s el o wp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y T h e s i l i c ag e lt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h yw a su s e dt oc h o o s et h em o b i l ep h a s e o fn o r m a l - p h a s el o wp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yW a sc h o s e n V V l n e n u s i n gn - b u t a n o l - e t h y la c e t a t e - w a t e r ( 4 ：1 ：5 ，V ：V ：V ) a st h em o b i l ep h a s e ， t h et w ok i n d so fg i n s e n o s i d e sc a nb e s e p a r a t e de f f e c t i v e l y T h e o p t i m a l i z i n gl o a d i n ga m o u n ta n df l o w - r a t ew a sl e s st h a n4 0 0 m ga n d 10 m l m i n ，t h ed e g r e eo fs e p a r a t i o na n dt h er e c o v e r yw a s81 9 a n d 8 1 3 a tt h i sc o n d i t i o n A c t i v ec a r b o nw a su s e da san e wm e d i ai np r e - p u r i f i c a t i o nG R e b e f o r eP r e p - H P L Cp u r i f i c a t i o n ，e v e ni np u r i f i c a t i o no fo t h e rk i n d so f n a t u r a lp r o d u c t s T h em e t h o do fs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fG R eb y s e l e c t i v ea d s o r p t i o no fa c t i v ec a r b o na n dP r e p H P L Cf r o mg i n s e n gb u d h a s m a n y a d v a n t a g e s ， s u c ha s e a s y ，e f f i c i e n t ，e c o n o m i c a l ， 北京化T 人学硕匕学位论文 e n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l ya n ds u s c e p t i b l et oa m p l i f i c a t i o na n dS Oo n A c e t o n i t r i l ei nw a t e r ( 2 3 ：7 7 ，V ：V ) w a sc h o s e n 懿t h em o b i l ep h a s ew h e n c o n s i d e r i n gt h ep r e p a r a t i o no fl a r g ea m o u n t so fs a m p l e s W h e nt h ef l o w r a t ea n dl o a d i n gw a s6m L m i na n d2 0m g ，t h eG R ec o n t e n to ft h e p u r i f i e dp r o d u c t ，w h i c hh a sb e e np r e - p u r i f i e db ya c t i v ec a r b o na n d p u r i f i e db yP r e p - H P L C ，i s9 8 5 p - D g l u c u r o n i d a s ee n z y m e ( P e n i c i l l i u mp u r p u r o g e n u m ) w a su s e dt o t r a n s f o r m a t i o nt h eg i n s e n o s i d e sf r o m g i n s e n gb u d T h ee n z y m ec a n c o n v e r tg i n s e n o s i d eR b la n dR di n t oR g s W h e nt h et e m p e r a t u r ei s4 5 * ( 2 ， p Hv a l u ei s5 0 ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ee m z y ei s2m g m La n dr e a c tf o r 12h T h et r a n s f o r m a t i o nr a t i oW a s4 9 5 K e yw o r d s ：G i n s e n gb u d ；G i n s e n o s i d e s ；a c t i v ec a r b o n ；P r e p H P L C ； b i o t r a n s f o r m a t i o n 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名： 导师签名： 日期：J 皿与一 日期止立兮一 第一章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 人参系五加科植物( P a n a xg i n s e n gC A M e y ) 的根，是传统名贵中药，始载 于神农本草经。具有补气、益肺、生津、安神等神奇功效。野生者称为“山 参，栽培者称为“园参。其化学成分复杂，主要为人参皂苷、人参多糖、挥 发油和维生素等等。经现代医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成 分，它具有人参的主要生理活性，而人参多糖在抗肿瘤领域亦有广泛的应用。然 而近年来中西方的研究发现，人参最珍贵之处不在于人参根，而在于人参花蕾。 人参花蕾中的人参总皂苷含量是人参根的5 倍，人参总多糖含量是人参根的2 5 倍。我国人参的产量居世界第一位，占世界总产量的7 0 ，长白山人参占全国 人参总产量的9 5 以上，世界上的人参花蕾几乎都产于我国。但是，目前对人 参花蕾的应用主要停留在泡人参花茶上，其有效成分有6 0 没有得到良好的应 用，造成了浪费。对人参花蕾有效成分的地开发和利用，不仅需要对其有效成分 进行综合的提取，更需要采用一些新的分离纯化手段对某种单一组分进一步的进 行分离和纯化，以提高收率，得到高纯度单体。同时，还可以应用现代的生物转 化技术将大量的人参皂苷转化成含量较低但活性更高的单体化合物。本章介绍了 近年来人参皂苷和人参多糖在临床中的应用，分离纯化和生物转化方面的研究进 展。 1 2 人参花蕾的主要成分 人参花蕾( G i n s e n gB u d ) ( 见图1 1 ) ，就是人参的生殖器官。人参花蕾在含 苞待放时，经人工采集，烘干或日晒即成为干品人参花蕾( 见图1 2 ) 。人参生 长在长白山茂密的原始森林中，雨量充沛，温度适宜，土壤有机物含量高，生长 条件极其优越，使人参花蕾吸天地之甘露，受日月之精华，得自然之灵气。人参 一般3 年开花，2 年开花者少见。人参花是伞形花序，其上生着小花4 0 7 0 朵不 定。总花梗较长，在总花梗上还会生出一至几个小花序，生着一至几朵小花。人 参花蕾由花萼、花冠、雄蕊、雌蕊组成。花萼绿色、钟状5 裂，花瓣黄绿色、卵 北京化T 人学颅I 半论女 形或披针形，5 枚，雄蕊淡绿色，5 枚；花药乳自色，短圆形，4 室，背着药， 花丝基部较膨大开花前较短开花后为花药总长的2 倍，开花前，花药围绕在 柱头周围，开花后，花粉散出。雌蕊1 个由柱头、花柱、子房组成，柱头叉状 2 裂，子房2 室，2 心皮，中央边缘胎座，予房下位。一般6 0 0 9 人参年只能 收获1g 人参花蕾，且取之不易。由此可见，人参花蕾比有养生保健第一品之称 的人参更显珍稀。每年六月中下旬是人参花蕾孕育成熟的时节，也是采摘花蕾的 时节。长白山区天然原始森林无任何工业，农业及人为的污染，使这旱出产的人 参花蕾饱满纯正，品质优良而闻名中外。我国年人参花蕾的产量为6 0 一8 0 吨且 大部分集中在吉林延边地区。 盈1 1 人参花蕾 F i g 1 1 1 C h n s e n g B u d 圈l 五千晶人参花蕾 F i g 1 - 2 D e s i c c a t e d G i n s 即g B u d 鬻豢 I 嘻孵目K 第一章文献综述 研究发现人参花蕾中含有二十种皂苷活性物质、十七种氨基酸、十一种微量 元素、三种抗癌活性物质和一些蛋白类物质等。被称为“免疫保健的万能养生品。 本草纲目中记载：人参花性温和，味甘微苦，具有清热消炎、平肝清火、解 毒利咽、降血压、头昏、目眩、失眠、耳鸣、暗疮、青春痘、急性咽喉炎等诸多 医疗保健功能。 人参花蕾的主要有效成分为人参皂苷，总皂苷含量约2 0 。人参皂苷大多 数是白色无定形粉末或无色结晶，味微甘苦，具有吸湿性。人参皂苷易溶于水、 甲醇、乙醇，正丁醇，不溶于乙醚、苯等亲脂性有机溶剂。皂苷常在熔融前就分 解，因此无明显的熔点。甾体皂苷及其苷元的旋光度几乎都是左旋，而且旋光度 与双键间有密切的关系，如未饱和的苷元比相应的饱和化合物为左旋，可用于推 定结构。 根据皂苷元的结构可分为A 、B 、C 三种类型：人参二醇型( A 型) 、人参三 醇型( B 型) 和齐墩果酸型( C 型) 。A 型和B 型皂苷均属四环三萜皂苷，其皂 苷元为达马烷型四环三萜，A 型皂甙元称为2 0 ( S ) 原人参二醇【2 0 ( S ) - p r o t o p a n a x a d i 0 1 。B 型皂苷元称为2 0 ( S ) - 原人参三醇 2 0 ( S ) 一p r o t o p a n a x a t r i 0 1 。 C 型皂苷则是齐墩果烷型五环三萜的衍生物，其皂苷元是齐墩果酸( o l e a n o l i e a c i d ) 。 邱峰等【l 】通过大孔树脂柱色谱，硅胶柱色谱及高效液相色谱法，从人参花蕾 中分离得到1 5 个化合物，并采用与标准品共薄层及与文献瓜，1 3 C - N M R 等数据比 较，鉴定了其中的1 1 个化合物，分别是p - 谷甾醇( 1 ) ，2 0 ( R ) 原人参三醇( 2 ) ，2 0 ( R ) 人参皂苷- R h l ( 3 ) ，2 0 ( R ) - 人参皂苷- R 9 2 ( 4 ) ，2 0 ( S ) 一人参皂苷R 9 2 ( 5 ) ，人参皂苷 - R e ( 6 ) ，人参皂苷一R d ( 7 ) ，人参皂苷R e ( 8 ) ，人参皂苷一R b 2 ( 9 ) ，绞股蓝皂苷XV l I ( 1 0 ) ， 三七皂苷- E ( 11 ) 。其中化合物( 2 ) 为首次从人参花蕾中分得，化合物( 1 0 ) ，( 11 ) 为首 次从人参原植物中分得的三萜皂苷。 除皂苷外，人参花蕾中还含有挥发油、多糖、生物碱、氨基酸和多肤、微量 元素等有效成分。人参花蕾水溶性多糖主要含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、 阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和少量未知糖组分【2 1 。人参中挥发油成分含量约0 0 6 ， 主要有倍半萜类、聚乙炔类化合物、长链饱和羧酸和少量芳香烃类化合物，其中 大部分为倍半萜类化合物。生晒参或鲜参含有Q 人参烯( a p a n a s i n s e n e ) 、p 人参烯、 p 金合欢烯、双环大牛烯( b i c y c l o g e r m a e r e n e ) 、B 一榄香烯( B e l e m e n e ) 、 y - 榄香烯、洳 草烯、a 新丁香三烯( a n e o c l o v e n e ) 、p 草烯、石竹烯、石竹烯醇、p 古芸烯、仅 3 北京化T 人学硕 ：学位论文 芹子烯、p 芹子烯、丫芹子烯、芹子- 4 ( 1 4 ) 、7 ( 11 ) - - - 烯、艾里莫酚烯、十七烷醇 等【3 1 。目前已发现的氨基酸主要有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、 丙氨酸、肤氨酸、撷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖 氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、n 氨基丁酸等成分【4 1 。 人参花蕾中所含微量元素的种类和含量有一定差异，目前己发现的微量元素 有S i 、P 、S 、C l 、K 、C a 、S c 、V 、M n 、F e 、C o 、C u 、Z n 、G e 、A s 、R b 、S r 、 C s 、B a 、L a 等。其中人参与西洋参中M n 、F e 、C u 、C o 、Z n 的含量均较高，微量 元素S r 、M n 、F e 、C o 、C u 、Z n 的含量大致相近网 1 3 人参花蕾中人参皂苷的药理作用 人参皂苷被公认为是人参花蕾的主要活性成分，它几乎可以重现人参花蕾粗 制剂的全部生理活性。人参花中人参总皂苷含量是人参根茎的5 倍，人参花蕾成 份能全面有效地调节人体细胞的阴阳平衡，改善细胞代谢水平，增强机体功能， 恢复人体内各组织器官、系统功能，进而达到消除疲劳、延缓衰老的效果。使人 体处于最佳状况，增强免疫力，缓解疲劳，延缓衰老，有效防治动脉硬化、高血 脂、高血糖以及更年期综合征，恢复人体健康。人参花蕾中的人参皂苷R b I 、R g l 非常均衡。R b l 对中枢神经系统有抑制作用，能使兴奋的神经系统镇静下来，安 定精神、消除焦虑、缓解精神压力，有改善失眠和神经衰弱，使中枢神经系统安 定的作用。R g l 皂甙能使中枢神经亢进，对精力不足、易感疲劳的人有效果，具 有滋养强壮、消除疲劳、活化细胞、使中枢神经系统兴奋的作用。 1 3 1 人参皂苷对血液的作用 1 3 1 1 人参皂苷的溶血性和抗溶血性 溶血是皂苷的特性之一，成为单体皂苷作为注射剂使用时的最大障碍【6 】。皂 苷可与血红细胞壁上的胆甾醇结合生成不溶性分子复合物沉淀，造成血红细胞正 常渗透性被破坏而发生崩解。然而人参总皂苷并没有明显的溶血作用【7 1 ，但经分 离纯化后的单体皂苷却分剐具有截然相反的溶血和抗溶血作用，而且其溶血和抗 溶血作用的强弱和浓度之间存在着近似的曲线关系 s l 。程大任等【9 1 通过对几种单 4 第一章文献综述 体人参皂苷溶血、抗溶血作用进行研究，得到人参皂苷浓度与溶血度间的关系曲 线，发现其作用规律为原人参皂苷三醇型人参皂苷R e 、R 9 2 、2 0 ( R ) R g a 、2 0 ( S ) 一R g a 和R h t 都具有抗溶血作用，其q 2 0 ( R ) R g a 、2 0 ( S ) 一R g a 和弛在较高浓度时表现出 溶血作用；原人参皂苷二醇型人参皂苷R b l 、R b 2 、R e 和R d 均表现出抗溶血作用， 其中R d 还在浓度较高时才表现出了溶血作用。齐墩果酸型人参皂苷R o 在较低浓 度便表现出抗溶血作用，未见溶血作用。 1 3 1 2 人参皂苷对白血病细胞的作用 白血病是一种造血系统的恶性肿瘤，又称“血癌 。其特点是骨髓及其它造 血组织中有大量无核细胞无限制地增生，并进入外周血液，将正常血细胞的内核 明显吸附，该病居年轻人恶性疾病中的首位，原生性病毒可能是神经性负感组织 增生，还有许多因素如食物的矿物放射性化、毒化( 苯等) 或药物变异、遗传素 质等可能是致病的辅因子。根据白血病细胞不成熟的程度和白血病的自然病程， 分为急性和慢性两大类。化疗是治疗白血病的主要手段，但化疗药物的毒副反应 及其耐药性仍然是目前难以解决的问题。某些中药具有抗白血病作用，而对正常 细胞的损伤小的优点，因此，国内外研究者们正在寻找抗白血病的中药，并提取 和分离出其中的有效成分，进行药效学及其作用机理研究，试图开发高效低毒的 治疗白血病的潜在或辅助药物，有助于提高疗效、减少化疗毒副反应、改善生活 质量、延长生存期等。近年来已有研究表明人参皂苷能抑制白血病细胞增殖、促 进凋亡、诱导分化、能增加化疗药物的敏感性和逆转耐药等作用【l o l 。 高瑞兰等【l l l 采用白血病祖细胞集落形成( C F U A g E ) 培养法结果显示T S P G 对白血病祖细胞的影响不同于正常白细胞，不同的浓度显示为增殖或抑制的双向 作用。陈地龙等【1 2 】采用细胞体外培养技术，i i E B 芟 人参多糖( G P S ) 能N 显抑带J K 5 6 2 细胞增殖并能诱导其凋亡并使K 5 6 2 细胞向成熟方向分化。戴勤等【1 3 】采用造血细 胞体外培养形态学观察免疫细胞化学流式细胞术等实验血液学技术证明G P S 可 能通过阻止H L 6 0 细胞从静止期G O 期进入增殖周期S G 2 + M 期抑制D N A 的合成等 途径进而抑制细胞的增殖，提示G P S 有可能成为既能促进正常造血又能抑制人白 血病等肿瘤细胞增殖的天然诱导剂。李勇等【1 4 】发现人参皂苷R b I 可上调H L - 6 0 细 胞G R a m R N A 及G R 蛋白的表达并抑制细胞生长。李世辉等【1 5 】通过测定药物干预 前后细胞上清液中肿瘤坏死因子、巨噬胞炎症蛋白的水平。结果显示人参皂苷 R h 对S P 2 0 骨髓瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用，且这种作用有周期特 5 北京化T 大学硕 ：学位论文 异性。曹唯希等【1 6 】发现人参总皂苷对K 5 6 2 细胞有增殖抑制作用，并可诱导K 5 6 2 细胞凋亡明显增加，同时细胞F 私表达升高。且推论人参总皂苷能诱导K 5 6 2 细胞 凋亡，其机制可能与调控F a s 表达升高有关。牛泱平等旧发现人参皂苷能够抑制 H L - 6 0 细胞生长，在一定剂量和时间范围内可引起细胞凋亡，可为临床应用人参 皂苷作为化疗药物的辅助剂治疗白血病提供实验依据。李朝晖【强】发现人参皂苷 R g l 呈剂量依赖性的将细胞阻滞于G 1 期，使G l 期不能运行到S 期，从而影响了肿 瘤细胞的有丝分裂，并且在低于G 0 G 1 期出现典型的凋亡峰。细胞形态学观察可 见分裂细胞以及凋亡细胞。陈小红等【1 9 】证明G S 在一定浓度范围内可抑带l J J u r k a t 细胞增生，并能够诱导其凋亡，为临床应用提供理论依据。陈地龙等1 2 0 采用细胞 体外培养技术，光镜和电镜观察细胞形态变化；联苯胺染色、P O X 染色、a N A E 细胞化学染色发现T S P G 协同细胞因子对K 5 6 2 细胞的诱导作用与T S P G 单独作用 相比，K 5 6 2 细胞形态学更趋向于成熟；血红蛋白、过氧化物酶的表达明显增加； 细胞表面分化抗原C D l 5 、H I R 2 、E P O R 、G M C S F R 的表达明显增强。 高瑞兰等f 2 l 】发现人参总皂苷可使常规的化疗药物对白血病细胞的抑制作用 增强。王一等【2 2 】观察到经人参皂苷、三氧化二砷及p 榄香烯作用后，K 5 6 2 细胞株 端粒酶活性下降，下降程度呈浓度、时间依赖性，在一定浓度及作用时间后端粒 酶呈阴性；细胞的存活率下降；并推论抑制端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用的机 制之一：其后王一等【2 3 】又发现抑制端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用的机制之一。 周烨等【2 4 】运用基因芯片技术证明T S P G 刺激K 5 6 2 细胞后，影响了细胞内一系列基 因的表达。这些基因可能与T S P G 的抗肿瘤机制有关。陈小红等【2 5 】选用K 5 6 2 N C R 、 K 5 6 2 A d r 两耐药细胞株作为靶细胞，液体培养和半固体集落培养法及M T T 法观 察到G S 通过提高耐药细胞对化疗药物的敏感性而与化疗药物起协同作用，同时 在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖。立彦等【2 6 】发现可以通过人参皂 苷R b l 抑f l ；l J p g p 的功能，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，对于今后研究和 发展肿瘤治疗来说有十分重要的意义。 1 3 2 人参皂苷对神经系统的作用 张云峰掣2 7 1 对人参皂苷对神经系统的作用进行了综述，提出人参皂苷对神经 系统的作用表现在以下几个方面： 6 第一章文献综述 1 3 2 1 对记忆、学习和神经保护作用 人参皂苷R b l 、R g l ；F 臼R e 能减缓东莨菪碱所诱导产生的记忆缺失。中枢胆碱能 神经系统与学习和记忆过程有关，R b l 能增加中枢胆碱能神经末梢对胆碱的摄取， 并促进海马脑片中乙酰胆碱的释放【2 引。通过增强胆碱能神经元的活性，R b l 和R g l 均能部分逆转东莨菪碱诱发的遗忘症。这些结果揭示，人参皂苷可以促进学习和 记忆能力提高，且能促进神经突触的生长 2 9 , 3 0 。人参对樟柳碱和戊巴比妥所致记 忆获得障碍，对环已酰亚胺和N a N 0 2 所致记忆巩固障碍，对3 0 - - 4 0 酒精造成的 记忆再现障碍以及1 B A ( 2 5 3 5 ) 所致的记忆缺失均有显著的改善作用。研究表明， R g l 可改善记忆全过程，I 地l 对记忆获得和记忆再现过程有易化作用。L T P ( 突触长 时程增强) 是神经可塑性的表现之一，与学习记忆关系密切。R g l 能增强大鼠海马 齿状回( D G ) 基础突触传递活动和高频电刺激所诱导的L 1 瞪。人参皂苷对神经元缺 血性损害也有保护作用。体外研究表明R b l 能使海马神经元免受致死性缺血损害 【3 l 】。 1 3 2 2 对神经递质的调节 体外研究表明人参皂苷通过降低对神经递质的利用，可调节神经递质的释 放。人参提取物抑制大鼠突触小体对Y 一氨基丁酸( O A S A ) 、谷氨酸、多巴胺、去 甲肾上腺素和5 羟色胺等摄取。人参皂苷可与O A B A 。和G A B A b 受体的激动剂竞争 受体结合位点【3 2 】。 1 3 2 3 抑制兴奋性神经毒性 缺氧时海马C A l 区兴奋性氨基酸的突触小泡明显减少甚至耗竭，而人参总皂 苷( G T S ) 能抑制缺氧时兴奋性突触小泡递质的释放 3 3 1 。在培养的神经细胞上，人 参总皂苷能减少神经元谷氨酸的释放，增加神经胶质细胞对谷氨酸的再摄取【卅。 N - 甲基一D 天冬氨酸( N M D A ) 诱发电流增大反映缺氧引起海马神经元N M D A 受体 过度激活或数量增加。 1 3 2 4 增强抑制性神经活性 缺血缺氧时，抑制性氨基酸释放增加，而其受体功能下降，从而使细胞内外 7 北京化T 人学硕l ：学位论文 的离子更加不平衡，导致细胞损伤。实验发现有7 种人参皂苷单体对C t 型的甘氨酸 受体所介导的内向电流具有增强作用，呈剂量依赖性和可逆性，这7 种单体作用 强度的顺序为：R b l R b 2 R 9 2 R c R f R g l I 瞄捌。 1 3 2 5 降低细胞内钙离子的浓度 缺血缺氧性脑损伤与细胞内钙离子超载密切相关，G T S 能有效防止缺血引起 的皮层和海马细胞内钙离子的增高。 1 3 3 人参皂苷的抗癌机制 国内外学者通过研究证实了人参皂苷对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用，并 阐明该作用是通过诱导分化和引起细胞凋亡而达到的。此外，人参皂苷又具有抑 制肿瘤新生血管形成、逆转多药耐药及调节免疫功能等多靶点效应，从而在分子 生物学和细胞生物学方面为其作为抗肿瘤药物奠定了基础。 陈文真等【3 6 1 对人参皂苷的抗癌机制进行了综述，其具体表现在以下几个方 面： 1 3 3 1 抑制增殖，诱导调亡 肿瘤的增长不仅是一个增殖不受调控的问题，还与细胞调亡减少有关。细胞 增殖与凋亡之间的平衡对于判定肿瘤在整体上是增长还是消退至关重要。 1 3 3 2 抑制肿瘤新生血管形成 新生血管形成是实体瘤快速增长所必需的先决条件之一。一方面，新生血管 可以为肿瘤细胞带来丰富的氧气和养料，并将废物带走；另一方面，肿瘤细胞可 以通过新生的血管向远处转移。 1 3 3 3 逆转多药耐药 多药耐药( M D R ) 基因过度表达是肿瘤细胞产生耐药的重要机制之一，也是影 响化疗效果进一步提高的因素之一。经典的M D R 形成机制认为，抗肿瘤药物诱 发了M D R 1 基因和其编码的P 1 7 0 的过度表达。 8 第一章文献综述 1 3 3 4 调节免疫功能 调节细胞产生细胞因子和介导多种免疫效应是人参皂苷发挥抗肿瘤作用的 机制之一。研究表明，人参皂苷R 勖可明显提高小鼠碳粒廓清速率，提高荷瘤小 鼠的免疫器官( 脾脏、胸腺) 重量、血清溶血素含量、B 淋巴细胞转化能力、N K 细 胞活性，从而提高小鼠非特异性免疫和特异性免疫功能。人参皂苷R h 2 注射液能 提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，增加血清溶血素抗体生成能力，促进小鼠 脾N K 细胞杀伤活性和I L 2 活性。R 自对机体的免疫调节作用可能是通过其肠内菌 代谢产物I m l 入血后直接对T 、B 淋巴细胞和巨噬细胞作用的结果。此外，淋巴因 于激活的杀伤细胞L 擞过继输入疗法是一种已经被证明是有效的抗肿瘤免疫治 疗措施。但此疗法的临床应用却受到L A K 细胞抗肿瘤活性低，I L - 2 用量大而导致 毒性反应等问题的困扰。人参皂苷可与I L - 2 协同诱导外周单个核细胞制成人参皂 苷L A K 细胞，该细胞在增殖数量和杀伤恶性脑胶质瘤细胞活性等方面均优于L A K 细胞，且能明显减少I L 2 的用量。 1 3 4 人参皂苷的其他药理作用 吕爽【3 乃通过几种休克模型来揭示人参皂普R c 的抗体克作用，使其作为抗休 克的辅助药物应用于临床。褚燕琦掣3 8 】研究发现人参皂苷对蛋白磷酸酶抑制剂 O A 所致的神经细胞病理变化有明显的保护作用，可能是通过抑制t a l l 蛋白过度磷 酸化，防止细胞凋亡来发挥作用的，提示该药在防治A D 方面可能具有良好的应 用前景。贾桂燕等【3 9 】通过体外实验分别测定脂肪分解活性、小肠刷状缘膜小囊 吸收脂肪酸、三油酸甘油酯油酸的释放率。发现西洋参总皂苷和人参皂苷R e 、 R b l 、R b 2 可以通过抑制胰脂肪酶活性起到降脂作用。 1 4 人参皂苷的提取方法 1 4 1 溶剂提取法 溶剂提取法是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对目标成 分溶解度大，对不需要成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出 来的方法。天然产物成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、 9 北京化T 大学硕l ：学位论文 亲本性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。 l 、浸渍法 浸渍法是将原料用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡出有效成分的一种 方法。具体做法将人参粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂( 如乙醇、 甲醇、水等) ，间断式搅拌或震摇，浸渍至规定时间使有效成分浸出。浸渍法方 法比较简单易行，但时间长，浸出率较差，且( 如用水为溶剂) 其提取液易于发 霉变质，一般应加入适当的防腐剂。张春红娜】等采用温度6 0 。C ，提取时间2 h ，溶 剂量为浸提物的l O 倍量的浸渍法提取人参皂苷，总皂苷的最高得率达8 3 3 。 2 、渗漉法 渗漉法是将人参粉末装在渗漉器中，顶部用纱布覆盖，压紧，不断添加新溶 剂( 如乙醇水溶液) ，溶剂渗过原料层往下流动过程中将与有效成分浸出的一 种办法。当溶剂渗进人参基质溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀 浸液便置换其位置，形成良好的浓度差，使扩散能较好地进行。取人参2 0 0g ， 加入过量的5 0 乙醇浸泡1 2h ，控制渗漉液流速2 5 滴分钟，渗漉7 天，进行高 效液相测量，I 吨l 、R e 和总皂苷的含量分别为1 4m g g 、1 8m g g 和3 2m g g I 。 该方法由于人参组织周围皂苷浓度差较大，因而皂苷的传质动力较大，提取速率 相对较快，故渗漉效果优于浸渍法，且提取液杂质含量低。总体来说，渗漉法效 果要比浸渍法高，提取比较完全，但溶剂用量大。 3 、煎煮法 煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法，是指用水作溶剂，将被提物加热 煮沸一定时间，以提取其有效成分的一种常用的方法，又称煮提法或煎浸法。该 法使用于有效成分能溶于水，对湿，热均稳定且不易挥发的原料。所用容器一般 为陶器、砂罐或铜制塘瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时 常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。人参( 切片) 2 0 0 9 ，煎煮3 次，分别 加入1 0 倍量水、8 倍量水、6 倍量水煎煮2h 、1 5h 、l 小时合并煎煮液，进行 高效液相测量R g i 、R e 和总皂苷的含量分别为1 1m g g 、1 7m g g 和2 8m g 9 9 4 。 煎煮法的优点是溶剂用量小，提取速率快，缺点是受热不均匀，容易引起有效成 分的结构变化，提取率不高。 4 、回流提取法 回流提取法是用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分，将浸出液加 热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料， 1 0 第一章文献综述 这样周而复始，直至有效成分回流提取完全的方法。回流法提取液在蒸发