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复旦大学 硕士学位论文 超临界CO流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的研究 姓名：李华 申请学位级别：硕士 专业：环境科学 指导教师：陈建民 20040428 摘要 天然产物传统提取方法不仅会导致现有天然产物药质量难控制、 疗效不 稳定、 实验结果重复性差、 溶剂残留等问题， 而且对环境也造成严重的污染。 因此， 借助现代高新技术手段， 改革传统的提药制药工艺， 寻找新的提取方 法，采用清洁无污染的工艺对环境保护具有十分重要的意义。 超临界流体萃取是近几十年来发展较快的一种新的提取和分离技术， 它 具有独特的优点， 在很大程度上避免了 传统提药制药过程中的缺陷， 而且对 环境保护也具有十分重要的作用。 我们的研究就是为了 探索采用超临界C 0 2 流体萃取法从红豆杉中提取紫杉醇及其伴生物的可行性及最佳工艺条件， 以 实现清洁生产。 国内外对于采用超临界流体萃取法提取分离紫杉醇己开展了 研究， 但他 们的研究还存在一些不足之处。 本论文在吸收前人研究成果的基础上， 对超 临界流体萃取法提取紫杉醇进行了更加深入的研究，主要包括以下几个方 面: 首先，比较详细的研究了超临界 C 0 2 流体萃取法提取紫杉醇的工艺条 件包括修饰剂、 萃取压力、 萃取温度、 C 0 2 流量、 原料粒度和萃取时间等因 素， 确定最佳的萃取条件是温度为4 0， 压力为2 7 .6 MP a ， 修饰剂为甲醇二 水( 8 0 :2 0 ) ， 修饰比为2 0 ， 吸收液为甲 醇， 收集时间为4 h 。 在上述条件下 运用超临界C 0 2 流体萃取法对浆果红豆杉枝叶中紫杉醇及其伴生物1 0 - D A B I I I 和 t a x i n e B也进行了提取分离的研究。 其次， 探索了 采用超临界 C O : 流体萃取法进行较大量紫杉醇提取实验 的 条 件。 详细分 析了 用 超临界C O : 流 体萃取法 从5 k g 天 然或种 植的 南 方红 豆杉中提取紫杉醇及其伴生物t a x a c i n 的提取情况。 对提取物中的t a x a c i n 运 用简便的分离方法，可使其百分含量达9 4 %以上。 最后.对超临界 C 0 2 流体萃取法和传统提取法从各种红豆杉枝叶中提 取紫杉醇及其伴生物进行了详细的比较。与传统提取法相比，超临界 C O Z 流体萃取法可以同时实现对各提取产物的粗分离， 它对紫杉醇及其伴生物的 提取率和选择性更高， 而且流程简单、 步骤少、 耗时短、自 动化程度高， 生 产周期短，效率高，是一种环境友好的提取方法。 关键词:超临界流体萃取:紫杉醉;3 0 - D A B I I I : t a x a c i n : 提取;分离 Ab s t r a c t P r e v i o u s l y , t a x a n e s h a v e b e e n e x t r a c t e d f r o m y a w t r e e b y l i q u id s o l v e n t e x t r a c t i o n . T h e l a r g e q u a n t i t i e s o f o r g a n i c , a n d o f t e n c h l o r i n a t e d , s o l v e n t s u s e d a r e , h o w e v e r , b o t h e x p e n s i v e a n d e n v i r o n m e n t a l l y u n f r i e n d l y . Ma n y s t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d t o o v e r c o m e s u c h p r o b l e m s a n d t o p r o v i d e a l t e r n a t e r o u t e s f o r o b t a i n i n g t a x o l a n d it s r e l a t e d a n a l o g u e s . I n t h i s t h e s i s , a s u p e r c r i t i c a l fl u i d e x t r a c t i o n b a s e d s e p a r a t i o n p r o c e s s h a s b e e n d e v e l o p e d f o r t h i s p u r p o s e S u p e r c r i t i c a l fl u i d e x t r a c t i o n o f f e r s a n u m b e r o f a d v a n t a g e s o v e r m o r e c o n v e n t i o n a l s e p a r a t i o n t e c h n i q u e s . S u p e r c r i t i c a l c a r b o n d i o x i d e a s s o lv e n t i s a c l e a n a l t e r n a t i v e , a n d h a s c h e m i c a l a n d p h y s i c a l p r o p e rt i e s w h i c h m a k e i t p a r t i c u l a r l y u s e f u l i n e x t r a c t i o n . T h e f o l l o w i n g s t u d y d e s c r i b e s t h e u s e o f s u p e r c r i t i c a l c a r b o n d i o x i d e fl u i d a s a n a l t e rna t i v e t o l i q u i d s o lv e n t s f o r e x t r a c t i o n o f t a x o l a n d i t s r e l a t e d a n a lo g u e s f r o m b r a n c h e s a n d l e a v e s o f y a w t r e e F i r s t l y , t h e c o n d i t i o n s p r o v i d i n g h i g h e s t r e c o v e ry o f t a x o l a n d i t s r e l a t e d a n a lo g u e s s u c h a s 1 0 - D A B I I I a n d t a x i n e B b y s u p e r c r i t i c a l c a r b o n d i o x i d e fl u i d e x t r a c t i o n m e t h o d w e r e a s f o l l o w : t e m p e r a t u r e , 4 0 0C ; p r e s s u r e , 2 7 . 6 MP a ; c o - s o l v e n t , m e t h a n o l - w a t e r ( 8 0 : 2 0 ) ; v o l u m e r a t i o o f c o - s o l v e n t , 2 0 p e r c e n t ; a b s o r b e n t , me t h a n o l ; e x t r a c t i o n t i m e , 4 h o u r s S e c o n d l y , t h e a n a l y s i s o f t a x o l a n d i t s r e l a t e d a n a lo g u e s t a x a c i n w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g s u p e r c r i t i c a l c a r b o n d i o x i d e fl u i d e x t r a c t i o n f r o m 5 k g b r a n c h e s a n d l e a v e s o f n a t u r a l l y g r o w i n g o r p l a n t e d T a x u s c h i n e n s i s v a r . m a ir e i . T h e c o n t e n t o f t a x a c i n c a n e as i l y b e a b o v e 9 4 p e r c e n t b y f u t h e r s e p a r a t i o n . L a s t b u t n o t t h e le a s t , t h e s t u d y o f s u p e r c r i t i c a l fl u i d e x t r a c t i o n w a s c o m p a r e d w i t h l i q u i d s o l v e n t s e x t r a c t i o n , t h e a d v a n t a g e o f s u p e r c r i t i c a l fl u i d e x t r a c t io n l i e s i n : s i m p l e p r o c e s s ; f e w s t e p s ; s h o r t t i m e ; n o t i c e a b l y h i g h e r r e c o v e ry ; h i g h s e l e c t i v it y a n d e n v i r o n m e n t a l f r i e n d ly K e y w o r d s : s u p e r c r i t i c a l fl u i d e x t r a c t i o n ; t a x o l ; 1 0 - D A B I I I ; t a x a c i n ; e x t r a c t i o n ; p u r i f i c a t i o n 超临界Cl 流体萃 取法提取紫杉醉及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 第一章引言 1 . 1天然产物提取中的污染问 题 关于天然产物提取的科学研究， 始于1 9 世纪初， 从鸦片中分离得到吗啡。 天然产物传统的提取方法有煎煮法、浸溃法、渗谁法、回流提取法、水蒸气 蒸馏法等。我国古代医籍中就有用水煎煮、酒浸渍提取药材的记载。天然产 物药常用的提取方法为浸渍法，常用的浸提溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、 石油醚、氯仿、苯等，但考虑到安全问题.实际上绝大多数情况下，可供选 择的 溶 剂 只 有 水 和乙 醇 14 1 天然产物传统的提取方法主要是以水和有机溶剂为溶媒，在较高温度下 长 时间提取，这种方法本身存在许多固有缺陷: ( I ) 除用水作溶剂外， 其余有机溶剂都是于健康不利的或有害的， 不仅 萃取分离溶剂十分费事，而且溶剂残留不可避免。特别是对含淀粉、糖和其 他粘性物质较多的原料，要从产物中完全除去有机溶剂是相当困难的; ( 2 )提取温度高，时间长，一些对光、热不稳定的物质易受破坏。特别 是在提取过程中常常伴随有分解、水解、醇解、沉淀等反应发生，其结果是 不仅使产品的质量难以 稳定控制，而且由于改变了天然组分本来的面目 和特 征，给后来的药理药效研究带来了一系列不确定的因素; ( 3 ) 提取步骤多， 流程长， 生产效率低， 产物损失大， 特别是对一些挥 发性强的组分更是如此; ( 4 )由于传统提取多采用静态提取， 存在着平衡浓度限制问题，因而很 难做到完全提取，提取产率低，选择性差，药材原料浪费严重; 8 0 从东北红豆杉 ( T a x u s c u s p i d a t a ) 中 提取紫杉醇6 小时， 该方法对紫杉 醇的提取率是传统提取方法的 1 .5 倍以上。 N a i r 3 5 1 用含有。 .0 0 1 一1 5 % 丙 酮或乙 睛的 超临界C 0 2 流体 在4 3 .6 M P a , 3 5 从东北红豆杉萃取到。 .0 9 7 % o 的 紫杉醇。上样量约为1 0 .0 g . 2 .4本 文的 研究内 容 由于红豆杉属植物的资源稀少， 当前国内外采用超临界流体萃取法提取 紫杉醇的研究中还存在一些不足之处， 特别是红豆杉用量较小， 无法对工业 化生产可行性进行评价， 对同时实现紫杉醇伴生物的分离缺乏认识等， 本论 文所进行的研究旨 在对这些方面进行充实和完善。 2 . 4 . 1当 前国内 外研究中 存在的 不 足 ( 1 )对种植资源研究不足 采用超临界流体萃取法提取紫杉醇的研究， 己 涉及多种红豆杉种类， 但 主要集中在对天然红豆杉树皮、 枝叶的提取， 迄今为止尚未有人对种植红豆 杉树种进行研究。 由于天然红豆杉的资源限制和生态保护的需要， 从种植资 源中获取有重要药用价值的紫杉醇及其伴生物具有极高的现实意义。 ( 2 )对紫杉醇伴生物的研究不足 为了获取紫杉醇，同时又保护红豆杉稀少树种，国外开展了红豆杉树 的矮壮化及组织培养法， 还有半合成及全合成紫杉醇的工作。 然而，由于培 养法每天仅获得纳克的量， 全合成得率又较低3 6 1成本巨大， 难以 商业化 应用。因而目前的研究重点是半合成，半合成方法最著名的是P o t i e r - G r e e n e 合成路线(3 7 1 ， 主要原料1 0 一 去乙酞基巴 卡亭I I I ( I O - D A B m) 来源于红豆杉植物 超临界c o . 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 中， 分子结构如图2 - 3 ( a ) 所示。 在红豆杉枝叶中含有大量具有重要价值的 紫 杉醇伴生 物， 除了1 0 - D A B I I I ， 还 有紫 杉 碱B ( t a x i n e B ) 和t a x a c i n ， 分 子结 构 分 别 如图2 - 3 ( b ) 和图2 - 3 ( c ) 所示。 紫 杉 碱B 含 量高 于 紫杉 醇1 0 倍以 上 3 8 1 而 经结 构 改 造具 有 抗 癌活 性 很强 的 化 合 物官 能 团 3 9 ; 以 往ta x a c in 是 从东 北 红 豆杉和中国 红豆杉中分离 得到的 (4 0 -4 2 1 ， 而未 见从南 方红豆杉中 提取得到 t a x a c i n的报道，本实验所用的超临界 C 0 2 流体萃取法从南方红豆杉中分离 到t a x a c i n ，且能以简便的方法提纯到百分含量9 4 %以上。 天然红豆杉己被我国列为一级濒危植物， 考虑到生态资源保护， 从红豆 杉树中提取 l 0 - D A B I I I 和紫杉碱 B等紫杉醇的伴生物是获得半合成原料的 最佳来源。 .、 阮6 NO口 OAc 八字 - / _ H O A c 叫Ho决 ，. 图2 - 3 分子结构式 ( a ) 1 0 - D A B I I I , C 2 9 H 3 6 0 1 0 ，分子量5 4 4 ; ( b ) 紫杉碱B , C 3 3 H 4 s N O s . 分子量5 8 3 ; ( O t a x a c i n , C 4 4 H 4 8 0 1 5 ， 分子量 ( 3 )对红豆杉属植物的种类和样品用量研究上的不足 本章2 .3 中提到的各个研究中，由于红豆杉资源分布的限制， 基本上都 是对某一种红豆杉的研究，没有涉及多种红豆杉，也没有对南方红豆杉 ( T a x u s c h i n e n s is v a r m a i r e i )进行过研究。此外，由于设备和资源的限制， 这些研究所用的样品量都比较少， 文中有确实数据可查的研究工作大部分都 只 用了 几 克 3 0 , 3 1, 3 5 1最多 的 也 只 有8 0 梦3 。 对 于 采 用 超 临 界 流体 萃 取 法大 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 量提取紫杉醇及其伴生物的研究尚无人涉及。 2 . 4 . 2本文的研究重点 本论文在前人的基础上， 对超临界流体萃取法提取紫杉醇作了 进一步的 研究，主要包括以下几个方面: ( 1 )对天然浆果红豆杉、种植曼地亚红豆杉、天然西藏红豆杉和天然 及种植南方红豆杉都进行了 样品量较少的超临界流体萃取实验， 并对放大工 艺进行实验条件的探索。 ( 2 ) 对天然和种 植的 南 方红豆 杉进行了 样品 量为5 k g 的 超临界 流体萃 取研究。 ( 3 )对用超临界流体萃取法提取分离紫杉醇的伴生物 1 0 - D A B 1 1 1 . t a x i n e B和t a x a c i n 也进行了分析。 超临界C A 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的 研究 复旦大学硕士学位论文 第三章超临 界C O : 流体萃取法提取少量紫衫醇 及其伴生物的研究 3 . 1 实验准备 3 . 1 . 1 原料与试剂 浆果红豆杉: 甲醇 ( 分析纯) 、乙酸乙醋 ( 分析纯) ;正己烷 H P L C 专用去离子水，甲醇 ( 色谱纯) 、乙睛 ( 色谱纯) : 7 ( C 0 2 ) 为9 9 . 9 9 9 %。 3 . 1 . 2 仪器与设各 ( 1 )超临界流体萃取设备:美国I S C O公司S F X 2 2 0 型S F E 装置如 图3 - 1 所示。 图3 - 1 I S C O公司S F X 2 2 0 型S F E装置 ( 2 ) 反相分 析型 高 效 液相色谱。 美国惠 普公司的A g i l e n t 1 1 0 0 系 列液 相色谱， 包括溶剂箱、四元梯度泵、 真空脱气机、 标准微量自 动进样器、 恒 温柱温箱、可变波长检测器( V W D ) 。赛洋 1 .2 G台式计算机( A g i l e n t C h e m S t a t i o n 4 .0 9 .0 1 色 谱I 作站 ) .日 本S H I S E I D O 公司C A P C E L L P A K C I S 分析 色谱柱 ( 4 .6 m m I .D . x 2 5 0 m m , 5 “ m ) . ( 3 ) L C / M S( 液质联用) 。 T h e r m o F i n n i g a n 公司的L C Q A D V A N T A G E M S S Y S T E R M，包括T S P 高效液相色谱系统和L C Q A D V A N T A G E 质谱检 测仪， X c a l ib u r 1 .0 .0 1 。M e t a c h e m公司的T a x s i l - 3 柱 ( 4 .6 m m S .D . x 2 5 0 m m , 5 w m ) . 质谱分析条件为电 喷雾化学解离( E S I ) 和大气压化学电 离( A P C I ) . 超 临 界C O s 流 体 萃 取 法 提 取 萦 杉 醉 及 其 伴 生 物 的 研 究 复旦大学硕士学位论文 E S I 壳气为7 0单位，辅助气为1 5单位，源电压为6 K V ，加热毛细管温度 为2 5 0 C, 蒸发器温度为4 6 5 C . A P C I 壳气为6 5 单位， 辅助气为2 0 单位， 源电压为4 .5 K V.加热毛细管温度为3 5 0 。 其他仪器有上海申生科技有限公司R 5 0 1 型旋转蒸发仪; 河南省巩义市 英峪豫华仪器厂S H Z - C型循环水式多用真空泵; 2 x Z - 1 型旋片式真空泵; 德 国S a rt o r i u s B P 2 1 1 D型精密电 子天平;上海市实 验仪器总厂Z K - 8 2 A型真空 干燥箱; 法国M i l l i p o r e 公司的M i l l i - Q 水纯化系统。 3 . 1 .3 分析条件 反相分析型 H P L C测定条件:柱温为 3 5;流动相为甲醇: 乙睛: 水= 3 0 :3 0 :4 0 ( 体积比 ) ， 流速为1 . 0 m L / m i n ; 紫外检测波长2 2 7 n m ; 每次 进样体 积为1 0“ L ; 用t o ( 紫杉醇) = 9 9 .5 % 绘制外标工作曲 线， 对样品 进行定量分析; 质谱分析 条件为电 喷 雾 化学 解离 ( E S I ) 和 大气 压化 学电 离( A P C I ) , E S I 壳气为7 0 单位， 辅助气为1 5 单位， 源电 压为6 k V ， 加热毛细管温度为2 5 0 ，蒸发器温度为4 6 5 . A P C I 壳气为6 5 单位，辅助气为2 0 单位，源电 压为 4 .5 K V ，加热毛细管温度为 3 5 0。液相色谱流动相为 A C N :H Z 0 = 5 1 :4 9 ，流速为0 . 8 m L / m i n ， 柱箱温度为4 0 ，检测波长为2 2 7 n m 。吸光 度用A表示，质荷比用n r/ Z 表示，质量数丰度用I 表示。 3 .2 实验方法和步骤 3 .2 . 1 原料制备 将红豆杉枝叶在5 0 真空干燥7 2 h ， 然后将枝叶粉碎， 0 . 1 8 - 0 .2 5 m m. 0 . 3 8 - 0 . 8 3 m m以及2 - 8 m m的红豆衫枝叶样品 分别得到粒径为 3 . 2 .2 超临界Coy 流体萃取法提取紫衫醉的工艺条件的研究 萃取原理如图3 - 2 所示， 其流程为: C 0 2 和修饰剂分别由C O z 泵和修饰 剂泵打入各泵的锥形腔体中，再经流体混合器按设定的比 例混合后，流入萃 取器中的集流腔。在达到萃取设定的温度和压力后，萃取器开始萃取.动态 萃取时，超临界C 0 2 流体经限流管流入收集瓶后减压排放，流体带出的萃取 所得物则溶于收集液中予以收集。 超临界流体萃取与许多因素有关，修饰剂、萃取压力、萃取温度、流体 流量、床层空隙率以及萃取物料颗粒大小等均会对萃取效率的产生影响。下 面的实验将对这些因素分别进行考察，并由此选择较佳的萃取工艺条件进行 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的 研究 复旦大学硕士学位论文 大量红豆杉的超临界流体萃取. 3 . 2 . 2 . 1 修饰剂的选择 因为超临界C 0 2 流体对极性较强的物质溶解能力较差，加入少量第二组 分溶剂可大大增加其溶解能力， 这种溶剂称为助溶剂， 也称夹带剂或修饰剂。 修饰剂可以从两个方面影响溶质在超临界流体中的溶解度和选择性。一是溶 齐 的密度;二是溶质与修饰剂分子间的相互作用。一般来说，少量修饰剂的 加入对溶剂气体的密度影响不大，甚至还会使超临界液体密度降低;而影响 溶解度与选择性的决定因素就是修饰剂与溶质分子间的范德华作用力或修饰 齐 U 与溶质有特定的分子间作用，如形成氢键及其它各种化学作用力等。在植 物药提取中，修饰剂的使用就应尽量避免使用那些有害的物质。一般常用的 修饰剂有水、甲醇、乙醇、乙酸乙酷等。 图3 - 2超临界流体萃取设备原理示意图 1 : C O 2 钢瓶2 :C O 2 泵3 ,6 , 8 均为阀门 9 : 集流腔1 0 : 萃取单元1 1 : 萃取池 1 5 : 收集瓶1 6 : 排气阀 4 : 修饰剂容器 5 : 修饰剂泵 7 : 流体混合器 1 2 : 限流单元1 3 : 限流器1 4 : 收集单元 使用 S F X 2 2 0 型S F E 装置提取。在4 0 *C , 1 3 .8 MP a 对浆果红豆杉枝叶 进行超临界C 0 2 流体萃取， 每次样品 用量为3 g 。 修饰剂选自 水、乙 酸乙 酷、 醇类，或任一种醇与水的混合液，以甲醇为吸收液。分段收集，共收集4 h , 将收集液定容后检测其中的紫杉醇含量.萃取情况如表3 - 1 所示。 由表3 - 1 可以看出，加不同修饰剂对增加超临界C 0 2 流体对紫杉醇的溶 解能力的影响不同，其强弱顺序为: 水 乙醇 乙酸乙醋 甲醇 甲醇与水的混合溶液 超临界c a , 流体萃取法提取紫杉醇及其伴生 物的研究 复旦大学硕士学位论文 此外，实验表明修饰剂的加入量并非越多越好。极性修饰剂能增强对极 性物质的洗脱能力，但如果修饰剂加得过多，极性过强，也有可能使提取得 率降低。从表3 - 1 中可以看出，最佳的修饰比是2 0 %. 在相同 条 件下， 以 甲 醇 : 水 ( 8 0 : 2 0 ) 为 修 饰剂的 提取效 果最佳， 这与J i n 等3 4 1 的结论一致。 表3 - 1 不同修饰剂条件下t a x o l 的萃取率 刀 t- a l / %1 I 修饰比/ % 20一83 修饰剂名称 1 0 . 1 3 6 . 7 1 6 石 1 4 3 无水 乙醇 乙酸乙酉 旨 41 . 23 9 . 4 4 0 . 9 4 6 . 64 3 . 2 甲醇 甲醇: 水( 9 0 : 1 0 ) 甲 醇: 水( 5 0 : 5 0 ) 甲 醇:水( 8 0 :2 0 ) 乙醇:水( 8 0 :2 0 ) 4 1 . 2 71 . 8 5 3 . 5 8 1 . 5 4 7 . 9 7 6 . 4 6 3 . 46 9 . 9 6 7 . 2 8 3 . 6 5 9 2 8 3 . 9 6 5 . 7 ， ， 中J7 t. . . 1 表示将本实 验采用的 传统提取 法紫杉醇 得率3 .6 X 1 少看 作1 0 0 % 时， S F E 法 的萃取率。 3 . 2 . 2 . 2 萃取压力的影响 萃取压力是超临界流体萃取中最重要的参数之一。 使用S F X 2 2 0 型 S F E 装置提取。在4 0、不同压力条件下对浆果红豆 杉枝叶进行超临界 c 0 : 流体萃取， 每次样品 用量为 3 g 。 修饰剂为甲 醇: 水 ( 8 0 :2 0 ) ， 修饰比为2 0 ， 吸收液为甲 醇。 分段收集， 共收集4 h ， 将收集液 定容后检测其中的紫杉醇含量。萃取情况如表3 - 2 所示。 实验结果表明，温度一定时，萃取压力越高，流体的密度越大，对溶质 的溶解能力越强，萃取越完全。增大压力能增大超临界流体的密度，有利于 提高超临界流体的溶解能力，但过高的压力会使能耗增高，对设备的使用寿 命不利。而且S F X 2 2 0 型S F E 装置只有一级降压，在较高的压力条件下，极 易发生阻塞现象。一方面是因为降压时超临界 C 0 2 流体大量吸热，使修饰剂 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的研究 复旦大学 硕士学位论文 中的水结冰堵住限流管:另一方面是因为压力较高时，提取出大量悬浮状的 物质，也很容易堆积在限流管中。此外，压力过高还会使分辨率下降，分离 效果不好。因此，在3 4 . 5 MP a 时，4. . t 波动较大。 从表3 - 2 可以 看出: 在4 0 0C ， 修饰剂为甲 醇: 水( 8 0 : 2 0 ) 。 修饰比为2 0 时， 最佳萃取压力为2 7 . 6 M P a 表3 - 2 不同 萃取压力条件下的t a x o l 萃取率 刀 1-1 / %D 尸/ M P a 序号 2 0 . 7 2 7 . 6 3 4 . 5 9 9 . 8 1 0 2 . 7 8 9 . 8 1 0 2 31 1 0 . 5 3 平均值 6 2 . 7 5 8 . 3 1 0 4 . 9 1 0 2 . 3 1 1 6 2 1 0 0 . 1 1 3 0 . 6 n，-注卜 产1-，.人0 暇-扮勺6 1 0 9 . 8 1 0 6 . 8 n入-1，一尹幻门 八j-4676 刁r.一0声OC，0 ， 中n 1-表示 将本实 验采用的 传统 提取法紫杉醇得率3 .6 X 1 0 一 看作1 0 0 % 时。 S F E 法的 萃取率;尸表示萃取压力。 3 .2 .2 .3 萃取温度的 影响 萃取温度是超临界流体萃取的另一个十分重要的影响参数。 使用S F X 2 2 0 型S F E 装置提取。 在2 7 .6 M P a 、 不同温度条件下对浆果红 豆杉枝叶进行超临界C 0 2 流体萃取， 每次样品用量为3 g 。 修饰剂为甲 醇:水 ( 8 0 : 2 0 ) ， 修饰比 为2 0 ，吸收液为甲 醇。分段收集， 共收集4 h ， 将收集液 定容后检测其中的紫杉醇含量。萃取情况如表3 - 3 所示。 表3 - 3 不同萃取温度条件下的t a x o l 萃取率 刀 ta x o l / %U t / 序号 卜UQ声 ; ，卫且内 0六U .月且可胜人 4 0 1 0 2 . 7 1 1 0 . 51 0 4 . 31 2 6 . 5 平均值 1 1 6 . 2 1 0 9 . 8 1 0 8 . 9 1 0 5 . 4 1 0 5 石 1 0 3 . 5 1 3 5 2 1 2 6 名 ， 中n ,u o . 表示 将本实 验采用的 传统 提取法紫衫醇 得率3 .6 X I 丫看 作1 0 0 % 时， S F E 法 的萃取率; t 表示萃取温度。 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生 物的 研究复旦大学硕士学位论文 由表 3 - 3 可见， 在时， 紫杉醇的收率在开始时随萃取温度升高而降低， 在 6 0 C 最低，而后又达到 8 0 C 时的最大值。这是由于温度对萃取的影响比 较复杂，一般有两种趋势。一方面，流体密度随温度的升高而降低，从而使 流体的溶解能力降低;另一方面流体的粘度随着温度的升高而下降，传质加 快，有利于萃取。因此， 萃取温度对萃取效率的影响常常有一个最佳值。在 4 0 - 6 0 0C ， 流体密度温度的升高 而降 低起主导作用， 所以， 紫杉醇收率呈下降 趋势，在 6 0 - 8 0，流体粘度随温度的升高而下降起主导作用，所以紫杉醇 收率又呈上升趋势。在最佳萃取压力2 7 .6 MP a 时，8 0 的收率高于4 0 C, 但由于 8 0 时， 也和压力过高时一样， 提取出大量悬浮物， 容易造成限流管 的堵塞，因而使用S F X 2 2 0 型S F E 装置进行分析时，最佳萃取温度为4 0 。 而第四章提取较大量紫杉醇时， 由于设备有两级降压装置不存在堵塞的问 题， 为了提高收率，大量提取时的最佳温度定为8 0 C . 3 .2 . 2 . 4 C O : 流量的影响 c o z 流量对紫杉醇收率影响不太大。一般来说， 随着c o : 流量增大， 会 使萃取时间缩短，但c o z 的耗量也随之增加，与物料的接触时间减小，不利 于萃取能力的提高。对溶质溶解度较小或溶质从原料基体中扩散出来的速度 很慢的体系，采用过大的流量意义不大。因为在这种情况下，溶质的溶解平 衡还远没达到。但c o z 流量太低， 相同时间内收率也较低。要达到相同的萃 取效率， 必须延长时间， 这就使得设备利用率下降， 同时增加了 耗能。 所以， c o : 流量不宜太大或过低。 理论上， 流量增加， 超临界流体与溶质的接触面 积增大，增大了萃取的传质动力， 提高了萃取能力。但实际应用中，必须根 据萃取物料质量、 溶质在溶剂中的溶解度与相平衡程度决定超临界流体流量。 因为S F X 2 2 0 型 S F E装置所配备的限流管流量为2 m L l m i n ，故使用该 设 备 时 的C O z 流 量 为3 0 - 5 0 L h k g ” 原 料。 在 这 个 流 量 下， 紫 杉 醇 可 在4 h 内基本萃取完全，而且对紫杉醇的伴生物1 0 - D A B I I I 和t a x i n e B 的 提取和分 离效果也不错。 相关图谱请见本文3 . 2 .3 。 因而在超临界C O z 流体萃取较大量 紫 杉 醇 及 其 伴 生 物 的 研 究 中 ， 我 们 选 择C O z 流 量 为4 0 L h 1 k g 一 原 料， 也 得到了很好的提取分离效果。 3 . 2 .2 . 5 原料粒度的 影响 原料粒度的影响同样是比较重要的因素。 多数情况下， 对于植物药原料， 如果不对其进行破碎，则萃出物的产率极低。而当原料破碎至一定程度时， 产率会大大提高。 超临界c o l 流体萃取法提取紫杉醇及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 当原料中溶质组分含量较低或萃取过程的后期阶段， 溶质在固体颗粒中 的传质速率远低于溶质在超临界流体中的传质速率，为整个传质速率的控制 步骤，此时固体颗粒的大小直接影响萃取速率的快慢。粒度越小，传质面积 越大，传质路径越短，因此，传质阻力越小，传质越快，萃取效果越好。从 理论上讲，原料的粒度越小，萃取速度越快越完全。但粒度太小时，不仅易 于导致气路阻塞，甚至无法再进行萃取操作，而且还会造成原料结块，出现 沟流，沟流的出现，一方面使局部受热不均匀，另一方面在沟流处流体的线 速度大增，摩擦发热，严重时还会使某些生物活性成分遭受破坏。因此存在 最佳粒度范围。 本实验对粒径为0 . 1 8 - - 0 .2 5 m m, 0 .3 8 - 0 .8 3 m m以及2 - 8 m m的红豆杉枝 叶样品分别进行 了研究，发现三者的提取效率几乎没有差别。但是对粒径为 。 1 80 .2 5 m m , 0 . 3 8 - 0 . 8 3 m m的红豆杉枝叶 样的 萃取极易 造成限流管的 堵塞， 而且会形成沟流现象。 因而在后续的实验中， 我们都采用粒径为2 - 8 m m的红 豆杉枝叶样品。 3 .2 . 2 . 6 萃取时间的 影响 萃取时间也是超临界流体的一个影响因素。 求、澎粉夸 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 1 奉 取/ mi n .各时问段 t a x a l 2 0 0 2 2 0 2 4 0 目总t a x o l 萃取率革取率 图3 一 3 紫杉醇含量随萃取时间的变化关系 使用S F X 2 2 0 型S F E 装置提取。在4 0 、 2 7 . 6 MP a 条件下对浆果红豆 杉枝叶进行超临界C O Z 流体萃取， 样品用量为3 g 。 修饰剂为甲 醇: 水 ( 8 0 :2 0 ) , 修饰比为2 0 ，吸收液为甲 醇。每2 0 m i n 收集一次， 共收集4 h ，将收集液 定容后检测其中的 紫杉醇含量。 萃取情况如图3 - 3 所示。 由图 3 - 3可以看出，随着时间的增加，紫杉醇收率逐渐增高，最初产物 收率增加显著，之后增加缓慢直至萃取完全。时间再增加，萃取出的紫衫醉 也很少。为了提高效率、节省能源， 萃取时间以4 h 为宜。 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 3 . 2 .3 超临界C O : 流体萃取法提取少A紫衫醉及其伴生物的 研究 前面比较详细的研究了超临界C 0 2 流体萃取法提取紫杉醇的工艺条件， 本节将重点介绍在上述最佳条件下运用超临界C 0 2 流体萃取法对浆果红豆杉 枝叶中紫杉醇及其伴生物 1 0 - D A B I I I 和ta x i n e B进行提取分离的研究。 n哎三、侧 t I mi n 图3 - 4提取产物色谱图 a l 0 2 0 m i n 萃得物:6 0 - - 8 0 m i n 萃得物; a 3 1 2 0 -1 4 0 m i n 萃得物: a 4 1 8 0 - 2 0 0 m i n 萃得物: 紫杉醇; 紫杉碱B ; 1 0 一 去乙酞基巴卡亭m nl卉UOU幽UnU ao口00口 a，0万0， 32，自.1 ，阅日、长 2 0 4 0 60 t o 1 00 t 20 140 圈 t a x i n e B t / mi n .1 0 - DAB I I I I s口1 月 01 00 7 J 0 口 t a x 0 1 图3 - 5 三种提取产物随萃取时间的分布 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 使用S F X 2 2 0 型S F E 装置 提取。 在4 0、 2 7 .6 M P a 条件下对浆果红豆 杉枝叶进行超临界C 0 2 流体萃取， 样品用量为3 g 。 修饰剂为甲 醇:水( 8 0 : 2 0 ) . 修饰比为2 0 ，吸收液为甲醇。每2 0 m i n 收集一次，共收集4 h ，将收集液 定容后检测其中的紫杉醇及其伴生物1 0 - D A B I I I 和 t a x i n e B这三种主要产物 : 陈 罗、侧铃、 弓旧1 1 - z 1 6 3 , .0 乒嫉 -1 ,3009.10 t000 1700 a 072 0 ! 7 7 呜 2 飞 92 飞4 ，BOOZDDO m /Z(a) 罗/叨吟1 A 7 0 9 ， 2 34 .15 7 68 % 7 81 . 17 3723 4 4 珍 7。 1 田巧口加7 5 8助勤姻 AW BB 47519 m/ Z ( b ) 737.39758 i n .5 8 8 1 7 8 8 一r 哟 咖日 印9 0 7 5 r s o 5 as n 1 W i n s 6 N M n m m 1 0 7 3 17 5 3 A I 7 7 8 8 7 即囚7 0 3 7 印叨 严卜攫， 姗|快. 1 8 7 国 1 9 5 7 8习 哭刀 弋 3 7 7 1 n 禅朋 气387!17 r44 440n 14 4 9 8 17 44 6 8 田m的印如犯月旧。 岁、侧介1 ， 加刀 图3 - 6 ( a ) T a x o l 的E S I 正 离 子 全范围 扫描 质 谱: ( b ) ta x in e B 的A P C I 正 离 子 全范围扫描质谱: ( c ) 1 0 - D A B I I I 的A P C I 正离 子 全范围扫描质谱 的含量。 提取产物的色谱图如图3 - 4 所示， 为了便于观察， 此处只列出了0 超临界C O , 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的 研究 复旦大学硕士学位论文 2 0 , 6 0 8 0 m i n , 1 2 0 1 4 0 m in 和1 8 0 - - 2 0 0 m in 的提取物色谱图。三种产物 在不同时间的含量及分布如图3 - 5 所示。 由图3 - 5 可以看出三种主要提取物在 超临界流体萃取法的不同馏分中含量不同，相比传统提取法的单一馏分，超 临界流体萃取法可以实现对三者的粗分离。 3 .2 . 4 紫衫醉、紫衫碱B 和1 0 一 去乙 酸基巴 卡亭111的质谱分析 对图3 - 4 中的 号峰进行分析得到质谱图3 - 6 ( a ) 。 可以 看到在实验条件 下， 主 要 是m /Z = 8 7 6 .2 的 M + N a 离 子 和m / Z = 1 7 2 9 .2 的 2 M + N a 离 子， 其 他 强度较小的峰主要是紫杉醇解离后得到的碎片离子。因而可以证实，号峰 确实 是 紫 杉醇。 同 样 对 、 号 峰 进行 分 析， 得 质谱图3 - 6 ( b ) 和图3 - 6 ( c ) ， 证 实 、 号 峰 分 别 是1 0 - D A B I I I , ta x i n e B . 3 . 3 结果与讨论 本章比较详细的研究了超临界 C 0 2 流体萃取法提取紫杉醇的工艺条件 包括修饰剂、 萃取压力、 萃取温度、 C O z 流量、 原料粒度和萃取时间等因素， 和在上述最佳条件下运用超临界C 0 2 流体萃取法对浆果红豆杉枝叶中紫杉醇 及其伴生物1 0 - D A B II I 和t a x i n e B进行提取分离的研究。 实验表明，最佳的工艺条件是温度为4 0， 压力为2 7 . 6 MP a ，修饰剂 为甲 醇: 水( 8 0 :2 0 ) ，修饰比为2 0 ， 吸收液为甲 醇，收集时间为4 h e 在这种工艺条件下，紫杉醇及其伴生物1 0 - D A B I I I 和t a x i n e B 这三种主 要产物在萃取的不同馏分中含量不同，对它们进行后续分离比传统法的单一 组分更有优势。 超临界C O 流体萃取法提取紫杉醉及其伴生物的研究 复旦大学硕士学位论文 4 .2 实 验方法和步骤 4 .2 . 1 原料制备 将天然、 种植南方红豆杉枝叶晒干后粉碎至粒径2 - 8 m m， 得到红豆杉枝 叶样品。 4 . 2 .2 超临 界C 0 2 流体萃 取法提 取较大 量紫 衫醉的 工艺条 件的 选择 由于原料和设备的限制， 我们由 本文3 .2 .2 对超临界C 0 2 流体萃取紫杉醇 的工艺条件的研究选择超临界C 0 2 流体萃取较大量紫杉醇的工艺条件做了三 个对比实验，各条件如下: 表4 - 1三个对比 实验的萃取条件 样 口 口n 序 号* 刀 2 样 / k g 修饰剂修饰比 萃耳又 池第一分离器第二分离器 尸 / MP a T / C 尸 / MP a T/ 0C 尸 / MP a l T 1 1 2 3 5 5 5 甲醇: 水 ( 8 0 : 2 0 ) 甲醇: 水 ( 8 0 : 2 0 ) 甲醇: 水 ( 8 0 : 2 0 ) 1 : 1 0 0 卜1 0 0 1 : 2 0 2 8 2 8 2 8 8 0 8 0 8 0 8 8 8 4 5 4 5 4 5 5 5 5 3 0 3 0 3 0 幸 其中 I 为天然生长的南方红豆杉.2 . 3 为人工种植的南方红豆杉。 取 5 k g红豆杉枝叶样品 用修饰剂甲醇: 水( 8