（物理电子学专业论文）荧光光谱检测设计与研究.pdf

摘要 本论文以研究时间分辨荧光免疫分析( t r f i a ) 解离增强体系( d e l i f a ) 为基础，为 了克服液相t r f i a 体系的不足，依据稀土荧光标记物的基本参数( 荧光光谱、荧光寿 命、激发波长、发射波长) ，提高在荧光光谱检测实验中微弱信号的接收灵敏度、低噪 声放大与准确检测，涉及光电转换器件、信号积分和前置放大电路、光电二极管门触 发等方面细节，期望解决在信号接收处理过程的问题，如降低噪声的干扰、提高器件 接收灵敏度、设计比较理想的接收系统，完成荧光标记物发光监测系统的部分总体设 计。采用脉冲取样技术，同步触发、设定延迟、实现数据采集和显示输出，并进行了相 关的光谱和荧光寿命测量实验。 关键词：时问分辨荧光免疫分析发射光谱荧光寿命激光激发 a bs t r a c t t h et h e s i st a k et h es t u d i e so l lt h et i m er e s o l u t i o nf l u o r e s c e n c ei m m u n i t ya n a l y s i s ( t r f i a ) t od i s s o c i a t et h ee n h a n c e m e n ts y s t e mf d e l i f a ) a saf 0 岫d a t i o n ，i no r d e rt oo v e r c o m et h e s h o r t a g eo ft h el i q u i do h a t r 默s y s t e m , o nt h eb a s i so fm r ee a r t hf l u o r e s c e n c em a r k b a s i cp a r a m e t e r ( f l u o r e s c e n c e 印咖m ，f l u o r e s c e n tl i f e t i m e ，s t i m u l a t i o nw a v cl e n g t h , l a u n c hw a v el e n g t h ) ，e n h a n c e st h ed e t a i l so ft h ew e a ks i g n a lr e c e i v i n gs e n s i t i v i t y , t h el o w n o i s ee n l a r g e m e n ta n dt h ea c c u r a t ee x a m i n a t i o n , i n v o l v e st h ep h o t oe l e c t r i c i t y t r a n s f o r m a t i o nc o m p o n e n t , t h es i g n a li n t e g r a la n dt h ep r e - a m p l i f i c a t i o ne l e c t r i cc i r c u i t , t h e p h o t oe l e c t r i c i t yd i o d eg a t et r i g g e r sa n ds oo ni nt h ef l u o r e s e e n c es d e c t m me x a m i n a t i o n e x p e r i m e n t ，e x p e c t e st os o l u t et h ep r o b l e mi nt h es i g n a lr c c c i r et r e a t i n gp r o c e s s e s ，s u c ha s r e d u c t i n gt h en o i s ed i s t u r b a n c e ，e n h a n c i n gt h ec o m p o n e n tr e c e i v i n gs e n s i t i v i t y , d e s i g n i n ga q u i t ei d e a lr e c e i v i n gs y s t e m , 0 0 m p l e t i gt h ef l u o r e s c e n c em a r kt os h i n et h em o n i t o rs y s t e m p a r t i a ls y s t e md e s i g n u s e st h ep u l s es a m p l et e c h n o l o g y , s y n c h r o n i z a t i o nt r i g g e r s ，t h e h y p o t h e s i sr e t a r d s ，t h er e a l i z a t i o nd a t aa c q u i s i t i o na n dt h ed e m o n s t r a t i o no u t p u t ，a n dh a s e a r n e do u tt h ee x p e r i m e n t so fr e l a t e ds p e i y l u ma n dt h ef l u o r e s c e n tl i f e t i m es u r v e v i k e yw o r d s ：t i m e r e s o l v e d f l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y e m i s s i o ns p e c t r u mf l u o r e s c e n c ef i f e t i m el a s e r e x c i t e d 长春理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文荧光光谱检测设计与研究是本人 在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 作豁氢袭缈乒月羽 长春理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“长春理工大学硕士学位论文版权使用 规定”，同意长春理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件 和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权长春理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存和汇编学位论文。 作者签名：鬓乡函；寥拶；月么日 指导导师签名：辁窒匪坦3 磷年月笪日 第一章绪论 1 1 引言 由于稀土勘“离子具有荧光特性，在医学上可利用其标记蛋白质、酶、d n a 等。 通过光电手段可以检验分析标记的物质是否存在。妇“离子具有3 0 0 3 6 0 n m 的吸收光 谱，使用对应光源进行照射，可以使其受激辐射发出荧光。但是普通的稀土离子是不 会和蛋白质等有机化合物反应，需要一种可以连接两种物质的中介，我们选用的是螯 合剂，螯合剂一方面可以连接蛋白质，一方面又可以与稀土离子构成稳定的共价键。 实验是通过对反应后的样品进行分析检测，使勖“离子受激辐射，发出以6 1 2 n m 为主峰的荧光光谱，通过对该光谱有无及其强弱的对比，可以判定化合物反应前是否 含有特定物质，含有该种物质的多少。由于激发的荧光非常微弱，在检测的过程中需 要利用荧光微弱信号检测的办法，设计这个实验。 。 荧光微弱信号的检测设计主要涉及，光电转换，脉冲电信号的放大与收集，降低 信号噪声，比较信号强度与被测物质浓度的关系，通过对设备的选用，研究如何使用 光电倍增管( p m t ) ，b o x c a r 多点积分器。 1 2 课题研究的重要性及现实意义 微弱荧光信号的检测是继放射免疫分析“1 、酶联免疫分析和化学免疫分析之后，在 传统荧光免疫分析基础上，于上个世纪8 0 年代初问世的一种非放射性标记免疫分析技 术，最重要的特点是以稀土离子作为荧光探针，它量子产率高，s t o c k s 位移大，发射 峰窄，激发和发射波长理想，荧光寿命长( 1 0 1 0 0 0 us ) 。采用时间分辨技术，可消 除激发光源的光、电干扰及样品池和样品本身等发出的短寿命荧光( 1 l o n s ) ，极大 的提高了信噪比，成为最有发展前途的超微量分析技术讶。 1 3 微弱信号检测研究现状 对于弱光信号，由于电子技术的发展，一般均通过各种传感器傲非电量转换，使 检测对象变成电量，但是由于弱光本身的涨落、传感器本底与测量仪器噪声的影响， 表现的总效果是有用的电信号被噪声所淹没，使测量受到每一发展阶段的绝对限制， 这些噪声来源与两个方面，一是来自于测量系统的内部，诸如运动产生的自噪声、载 流子的复合与再生、电子倍增噪声、表面态引起闪烁噪声以及光的量子噪声等，二是 来源于系统的外部，例如市电干扰、温度涨落、机械震动、电磁感应与辐射以及宇宙 射线等天体噪声等，这些噪声都有一定的频率特性与量级，按传统概念，噪声就是测 量的极限。 自从1 9 2 8 年j o h n s o n 对热骚动电子运动产生的噪声进行研究以来，大量科学工作 者对信号检测做出了重要贡献，尤其是近三十年来，更取得了突飞猛进的进步，测量 的极限不断低于噪声的量级，1 9 6 2 年第一台锁相放大器问世，使检测信噪比提高到1 0 3 ， 1 9 6 8 年从大量二次电子中测得a u g e r 电子，到七十年代后期，检测信噪比提高到1 0 6 ， 即平均每4 5 年测量极限低于噪声限制近一个数量级，因此，过去视为不可测量的微 观现象或弱相互作用，现在已成为可能，这就大大地推动了物理学和其他科学的发展。 微弱信号检测的目的是利用电子学的信息论和物理学的方法，分析噪声产生的原 因和规律，研究被测信号的特点与相干性，检测背景噪声覆盖的弱信号，他的任务是 发展弱信号检测理论、探索新的方法、研制新的检测设备以及在各学科中的推广应用。 传统的频域抑制噪声的检铡方法是带通滤波。1 ，籍以滤除带通以外的噪声，但这有 很多的缺点，锁相放大是通过频谱的迁移，利用低通滤波消除噪声，达到较之带通滤 波更窄的带宽。一般来说，带通滤波的q 值为1 0 1 0 0 ，而锁相放大器的q 值可达到1 0 ， 噪声几乎抑制殆尽。 随着计算机的发展，有些原来需要硬件来完成的检测系统，可用软件来实现，因 此被噪声掩盖的弱信号，利用计算机进行曲线拟合、平滑、数字滤波、快速傅立叶变 换估计等方法处理，提高了信噪比。 1 4 研究的内容及创新点 本题目所建立的装置主要分为激发光源、光学系统、荧光信号检测系统。激发光 源采用氮分子激光器或者氙灯，通过透镜组使光汇聚到样品池，激发被测物质。以光 电倍增管和光电二极管作为接收与触发器件，采用脉冲取样和延时积分的方法进行荧 光信号检测。测量稀土离子及其螯合物的激发和发射光谱的特点，以及特定波长位置 的荧光寿命。 在这个实验中，通过对理论和实际的操作，使用不同方案组建系统，对比实验数 据，选择最好的检测方法，让整个系统更加完善。 2 第二章时间分辨荧光光谱技术 2 1e “离子螯合物的荧光特性 2 1 1 荧光的产生 在热平衡状态下，材料中的粒子遵循玻尔兹曼定律分布在不同的能级上。不同能 级上的粒子数满足如下关系式： 生e x “生当 ( 2 1 )o e x d l - l 厶lj 。1 一船。 k 为玻尔兹曼常数。在外界条件的激发下，粒子激发到较高的能级。当激发条件取消 后，被激发上去的粒子会很快以辐射或非辐射的方式释放出能量而返回到基态。根据 激发态的不同，发光一般可以被分为两大类：荧光和磷光。荧光就是当电子以同样的 自旋状态从高能的电子激发态返回到低能的电子态的过程中发射出来的光对于固态 或者存在于溶液中的有机物质，观测到的荧光通常是由第一激发态返回到基态的过程 中发出的。显然，荧光只是电子返回较低能级时的一条路径，电子也可以经由其它路 径返回，比如经过系问跨跃叫( i n t e r s y s t e mc r o s s i n g ) 而到达三线态，再经由三线态 返回基态，从而发出磷光。 图2 1 能级跃迁图 电子的激发和返回过程可以用能级跃迁图2 1 来描述。处于基态氐的电子吸收一 定的能量后被激发到高能级的激发态s 、是、，在极短的时间内( 小于1 0 4s ) ，激 发态上的电子可以通过内转换到达第一电子激发态的最低振动能级。由于荧光寿命一 。 般为1 0 8s 左右，因而内转换过程在荧光发射前就早己完成，所以荧光发射一般被认为 3 是从第一激发态的最低振动能级开始的。 s i 系间簿跃 jt t ir - 三 吸光丸 嗷舰 图2 2 系间跨跃 系间跨跃，指不同多重态间的无辐射跃迁，例如墨一互就是一种系间窜跃。通常， 发生系间窜跃对，电子由墨的较低振动能级转移至五的较高振动能级处。有时，通过 热激发，有可能发生正一墨，然后由墨发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 s i s ， t 磷光 图2 3 磷光发射 磷光发射，电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这是禁阻 跃迁。但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激 发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发 射磷光，这个跃迁过程( 互一墨) 也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为1 0 。- 1 0 s 。 因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。 根据材料的能级结构不同，主要有以下几种不同类型的荧光“o ： 共振荧光。发射的荧光频率与激发光频率相同。荧光检测时易受到激发光的干 扰，在高灵敏度的检测中一般不采用。非共振斯托克斯荧光。包括碰撞辅助非共振 4 斯托克斯荧光。发射的荧光波长都大于激发光的波长。因避开了激发光的干扰，所以 常用它来做高灵敏度的检测。非共振反斯托克斯荧光。反射的荧光波长短于激发光 的波长。适合作反斯托克斯荧光测量的粒子很少，所以应用也不广泛。 2 1 2 稀土离子荧光 在元素周期表中，从原子序数5 7 的锅( l a ) 到7 1 的镥( l u ) 1 5 个元素加上位于同一 i i i b 族的原子序数为2 l 的钪( s c ) 和原子序数为3 9 的钇( y ) ，共1 7 个元素称为稀土 元素。它们的许多特性与它们的电子构型密切相关，而发光性能与其关系更为密切。由 于镧至镥的1 5 个元素在化学性质、物理性质和地球化学性质上相似，人们将这1 5 个元 素又称为镧系元素卧o ”。 、 ， 镧系离子的电子排布为。1 ，l s 2 妇2 2 p 6 3 s 2 3 p 6 3 d ”4 s 2 4 矿4 d ”4 ，4 如2 5 p 6 ( n - o 1 4 ) ，其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态，其基组态是4 ，( n = o 1 4 ) ，下一个激发态是4 ，“5 d 。稀士元素的原子因4 ，电子受5 s 2 5 p 6 的屏蔽，它们的 能级受外界的影响较小，但由于自旋耦合常数较大，能引起j 能级分裂嘲一嘲：不同稀土 离子中4 ，4 电子的最低激发态能级和基态能级之间的能量差不同，致使它们在发光性 质上有一定的差别。稀土离子根据其发光性能可分为3 类：不能显示荧光的离子， 有s c “、】，“和幻“( 4 ，。) 、l “( 4 ，1 4 ) ，以及荧光极的离子，如g 留“( 4 ，7 ) 。不过 这些离子容易形成l 3 一l 发光的配合物。而且它们常常能导致s 加。、甑，、拍“、d ，“ 等配合物体系f 3 - - f 跃迁荧光强度大大增强，即发生所谓共发光效应 ( c o l u m i n e s c e n c e ) 在无机体系中上述离子一般用在发光材料的构成基质阳离子。 能发出强荧光的离子，有s m “( 4 f 5 ) 、“( 4 ，6 ) 、乃“( 4 ，8 ) 、d y “( 4 f 9 ) 等。 它们的最低激发态和基态间的f f 跃迁能量频率落在可见区，f f 电子跃迁能量 适中，比较容易找到适合的配体，使配体的三重态能级与它们的f f 电子跃迁能量匹 配。因此，一般可观察到较强的发光现象。尤其是助“和乃“，得到最广泛的研究w 。 由此可见，稀土离子的发光性能是稀土离子电子结构的内因所决定的。对于此类有强荧 光效应的稀土配合物，一方面可以直接利用它的荧光特性制成荧光、激光材料，又可以 用稀土离子作光谱探针，进行物质结构的研究。具有低荧光效率的离子，有p r “、 w “、h o “、e r “、t m “、y b “等。由此可见，把稀土离子引入聚合物基质会改善其 荧光跃迁，提高荧光强度。一方面可制得强荧光材料，另一方面也可开发弱荧光组稀土， 使我国丰富的稀土资源得到充分利用。 2 1 3e u “螯合物的光谱特性 稀土元素作为有机络合物的中心原子其配位数丰富多变，通过稀土离子与丰富多 变配位体的相互作用，又可以在很大程度上改变、修饰和增强其发光特性，产生了十 分丰富的吸收和荧光光谱信息。e “离子有在可见光区发光的通道，如果选择适当的 配体，形成络合物，而其中的配体可将某一定波长的入射光吸收、存储、转换并传递 给中心离子，使络合物发出荧光。这种稀土有机发光络合物发出的荧光兼有稀离 子发光强度高、光色纯正和有机发光络合物所需激发能量低、荧光效率高等优点。稀 土离子的发光性质在配体作用下得到了增强和修饰。 作为一个理想的发光体分子应具备下列条件：1 分子具有稳定的基态和激发态； 2 在适当的光谱区具有强的吸光能力；3 激发后的激发态不是发射态，而且发射态的 能量交换效率要高；4 发射态应具有适当的能量，且寿命要适中：5 在氧化还原过程 中，发射态作为反应物或产物，需具备适当的氧化还原特性。 竣长 图2 4e u 3 螯合物的吸收光谱 镧系发光络合物正具有上述特点，它在近紫外区和可见光区域显示强的吸收。最 低激发态布局完全，具有明显的氧化还原中心，发射态的寿命处在毫秒区，因此是理 想的发光体；同时通过选择合适的配位体还可以控制非辐射的衰减，增强光吸收的强 度，从而提高稀土络合物的发光效率。 能发出强荧光n “( 4 ，6 ) 螯合物的荧光发射光谱。其最高峰位于6 1 2n i i l 。 筏长- ) 图2 5e u “螯合物发射光谱 助“络合物荧光的能量跃迁过程，一般可分三步来说明咖： t 。需，竺 d ：磊寻蒂 ll l li illll 图2 6 能量跃迁图 先由配体吸收辐射能，从单重态的基态晶跃迁至激发态s ，其激发能可以辐射 方式回到基态瓯( 配体荧光) ，也可以非辐射方式传递给三重态的激发态互或乏；三 重态的激发能也可以辐射方式失去能量，回到基态( 磷光) ，或以非辐射方式将能量转 移给阳离子( 图中是稀土离子) ：处于激发态的阳离子( 稀土离子) 的能量跃迁也有两 种方式，以非辐射方式或辐射方式跃迁到较低能态，再至基态，或以辐射方式跃迁到 较低能态，此时就产生荧光。 e “荧光谱一般为5 d 。一7f ，( j = 1 ，2 ，3 ，5 ，6 ) ，的跃迁光谱，包括电荷转移跃 一赛耄一度 霎0_oo暑上 工xu_6o=l_专。上 6i()&o；零上i。6(善：n1上黼 f 迁光谱和共振能量转移光谱，电荷转移跃迁光谱是配体向稀土离子的电荷转移态( 4 f 壳 层内) 发生电荷转移而产生的，5 d 。一7 墨，7 e ，7 f 4 的荧光波长分别为5 9 0 5 9 6 姗， 6 1 0 6 2 0 n i l l ，6 8 7 7 0 3 n m 。而当用卢一二酮体作肋“配位体时，与电荷转移跃迁不同， 配位体的三重态与勋“的5 d ，态发生共振能量转移，而不是电子密度的重新分配嘲_ 卅。 b “依靠配位二酮体的能量转移，可以得到强烈的h 。的5 d 一7 e ( 6 1 0 6 2 0 n m ) 跃 迁荧光。这样激发波长取决于所用的配体，发射波长取决于荧光离子。 2 1 4 荧光量子产率和荧光寿命 ， 荧光量子产率和荧光寿命是荧光物种最重要的两个参数。其意义可以用简化后的 j a b l o n s k i 图来说明。 图2 7 简化j a b l o n s k i 图对荧光量子产率和荧光寿命的解释。 荧光量子产率是发射的光子在总共吸收的光子中所占的比例。实际上电子由第一 激发态回到基态可以有辐射和非辐射两种形式，其速率常数分别由r 和q ，表示，因 此量子产率也可以被理解为以辐射形式由激发态返回基态的电子数占总的被激发电子 的比例，量子产率可以被表示为： 毋；l( 2 2 ) r + e ， 假如辐射衰退所占的比例远大于非辐射衰退，荧光量子产率可以接近1 ，但是由于各种 能量的损失，荧光量子产率一般小于1 。 荧光寿命是受激分子在返回基态前在激发态停留的平均时间。因而荧光寿命可以表 衲： 扣志 3 ) 因为荧光发射是一个随机的过程，所以只有极少数荧光分子的寿命等于t ，对于单指 数的荧光衰减，有6 3 的荧光分子荧光寿命小于t 。对于给定的荧光物种，荧光量子 产率越大或荧光寿命越长，在同样条件下荧光强度越强。 8 2 1 5s t o k e s 位移 虽然吸收和发射反映的都是基态和第一激发态之间能量的变化，但是荧光发射光 谱一般会出现在吸收光谱的长波一端，在最大发射和最大吸收波长之间会存在一个差 值，这个差值是一个表示分子发光特性的物理常数，被称为s t o k e s 位移。它反映了分 子在回到基态以前，在激发态寿命期间能量的消耗，此位移常用下式表示，单位为锕- 1 11 s t o k e ss h i f t = 1 0 7 仁l 一二) ( 2 4 ) 九屯。 这里k 和a 。分别是校正后的最大激发波长和最大发射波长，单位为咖。 激发和发射间的能量损失非常普遍地存在于处于溶液中的荧光分子，并且这种能 量损失可以反映出溶液的某些性质。 2 1 4k a s h a 规则 荧光光谱的另外一个特点就是同一荧光物种的荧光光谱一般不依赖于它的激发波 长，这被称为k a s h a 规则。当分子被激发到高的电子振动能级时，通过内转换，过剩 的能量会被很快地散失，从而使分子回到第一激发态的最低振动能级。因为内转换的 时间远小于分子的荧光寿命，所以不管分子被激发到哪个能级，一般荧光总是从s 的 最低振动能级发出的。 2 2 激发光源的选择 2 2 1 激发光源 一般应用于荧光免疫分析的光源有激光器、高压氙灯和氙汞弧灯。 1 j 氮分子激光器：氮分子激光器具有波长短、脉宽窄、峰值功率高的特点，是目 前紫外波段较易得到较大功率的主要激光器之一。它被广泛地作为染料激光器泵浦源， 在激光医学( 理疗和激光针灸) 、种子处理、微量元素激光荧光分析、光化学反应、荧 光寿命研究等方面也具有重要的用途。主要应用其紫外波段和高峰值功率( 兆瓦级) 的 特性，其工作原理是通过横向激励腔内低气压氮气，而使其产生超辐射的紫外波长的 激光。 2 氙灯：氙灯是利用氙气放电发光的气体放电灯，高压氙灯是一种短弧气体放电灯， 外套为石英，内充氙气，室温时气压为0 5 m p a ，工作时气压为2 m p a ，在2 5 0 8 0 0 n m 波 长内光谱分布比较平滑。脉冲氙灯作为激发光源正在逐渐流行，脉冲氙灯能提供较大 相对发光强度的3 0 0 n m 以下波长的光束。球形超高压短弧氙灯是具有很高亮度的点光 源，是一种辐射紫外线和蓝绿色光的点光源。能辐射出从紫外到近红外的强烈连续光 谱的光，具有亮度高，发光体体积小，显色性好等优点，交、直流球形超高压汞灯适 用于荧光显微镜、光分析及光刻仪等光学仪器。管形长弧氤灯可作为码头、广场、体 9 育场的大面积照明光源，还可作为印刷照相制版，布匹颜色检验、塑料、橡胶、药物 的老化试验，人工气候室植物栽培，以及光化学反应的光源。 3 准分子激光器：准分子激光器采用由防卤索和紫外光侵蚀的铝合金制成的金属陶 瓷反向腔，和超快预电离技术将a r f 、x e c l 、x e f 等气体激发，产生激光。 4 氦锈激光器：h e c d 激光器波长输出为4 4 2 n m 或3 2 5 n m ，其产品广泛用于全息、快 速成型、荧光试验等应用中。主要特点：光束质量好、低噪音、长相干长度。是工业 以及科研应用的理想光源。 2 2 2 激光作为光谱源的优点 1 多种类型的激光器都能达到很高的光谱功率密度，它常比普通的非相干光源高 出许多个数量级，因此，容易解决一些当信号较弱时( 例如与探测器噪声或背景干扰 联系在一起时) 的强度问题，不仅如此，由于强度高，还能进行一系列涉及到多光子 过程或分子跃迁饱和实验。 2 激光发射具有良好的空间成束性，能较容易地减弱由壁或窗的散射光引起的不 期望有的背景。 3 脉冲或模耦合激光器能产生高功率的短脉冲激光，这种脉冲的持续时间很短， 达到飞秒量级，因而可以用它来研究很短的寿命和高速弛豫过程。 2 2 3 氮分子激光器原理 氮分子第二正带c 。一b 。能级振动态之间的激光跃迁。波长为3 3 7 1 n m 。带宽 约为0 1 n m 。 图2 8 氮分子能级图 氮分子是一种三能级系统的激光工作物质。它是通过电子直接碰撞激励的。当氮 分子从基态x 譬；激发至u 激光上能级c ，态后，在c k ，态和激光下能级b 3 _ 之间形成 粒子数反转当某些c 。态的氮分子自发辐射产生光子而跃迁到下能级时，这些光子 与受激态的氮分子碰撞，产生受激发射。但是只有沿通道方向辐射的激光，增益长度 才最大，最后沿通道就产生一个强的激光输出。 因为氮分子上能级c 。态的粒子的寿命只有4 0 n s ，因此必须在短于这一时间内才 能建立粒子数反转。现在大功率的氮分子激光器都是通过横向高压快速大电流放电来 实现的。又由于氮分子激光下能级b 3 石态的寿命很长，约为5 8ps ，大量的粒子在 这一能级聚集，所以不能连续的实现粒子数反转。通过气体流动，粒子与管壁的碰撞 等办法，或一定的弛豫时间使它回到基态之后，再实现另一次激励。因此氮分子在第 二正带间只能处于脉冲工作状态。 氮分子激光增益高，不需要谐振放大，因此不需要严格的谐振腔。通道未端仅是 一个镀膜高反镜，出射窗为一个对紫外吸收小的石英片。 2 3 时间分辨荧光检测分析方法的原理 2 3 1 荧光免疫分析各种方法 目前荧光免疫分析方法主要有：化学发光免疫分析、放射免疫分析、酶联免疫分 析、时间分辨荧光免疫分祈1 。 1 化学发光免疫分析：把化学发光物质与免疫学反应结合起来，用光反应表现被 测的免疫成分浓度，即把高灵敏的光反应与特异性的免疫学反应相结合的方法，称为 化学发光免疫分析技术( c h e m i l u m i n e s c e n ti m m u n o a s s a yc l i a ) 2 放射免疫分析( r a d i o i m m u n o a s s a y ) ：将放射性核素的标记物应用于实验分析的 免疫分析方法。它的主要特点是把放射性核素示踪技术的高灵敏性与免疫学的高物异 性相结合，对体液、细胞受体等超微量的生物活性物质进行有效的检测。 3 酶联免疫分析( e n z y m ei m m u n o a s s a y ) ”；酶是生物体产生具有促化作用的蛋白， 是生物催化剂，免疫酶是从六十年代发展起来的一项新技术。由于它比较灵敏，不需 要特殊设备，可以进行定性分析，故发展很快。免疫酶微量分析技术，是采用现代分 析仪器，对经免疫酶标记的待测样品中某种微量物质进行定量和定性的分析的检测技 术。在此基础上发展衍化的免疫酶示踪显微技术，是一种在组织上及细胞微观水平上 的酶标免疫化学技术，可采用电镜和光镜，对经免疫标记的细胞内外的靶分子物质进 行定性，定位的示踪观察。 4 时间分辨荧光技术：( t r f i a ) “”是以稀土离子( 镧系元素) 标记抗原抗体、 细胞、核酸探针的新技术。解离一增强体系主要通过铕、镝、钐、铽的时间分辨激光 激发荧光光谱分析”“”，应用于蛋白质定量分析：抗原抗体检测；如：乙型肝炎、 丙型肝炎的时间分辨荧光免疫分析；d n a 探针核酸杂交分析；药物和食品的检测等，另 外通过时间门技术可以大大提高检测的灵敏度”“。由于稀土离子自身荧光信号极微 弱，在免疫分析复合物中加入酸性介质后，使稀土离子在免疫复合物中解离出来。在 p h = 3 2 的解离增强溶液中与b 一萘甲酰三氟丙酮，( n t a ) 重新形成一种微胶囊螯合 物，这种螯合物会发出高强度的荧光( 比原来增强1 0 0 万倍) 。微囊在3 4 0 h m 被激发时， 可以产生长寿命的极强的荧光信号，约为原来荧光强度的1 0 0 万倍。较大s t o k e s 位移 ( 约2 7 0 r 皿) ，长寿命( 1 0 1 0 0 0 弘s ) 的荧光。采用时间分辨技术，使测量的样品池和样品 中蛋白质等发出短寿命荧光( 1 l o n s ) 完全衰减后再进行检测。 比较以上三个方法，时间分辨技术利用螯合剂，代替同位素、酶、一般荧光染料 和化学生物发光剂等，这些方法都会破坏蛋白质核酸、细胞等的活性物质。利用固相 时间分辨的方法可以保留原有细胞的生物特性。 2 3 2 荧光分析法建立基础 基态分子吸收光能受激后，处于s 。态的分子通过振动弛豫和内转换过程衰变到s 态的最低振动能级，若再伴随着光子的发射返回到的各个能级，即由s 返回到瓯的 跃迁过程则得到荧光。利用发射荧光强度与物质浓度之间的关系，建立了荧光分析法。 在一定的光源激发下，若保持激发波长不变，记录到的荧光强度对发射波长的关 系曲线，称为荧光发射光谱；反之若保持发射波长不变，记录到的荧光强度对激发波 长的关系曲线，称为荧光激发光谱。在一定激发波长和发射波长条件下测得的荧光强 度与发光物质的浓度成正比。 1 i - k q v l i o e c b ( 2 5 ) 式中，以为荧光量子产率；厶为激发光强度；b 为样品池厚度；为发光物质的 摩尔吸光系数；e 为发光物质的摩尔浓度i ，一k c 。 测量仪器确定以后，k 为常数。用一个适当强度的某一特定的光去激发具有一定荧 光效率的物质，采用光谱涉滤光技术和高灵敏度光电检测就可以定量地测量出被测物 质的含量。荧光强度与物质的浓度里线性关系，这正是荧光分析的定量基础。 荧光分析法主要有如下优点：n 玎 1 灵敏度高：荧光是从入射角的直角方向检测，即在黑暗背景下检测荧光的发射 强度；所以荧光分析法比通常的紫外和可见光分光光度法的灵敏度高2 3 个数量级， 检测限可达1 0 1 2 1 0 一g m l 。 2 选择性强：荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。在用荧光分析法鉴定物质时选 择性更强，因为分光光度法只能得到待测物质的特征吸收光谱，而荧光光谱法既能依 据特征发射又能利用激发光谱或依据特征吸收来鉴定物质。 3 取样容易，由于方法的灵敏度高，使试样的用量大大减少，特别是使用微量池 时，仅需几微升的样品。此外，荧光分析法还可用于对气体、固体和浑浊试样的分析。 4 能提供较多的物理参数：荧光分析法能提供包括激发光谱、发射光谱、荧光强 度、总荧光量、量子产率、荧光寿命、荧光偏振、谱带宽度和斯托克斯位移许多物理 参数。这些参数反映了被研究物质分子的各种特征，并且通过它们可以得到分子的更 多的信息，这是分光光度法不可比拟的。， 2 3 3 荧光免疫分析“” 1 将待测血样加入到抗体固相表面上，形成抗原抗体复合物，进行洗涤，除去未 反应的待测抗原。 2 加入稀士离子螯合抗体，经过温育后，形成抗原一抗体一稀士离子螯合物抗体 复合物。 3 加入酸性增强液，使稀士离子解离出来，形成新的免疫复合物，用光电检测的 手段，得到待测抗原的浓度。 图2 9 免疫分析图 利用有增强荧光作用的分子结构如( b c p d a 分子) 和生物扩增技术( p c r ) “”，则 无须加增强液，可直接检测稀土标记免疫复合物的荧光。这样我们的实验从液相转变 为固相，不需要加入酸性增强液，不破坏抗原抗体的细胞结构，可保存完好的生物信 息。 o 籼 h乙謇睦佟增 专 专m 釉m o n 亘u p 隅 2 3 4 时间分辨技术原理 图2 1 0 时间分辨技术的原理图 时间分辨荧光分析技术是用稀土离子络合物作为示踪物，代替同位素j 酶、一般 荧光染料和化学或生物发光剂等，标记蛋白质、核酸或细胞等生物活性物质。当反应 发生后，如抗原抗体反应、生物素亲合素亲合反应、核酸杂交反应等，由于稀土离子 络合物的荧光寿命比其它荧光物质的荧光寿命要长得多，所以通过设定一定的延迟时 间，待其它信号消失之后，在某一选定的时间内测量荧光信号，大大提高信噪比。通 过测定荧光强度就可以分析待测物的浓度。 一 基于这种螯合物的特点，采用紫外光激发，确定适当的初始延迟及取样门宽，以消 除样品本身短寿命的蛋白质的荧光、瑞利散射和拉曼散射，从时间、空间域上提取信号， 极大地增强了分析灵敏度。 一 2 4 光电转换测量系统 2 4 1 光电倍增管 当一个光子入射到光阴极k 上，可能使光 阴极上以几率叩逸出电子称为量子效率。这个 光电子继续被更高的电压加速而飞向第二倍增 极。若每一前级光电子打出酽个次级电子，如 此下去，到达阳极时总电子数可倍增管的效益。 应当指出，只有在入射光很弱，入射的光 子流是一个一个离散地入射到光阴极上时，才 能在阳极回路中得到一系列分立的脉冲信号。 1 4 。- r 旷_ 唧 如 b i 愀、0 聃一r 竹 i e 罐 图2 i i不同光强f 光电倍增管输出 图2 1 1 是用示波器观察到的光电倍增管弱光输出信号经放大器放大后的波形。 当p 一1 0 “w 时，光电子信号是一叠加有闪烁噪声的直流电平，如图( a ) ；当 p 一1 0 “w 时，直流电平减小，脉冲重叠减少，但仍在基线上起伏，如图( b ) ；光流继 续下降达p 一1 0 出时，基线形如稳定，重叠脉冲极少，如图( c ) ；当p 1 0 “时，脉 冲无重叠，直流电平趋于零。如图( d ) 。图2 1 1 可知，当光流量降至p 一1 0 出时，虽 然光信号是持续照射的，但光电倍增管输出的光电信号却是分立的尖脉冲。这些脉冲 的平均计数率与光子的流量成正比。可见光子计数器在探测弱光时发挥其优越性。 2 4 2 光子技术 单光子计数法利用在弱光下光电倍增管输出信号自然离散化的特点，采用精密的 脉冲幅度甄别技术和数字计数技术，可把淹没在背景噪声中的弱光信号提取出来。当 弱光照射到光电子阴极时，每个入射光子以一定的概率( 即量子效率) 使光阴极发射 一个电子。这个光电子经倍增系统的倍增最后在阳极回路中形成一个电流脉冲，通过 负载电阻形成。个电压脉冲，这个脉冲称为单光子脉冲。横坐标表示p 婀输出的噪声 与单光子的幅度电平( 能量) ，纵坐标表示其幅度电平的分布概律。可见，光电子脉冲 与噪声分布位置不同。由于信号脉冲增益相近，其幅度相当好的集中在一个特定的范 围内，光阴极反射的电子形成的脉冲幅度较大，而噪声脉冲则比较分散，它在阳极上 形成的脉冲幅度较低，因而出现了”单光电子峰。用脉冲幅度鉴别器把低于幅度的脉 冲抑制掉，只让高于幅度的脉冲通过就实现了单光子计数。 放大器的功能是把光电子脉冲和噪声脉冲线性放大，应有一定的增益，上升时间 5 0 m w 。氙灯具有2 5 0 8 0 0 n m 的带宽，如果选择紫外波段，就需要一套滤光片，这样在紫外3 0 0 3 6 0 n m 的波段内平 均功率必然会降低很多，而且氙灯光源工作期间产生大量热量，工作时间在3 0 0 0 小时 左右，这完全影响到灯的使用效率。比较两者，氮分子激光器具有更好利用率。 对微弱荧光信号的检测：利用光电倍增管对弱荧光信号进行光电转换，现在光 电倍增管的种类很多，有很多多碱阴极材料吸收紫外波段，光电倍增管具有九个以上 的打拿级，能对电子信号进行放大。光子计数器，其前端也是利用光电倍增管进行 光电转换以及放大，只是在其后部加入甄别器，给一个连续可调的电压进行调节输出。 这样的工作完全不用买一套完整的单光子计数器，我们可以通过电脑采集卡完成甄别 的工作，而且通过软件可以直接提取数据，形成立体三维图样，更直观的反应光谱和 荧光寿命的信息。 在比较了光源和信号放大系统的各种因素，和利用手头现有设备，我们决定利用 氮分子激光器作为光源，通过光栅单色仪和光电倍增管作为信号放大设备，通过b o x c a r 积分器，对信号进行采集整理，设置延时、采样门宽、积分时间和积分常数，可以从 打印机上获得时间分辨荧光光谱图。对于计算荧光的寿命，可以采取直接读取，对放 大后的信号，利用数字示波器，存储信号，通过示波器上的电压和周期，计算荧光的 寿命。还可以通过r c 电路拟合的方法计算荧光寿命。对于用数字采集卡代替积分器， 我们打算在这个方案可行性通过后立即展开，由于还需要编程人员的介入，可能还需 要一段时间。 3 2 荧光检测分析设备 时间分辨荧光免疫分析必须具有以下功能：样品的放置、稀土离子螯合物荧光激 发、高灵敏度长寿命荧光信号的接收。 主要的实验设备包括： 激发光源：调制氮分子激光器 光路；透镜组，滤光片镀膜 样品池：样品室大小设计光的吸收散射 信号检测器：光电倍增管、b o x c a r 取样积分器、存储式示波器。 时间门控制：光电二极管 3 3 光学系统选择 3 3 14 5 反射式光学系统 图3 14 5 。反射式光学系统 利用会聚透镜将激光照射到荧光样品上，在样品前放置一双色镜，该双色镜可以 将激光透过，且使荧光信号反射，达到同时激发与反射接收目的。由于还有一部分激 光一起与荧光信号进入光电倍增管，所以在进入接收器之前，仍放一窄波段的滤波片， 以提高信噪比，但是荧光信号会因经过双色镜而损失。 3 3 2 9 0 。反射式光学系统 这个光学系统主要特点是通过小孔汇聚激光，通过样品池的黑盒内的反射镜反射 荧光和激发光，激光和磷光可以通过门延时过滤掉，缺点就是杂光多，出射光量少。 图3 29 0 。反射式光学系统 3 3 3 凹透镜聚焦系统 利用凹面镜的焦距正好落在滤光片上，利用滤光片背面只反射6 1 2 _ - - - k 5 n m 的荧光， 可以很好的滤掉同步脉冲的激光。并且这个光学系统可以使激发的荧光更多的进入到 光电倍增管中。 3 3 4 光学系统的设计 图3 3 凹透镜聚焦系统 图3 4 整个光路的设计如图 3 3 5 激发光路的设计 为了使光能均匀地照射到样品上，达到好的荧光稳定性，因此本实验拟将激光光 束压缩后，平行地照射到样品上。采用共焦系统，由几何关系，激光光斑的最大的边 长为2 4 r a m ，结合该实验的目的是要激发样品，主要考虑能量的问题，故影响该系统的 主要因素为球差。将激发光路设计为如下形式： 图3 5 激发光路 此光路的入射孔径为2 5 m , 输出孔径为8 m 札将波长设定为3 3 7 n m ，在光源上取样， 得到如下输出光斑图，可以看出光源上各点可以均匀地照射到样品上，达到了均匀激 发的目的。 3 3 6 收集光路的设计 收集光路，即从荧光产生处到单色仪入口，使入射光很好地会聚于单色仪入口狭缝， 即在保证入射光柱质量不变的条件下，充分利用光能，以保证获得足够的信号强度。 为了保证系统评价的准确性，在光源和光瞳上取样作为实际光线追迹，以产生一系 列点阵图作为评价依据，此工作由光学系统设计软件自动完成。在光瞳上取样由光学 系统设计软件自动完成，对光源样即对视场取样，用z e m a x 可以对1 2 个视场取样“”。 由于物镜的数值孔径越大，集光能力就越强，观察荧光的效果就越好，因此系统的 数值孔径不能取太小州。本实验所设计的收集光路：s i nu = o 1 5 ，f = 1 6 5 i l l 图3 7 收集光路图 图3 8 收集光路输出光斑匡 3 3 7 双色镜镀膜 榉躺泡g 毁f h 鲍凌 兜：爱求 反射纠镀 l 笈嚣l 鬣兮f 鼹 巍器：嚣 求透射绷 榉晶池上 援投嚣 国3 9 双色镜镀膜 该双色镜要求实现的功能：氮分子激光发射出的3 3 7 1 n m 的激光以高的透射率照 射到样品上去，而由激光引发的样品的荧光( 6 1 2 5 n m ) 以较高的反射率反射到接收 器。 ， 主要要求： 以紫外熔融石英玻璃为基底，镀z ，d 2 尉d 2 多层介质膜。 3 3 7 i n m 激光透射率t 9 5 6 1 2 5 n m 宽带反射率r 9 6 4 5 。入射( 包括透射光与反射光) 半径3 c m 畔 ，、，、 、t 7 图3 1 0 膜片的性能测试 3 3 8 样品池 如图3 1 1 ，样品池的大小为2 2 x 4 c m 开口朝上，材质为二氧化硅，内表面生长 固相抗体，可直接与血液进行抗原抗体反应。 s i 0 2 2 c m 图3 1 1 样品池 3 4 信号放大及触发设备 3 4 1 光电倍增管 、 光电倍增管用于检测荧光强度及光谱特性，定性或定时地分析样品中的成份。适 用的管型有：r 9 2 8 、r 1 5 2 7 、r 3 7 8 8 、r 6 3 5 3 、r 6 3 5 8 、c r l 3 1 比较这些光电倍增管的 特性，选择合适的进行实验。 光谱响应经常以不同波长下的辐射灵敏度和量子效率来表示。辐射灵敏度( s ) 即 为某一波长下的光电倍增管阴极发射出的光电子电流与该波长的入射光能量的比值， 单位为a w ( 安培瓦) 。量子效率( q e ) 为光阴极发射出来的光电子数量与入射光光子 的数量之比。一般用百分比来表示量子效率。 表3 - 1 六种光电倍增管参数对比 通过比较，在波长6 1 2 n m 附近阴极辐射灵敏度及量子效率相对较高的是r 9 2 8 和 r 6 3 5 8 表3 2r 9 2 8 与r 6 3 5 8 详细对比 光