（食品科学专业论文）转谷氨酰胺酶在乳蛋白间的交联机理及应用研究.pdf

摘要 首先，利用s d s - p a g e 电泳结合凝胶成像分析技术，比较了在非变性、加入 还原剂( 2 0 m m o l l d t t ) 变性和在8 0 预热1 5 r a i n 后并再加入一定量还原剂 ( 2 0 m m o l l d t t ) 变性三种条件下转谷氨酰胺酶对2 矧酪蛋白和乳清蛋白之间的交 联情况。通过对各组分蛋白相对光密度值的变化分析可知：在本实验所选条件下， 在8 0 。c 预热1 5 m i n 后并再加入一定量还原剂( 2 0 m o l l d t t ) 变性条件下，酪蛋白 和乳清蛋白之间可以交联；为进一步验证卜述结论，通过中红外光谱仪和电子显 微镜进一步分析交联前后蛋白质的二级结构的变化和交联前后蛋白质空间结构 上的差异，结果分析均与上述结论相吻合。 在转谷氨酰胺酶的作用下，蛋白之间的交联会引起功能特性发生改变，因此，在 单因素实验基础上，采用四因素( p h 、催化温度、催化时间、酶蛋白比例) 五 水平正交旋转回归设计研究经转谷氨酰胺酶处理后，获得酪蛋白和乳清蛋白交联 物良好凝胶强度和黏度的最佳工艺条件，结果表明：在本实验所选择的水平范围 内，获得最好凝胶强度的因素最佳组合为：获得最好凝胶强度的因素最佳组合为： x ，( 。) x 2 ( - 1 ) 墨( 1 ) 墨( 1 ) ，即p h ：7 ；温度：3 5 。c j 催化时间：1 2 h ；酶蛋白：1 5 u g ； y ，= 5 2 1 4 6 8 9 ：获得最好黏度的冈素最佳组合为： x 。，墨。_ ”x 。：，。：，即p h ： 9 ；温度：3 5 ；催化时间：2 4 h ；酶蛋白：2 0 u g ；y 2 = 3 3 9 8 c p 。 在上述理论实验研究的基础上，将转谷氨酰胺酶应用在酸奶加工实践中，首 先将加酶组酸奶和非酶组酸奶进行对比，结果表明：在酸奶中添加转谷氨酰胺酶。 可明显提高凝固型酸奶的凝胶强度，降低其乳清析出率，也可明显提高搅拌型酸 奶的黏度和贮存黏度，同时提高其持水性。另外，在酶的工艺条件优化研究中， 将酶的处理方式( 反应后灭酶和不灭酶) 和添加量( 0 t 5 l o o o ( g m l ) 、 0 2 5 i 0 0 0 ( g m e ) 、0 3 5 t o o o ( g m l ) 作为因素水平进行交叉设计，通过反应后 酸奶的凝胶强度、黏度和贮存黏度、乳清析出率和持水性等指标的变化和综合感 官评定，确定了酶的处理方式为反应后不灭酶，酶的适合添加量为 0 1 5 1 0 0 0 ( g m e 牛奶) 关键词：转谷氨酰胺酶；乳蛋白；交联；功能特性；应用 t h es t u d yo nc r o s s l i n k i n gm e c h a n i s mo fm i l kp r o t e i na n d a p p l i c a t i o nb yt r a n s g l u t a m i n a s e a b s t r a c t t h ep o s s i b i l i t yo fc r o s s l i n kb e t w e e ns o d i u mc a s e i n a t ea n dw h e yi s o l a t e ( w p i ) a n d t h ei m p a c t so nf u n c t i o n a l i t ya f t e rc r o s s l i n k i n gb yt r a n s g l u t a m i n a s ea n dt h ea p p l i c a t i o n o f t r a n s g l u t a m i n a s eo ny o g h u r tw e r es t u d i e d ， f i r s t l y , t h ec r o s s l i n ko fs o d i u mc a s e i n a t ea n dw h e yp r o t e i ni s o l a t e ( w p l ) a tt h r e e d i 目f e r e n tc o n d i t i o n su s i n gt r a n s g l u t a m i n a s e ( t g a s e ) w a ss t u d i e d t h ee x t e n to f p o l y m e r i z a t i o nw a sd e t e m i n e db ys d s p a g e 、e l e c t r o nm i c r o s c o p ea n di n f r a r e d s p e c t r o m e t e ra s s o c i a t e dw i t hg e li m a g ea n a l y s i s i ts h o w e d ：( a ) i ti si m p o s s i b l ef o r t h e c r o s s l i n kb e t w e e ns o d i u mc a s e i n a t ea n dw h e yp r o t e i ni s o l a t ea tt h en a t i v ec o n d i t i o nb y t g a s eb e c a u s eo fd i f f e r e n ts p a r i a ls t r u c t u r e s a n dt h ea d d i t i o no fd t ta n dp r e h e a t i n g f a c i l i t a t e dt h ec r o s s l i n kb e t w e e nc a s e i n a t ea n dw h e yp r o t e i ni s o l a t e ，f o rw ef o u n dt h a t 2 4 hl a t e r6 0 w p ia n d7 4 c nw e r er e d u c e ds i m u l t a n e o u s l yw i t ha d d i t i o no f 2 0 m m o l ，ld t ta f t e rp r e h e a t e d b a s e do nt h er e s u l tm e n t i o n e da b o v ea n dm o n o f a c t o r se x p e r i m e n t s ，t h eb e s tc r a f t c o n d i t i o n so ff o u rf a c a t o r si n c l u d i n gt e m p e r a t u r e 、t i m e 、p ha n dt r a n s g l u t a m i n a s e d e n s i t yo ng e ls t r e n g t ha n dv i s c o s i t yo fm i l kp r o t e i nb yt r a n s g l u t a m i n a s ew a sf o u n d u s i n gp e r p e n d i c u l a rc i r c u i t a t i o nr e g r e s s i o nd e s i g n i ts h o w s ：t h eb e s tc o m b i n a t i o no f f o u rf a c t o r so nv i s c o s i t yi sp h 9 ：3 5 ；2 4 h ；2 0 u g ；y 2 = 3 39 8 c p ；a n dt l l o s eo ng e l s t r e n g h t hi sp h 7 ；3 5 ；1 2 h ；1 5 u 倌；y l = 5 2 1 46 8 9 、v h e nt h et r a n s g l u t a m i n a s ew a sa p p l i e di ny o g h u r t t w om e a n so fp o u ra n dt h r e e l ( i n do f q u a t a t i t y w e r ec h o o s e i tc o n s i s t so f 0 1 5 1 0 0 0 、02 5 1 0 0 0 、o 3 5 1 0 0 0 ( g m l m i l k ) a n dd e g r o ya n dn o n d e s t r o yt r a n s g l u t a m i n a s ea r e rr e a c t i o n t h eb e s tr e s u l td e p e n d so n t h ec h a n g eo fg e ls t r e n g t h , v i s c o s i t y , v i s c o s i t yi ns t o r a g e ，w h e ys e p a r a t i o nr a t i oa n d l i q u i d - b i n d i n gp o w e r t ts h o w s ：t h eb e s tw a yo ft r a n s g l u t a m i n a s ei sn o n d e s t o r ya n d 0 15 “1 0 0 0 m lm i l k k e yw o r d s ：t r a n s g l u t a m i n a s e ；m i l k p r o t e i n ；c r o s s - l i n k i n g ；f u n c t i o n a l i t y ；a p p l i c a t i o n d ir e t t e db y ：p r o f f a n gg u i s h e n g ( p h d ) p r o f l v j i a p i n g ( p h d ) a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：l i ux i i 1 w e i ( m a s t e r o f e n g i n e e r i n g ) f l o o ds c i e n c ea n d e n g i n e e r i n g ，i n n e r m o n g o l i a a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y ，h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a 插图清单 图1 非变性条件下t g 催化酪蛋白和乳清蛋白聚合的s d s p a g e 1 4 图2 非变性条件下t g 催化酪蛋白和乳清蛋白聚合程度动力学变化1 5 图3 加入还原剂条件下t g 催化酪蛋白和乳清蛋白聚合的s d s p a g e 1 6 图4 还原剂变性条件下t g 催化酪蛋白和乳清蛋白聚合程度的动力学变化1 7 图5 预热并加入还原剂条件下t g 催化酪蛋白和乳清蛋白聚合的s d s - p a g e 1 8 图6 预热并加入还原剂条件下t g 催化酪蛋白和乳清蛋白聚合程度的动力学变化1 9 图7 三种条件下聚合物、酪蛋白和乳清蛋白相对光密度趋势变化比较2 1 图8 酪蛋白和乳清蛋白经t g a s e 催化不同时间后的红外光谱图( 酰胺i 峰) 2 2 图9 酰胺i 峰变化趋势2 2 图1 0 四中条件下酪蛋白和乳清蛋白混合液的空间结构变化2 3 图1 1 四因素对交联物凝胶强度影响的响应面分析2 7 图1 2 四因素对交联物黏度影响的响应面分析2 9 图1 3 酸奶加酶后和对照样品的凝胶强度比较3 1 图1 4 酸奶加酶后和对照样品的乳清析出率比较3 2 图1 5 酸奶加酶后和对照样品的持水力比较3 3 图1 6 酸奶加酶后和对照样品的表观黏度比较3 4 图1 7 酸奶加酶后和对照样品的贮存黏度比较3 5 图1 87 组实验样品的凝胶强度比较3 6 图1 97 组实验样品的乳清析出率比3 8 图2 07 组实验样品的持水力比较3 9 图2 17 组实验样品的表观黏度比较4 1 图2 27 组实验样品的贮存黏度比较 4 2 l 夏 & 龟 曩 良 l & 吼 n 工 2 a 钆 殳 包 l & o ； 叽 l l 1 l 1 1 l l 1 1 1 1 2 2 2 附表清单 1 表1 响应面分析的因素和水平l l 2 表2 酸奶感官评定表1 3 3 表3 实验方案1 4 4 表4 响应面分析设计及结果2 5 5 表5 凝胶强度方差分析表2 6 6 表6 黏度方差分析表2 6 7 表7 经转谷氨酰胺酶处理后酸奶与对照样品的感官评定比较表3 5 8 表87 组样品第1 天和第1 5 天持水力比较3 9 9 表97 组样品第1 天、第4 天和第1 5 天黏度比较4 3 1 0 表1 07 组样品的感官评定表4 4 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 转谷氨酰胺酶( t g ) 概述 t g 这一词最早是由w a e l s c h 及其合作者在1 9 5 9 年提出的，w a e l s c h 等用它来描 述豚鼠肝及别的组织中需c a 2 + 激活的一种转氨基作用，它是一种催化酰基转移反应的 酶，能在蛋白质分子间或分子内生成e 一( r - 谷氨酰) 赖氨酸共价键，使蛋白质分子 量变大，形成强有力凝胶，从而改善各种蛋白制品的弹性、粘和性、保水性等品质。 同时由于赖氨酸的引入使蛋白质的营养价值得到了提高n 1 。微生物转谷氨酰胺酶( m t g ) 是从微生物中提取的转谷氨酰胺酶( t r a n s g l u t a m i n a s e ，t g a s e 简称t g ，全称为蛋白 质一谷氨酰胺r 一谷氨酰胺转移酶) ，它的作用机理和t g 完全一致，只是性质稍有优势。 只所以有m t g 之称主要是由于其来源的不同。 多年以来，人们都是从动物组织中提取转谷氨酰胺酶，由于来源稀少，分离提纯 工艺也很复杂，因此使得该酶的价格十分昂贵。直到1 9 8 9 年，才有了利用微生物发 酵法生产转谷氨酰胺酶的报道。1 9 8 9 年a n d o 和m o t o k i 等人报道了利用链轮丝菌 ( s t r e p t o v e r t i c i l i u ms p p ) 发酵生产m t g 以及酶的分离提纯方法他1 。1 9 8 3 年m o t o k i 等 人报道了茂原链轮丝菌、灰肉链轮丝菌以及肉桂链轮丝菌等也能产生t g a s e h 引，1 9 9 2 年a n d o 发现链霉菌属中的其他一些菌株也能产生此酶，并对发酵过程进行了优化， 使得该酶的产量有了大幅度的提高，从而为食品工业利用此酶创造了条件。本论文研 究所用转谷氨酰胺酶是从微生物中提取的。 1 1 1 微生物转谷氨酰胺酶的理化及酶学特性 m t g 是一种分子量为4 0 k u 左右的胞外酶，球状构形，单聚链，由3 3 1 个氨基酸组 成，活性中心有一个游离的c y s 残基，有亲水性，活性不依赖于c d “劓。最适p h 值为 6 8 ，在p h 值8 1 0 的范围内也有活性，最适温度为3 7 - - - 5 0 ，在5 0 。c 作用几小时 仍能完全保持活力，但加热到7 0 。c 时几分钟酶的活性便完全丧失，在i o 。c 时甚至0 以下也有一定的活性幅。大多数金属离子对该酶的活性无影响或影响不大，但z n 2 + 对m t g 都有很强的抑制作用，可能因为z n 2 + 对c y s 残基有束缚作用，而c y s 残基则是 m t g 活性中心的重要组成部分佑。该酶活性易受p c m b 、n - 乙基一顺丁烯二酰亚胺的抑 制，而e d t a 可消除其活性n 。当然，不同菌种来源的m t g 在酶学特性上会有所不同， 这将有待于今后更深一步的实验分析比较。 1 1 2 转谷氨酰胺酶的作用机理 转谷氨酰胺酶是一种能催化酰基转移反应的转移酶，t g 利用肽链上的谷氨酰胺残 基的r 一甲酰胺基为乙酰基受体，受体可以是蛋白质上的或游离氨基酸上的胺基、伯胺 基、水，它催化的反应如下： 2 转谷氨酰胺酶在乳蛋白间的交联机理及应用研究 a g l n c o _ n h 2 + r n h 2 一- - - g l u - c o n h r + n h 3 b g l n c o n h 2 + n h 2 一l y s 七l u - c o - n h l y s + n h a c g l n c o n h 2 + h o h 一一g l u c o o h + n i - h 如果酰基受体为伯胺基，它可催化在蛋白质及肽键中谷氨酰胺残基的r 一羧酰胺基 和伯胺之间的酰胺基转移反应，如上式a ；该反应可将一些限制性氨基酸引入蛋白质 以提高其营养价值。 如酰基受体为多肽链中l y s 残基的一e 氨基时，蛋白质在分子内或分子间形成e ( r - g l u t a n y l ) l y s 共价键，如上式b ；从而改变事物的质地和结构，改善蛋白质的溶解 性、起泡性、乳化性、流变性等许多性质。 如水为氨基受体时，谷氨酰胺残基脱去氨基，如上式c ；该反应可用于改变蛋白质 的等电点及溶解度。 1 1 3 微生物转谷氨酰胺酶的优势特点 与动物来源的转谷氨酰胺酶相比，微生物来源的转谷氨酰胺酶有着以下优势： ( 1 ) 不依赖钙离子； ( 2 ) 对热、p h 值的稳定性都明显优于动物来源的( m t g 的的适合温度范围为4 - 6 5 ，t g 的适合温度范围为3 7 5 0 ；m t g 的p h 值稳定范围为6 8 ，t g 的p h 值稳定 范围为6 一- 7 5 ) ； ( 3 ) 更有利于保存，经离心和过滤后的发酵液滤液在- 2 0 c 下可保存几个月，而酶 活仅损失1 0 ，经过纯化的酶则更加稳定。 正因为i v l t g 具有以上优势使得m t g 成为最有希望工业化生产的转谷氨酰胺酶，特 别是应用在食品行业中，由于食品中的蛋白质如酪蛋白、大豆蛋白、肌蛋白等对c a 2 + 都很敏感，在c a 2 + 存在下易沉淀，对酶的反应性降低，而t g a s e 对c a + 不依赖这一特 性使其应用起来更加方便。h n d o 报道了微生物发酵法生产m t g ，其基本工艺流程为： 发酵液离心取上清液超滤取浓缩液c g 一5 0 离子交换树脂收集活 性部分再次通过c g - 5 0 离子交换树脂收集活性部分斗稀释( 降低导热 性) 一通过蓝琼脂糖柱一转谷氨酰胺氨酶( 被活性了1 7 8 倍) 。 1 2 转谷氨酰胺酶国内外研究进展 1 2 1t g 来源研究现状 多年以来，人们都是从动物组织中提取转谷氨酰胺酶，由于来源稀少，分离提纯 工艺也很复杂，因此使得该酶的价格十分昂贵。直到1 9 8 9 年，才有了利用微生物发 酵法生产转谷氨酰氨酶的报道，1 9 8 9 年h n d o 等人报道了他们从5 0 0 0 株菌株中筛选出 s t r e p t o v e r t i c i l i u mj 一8 1 1 2 ，s t r e p t o v e r t i c i l i u ms p , s t r e p t o v e r t i c i l i u mg r i s e o c a n e u n , 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 s t r e p t o v e r t i c i l i u mc i n n a m o n e ns u b p ，c i n n a m o n e u ms t r e p t o v e r t i c i l i u mm o b a r a e n s e 能够用 发酵法生产转谷氨酰胺酶，1 9 8 9 m o t o k i 等人报道了茂原链轮丝菌、灰肉链轮丝菌以及 肉桂链轮丝菌等也能产生t g a s e 化1 ，1 9 9 2 年a n d o 发现链霉菌属中的其他一些菌株也 能产生此酶，并对发酵过程进行了优化，使得该酶的产量有了大幅度的提高，从而为 食品工业利用此酶创造了条件。 1 2 2 t g 聚合单体蛋白研究现状 早在7 0 - 8 0 年代，就已有很多学者研究了动物来源的t g ( 特别是豚鼠肝脏来源) 催化动物和植物来源的蛋白质，包括乳蛋白、大豆球蛋白以及其他的蛋白质。 1 2 2 1t g 对单体蛋白聚合机理研究现状 1 9 8 0 年i k u r a 等最早研究了豚鼠来源的t g 催化酪蛋白各组分的活性，发现它更 易催化a 。或b 一酪蛋白旧。 1 9 9 0 年a b o u m a h m o u d 等人用猪肝脏来源的t g 聚合乳清蛋白，结果表明，聚合乳 清蛋白的最佳p h 为6 5 , - - 8 0 ，且随着反应时间的延长，聚合程度增加，4 h 达到最大 【9 】 o k i m 等用转谷氨酰胺酶处理牛肌动球蛋白溶液，然后用s d s - - p a g e 进行分离并用 光密度法检测条带，发现交联聚合的肌球蛋白从处理前的l o 1 2 2 增加到2 0 7 3 5 ，而未发生聚合的肌球蛋白单体则从未处理前的2 0 9 3 4 下降至处理后的1 3 0 2 7 ，可见转谷氨酰胺酶催化的交联聚合作用比较明显n 叫。 2 0 0 1 年，唐传核等人用微生物转谷氨酰胺酶分别催化酪蛋白酸钠和乳清蛋白，结 果表明，酪蛋白中的a 一酪蛋白、b 一酪蛋白最易被催化，而k 一酪蛋白不易被催化， 乳清蛋白的b 一乳球蛋白、a - - a 蛋白都能被聚合，而b 一乳球蛋白更易受m t g a s e 的催化，而且对乳清蛋白进行加热预处理，同时添加还原剂可明显提高m t g 对乳清蛋 白的催化活性n 1 1 2 1 。 2 0 0 4 年，唐传核等人又用t g 聚合大豆蛋白，一结果显示；m t g 较易催化大豆酸沉 蛋白( s a p p ) 的大豆球蛋白聚合，而不易使7 s 球蛋白聚合，而且只能使大豆球蛋白 中的酸性亚基聚合，几乎不能使其碱性亚基聚合n 引。2 0 0 4 年梁华民等人n 4 用t g 聚 合大豆分离蛋白，结果显示4 5 ，- - - 5 0 。c ；p h 7 0 、反应时间2 h ，最适添加酶量为5 u gn 引。 1 2 2 2t g 对蛋白功能特性的影响研究现状 1 9 8 4 年m o t o k i 研究a 。一酪蛋白、k 一酪蛋白和大豆7 s 、1 1 s 球蛋白交联后的溶 解性、乳化性以及乳化稳定性。结果表明交联后的溶解性、乳化性以及乳化稳定性得 到提高n 引。 4 转谷氨酰胺酶在乳蛋白间的交联机理及应用研究 1 9 8 7 年m a t h e i s 和w h i t a k e r 提出蛋白质发生交联后可以改善食品质构；改善其 溶解性、起泡性、乳化性n 刚。 1 9 9 6 年b a b i k e r 等以酸或蛋白酶对大豆蛋白酶做预处理，然后再用t g 催化其聚 合反应，所得的聚合物虽然有很高的分子量，但由于其表面疏水性下降，在水中是可 溶的，并且其乳化性和发泡性均有明显的提高，聚合后蛋白凝胶特性，尤其是硬度和 粘性有较显著提高n 。 1 9 9 8 年f a r g e m a n d 等研究t g 催化聚合酪蛋白，结果显示在低聚合度时有较高的 稳定性，而高聚合度是反而会使乳状液失稳他引。 1 9 9 9 年l i u 等研究了m t g 催化b 一酪蛋白以及对它乳化性质的影响，结果显示聚 合降低了乳状液的乳化指数，然而随催化聚合程度的增加，其稳定性也增加。可见两 者之间存在一定的差异u 引。 2 0 0 1 年，杨晓泉用转谷氨酰胺酶催化大豆蛋白和乳清蛋白，结果表明，大豆蛋白 和乳清蛋白之间可以聚合，并且形成的聚合蛋白具有很好的耐热性和耐酸性心引。 2 0 0 2 年，王淼等人采用微生物转谷氨酰胺酶对牛乳中酪蛋白进行酶法改性，结果 表明，酪蛋白的起泡性、泡沫稳定性和持水性都有不同程度的增加幢。 1 2 2 3t g 聚合异源蛋白研究现状 对于异源蛋白间的聚合，国内外研究相对较少。较早以前有人报道t g 能催化不 同蛋白( 即杂源蛋白) 相互聚合，然而有关报道指出此类研究的证据是值得怀疑的。 2 0 0 2 年h a n 等报道在预热情况下酪蛋白和乳清蛋白之间可以聚合幢引，而2 0 0 3 年 唐传核等人研究t g 催化异源蛋白聚合机理，认为酪蛋白和乳清蛋白不能聚合；而大 豆蛋白和乳清蛋白可以聚合眩引，可见二者之间存在一定的矛盾。对于大豆蛋白和酪蛋 白之间能否聚合，至今还未有确凿的证据证实。 总之，尽管还没有确凿的证据确证不同蛋白质之间产生聚合交联，但是我们不妨 对这种可能性进行探讨。 1 2 3t f i 在食品行业中的应用 由于经转谷氨酰胺酶处理过的蛋白质具有良好的理化特性和功能效价，它现在已 被广泛用于肉制品( 2 4 2 5 ) 、鱼制品( 2 6 2 7 2 8 、面制品c 2 9 3 0 、乳制品门1 3 2 1 等食品行业中。 1 2 3 1 在乳品中的应用 ( 1 ) 增加凝胶强度，提高酸奶质量 在m t g 的作用下，用葡萄糖一6 一内酯酸化酪蛋白或预先在5 0 。c 下用酶处理酪蛋白 溶液l h ，再酸化，可形成较强的凝胶。m t g 形成的凝胶强度大，其剪切力比通常的酸 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 凝胶高几倍，其临界剪切力值是1 0 0 0 p a ，而酸凝胶的临界剪切力值为2 0 0p a ，并且 再5 0 , - 8 5o c 下，凝胶强度变化不大，剪切力值保持不变，存放期间，乳清析出较少。 m t g 形成的凝胶具有良好的特性，如增强了对酸、对热的抵抗性，提高了保水性。因 此，在酸奶生产中添加微生物转谷氨酰胺酶可改善酸奶品质，提高酸奶质量“引。另外， 在重制奶酪生产中，添加微生物转谷氨酰胺酶处理后，使乳清蛋白和酪蛋白交联在一 起，可以提高奶酪的质量，增加经济效益。用该酶处理牛奶，可使牛奶粘性增加。 ( 2 ) 改善乳蛋白乳化特性 利用m t g 处理的乳蛋白质，分子间发生聚合作用，这些聚合物不易发生聚集，从 而提高乳化性。q 。酪蛋白、k 一酪蛋白等经转谷氨酰胺酶催化后发生交联，可以作为 优良的乳化剂应用于乳品生产。 ( 3 ) 提高乳蛋白的热稳定性 许多研究表明，m t g 能提高乳的热稳定性。经过微生物转谷氨酰胺酶催化交联的b 一乳球蛋白表现出较高的热稳定性。1 的聚合b 一乳球蛋白在1 0 0 。c 下，可保持3 0 m i n 不变性，而b 一乳球蛋白在7 0 。c 下就会发生变性。利用微生物转谷氨酰胺酶能明显改 善乳粉加工中出现的玻璃化，从而提高了玻璃化的温度，减少了玻璃化的发生。 ( 4 ) 其他应用 将m t g 交联过的酪蛋白脱水后，可得到水不溶性的薄膜，这种薄膜能够被胰凝乳 蛋白酶分解，因而是一种可食用膜，能够用做食品包装材料( 3 3 1 ；用m t g 聚合酪蛋白时 加入玉米醇溶蛋白水解物制成的膜柔韧性很强n ；在加工炼乳过程中加入少量的转 谷氨酰胺酶，炼乳不易出现脂肪上浮和蛋白质颗粒沉淀现象，而少量的该酶容易使冰 淇淋成型且不易溶化。引。 1 2 3 2 肉制品中的应用 m t g 由于可以形成蛋白质分子内和分子间的交联，因此在肉制品重组中得到广泛 应用，这也是目前利用该酶最多的行业。人们通过研究发现，肌球蛋白是m t g 的良好 底物，而肌球蛋白是肉类中的主要蛋白，m t g 能使肌球蛋白发生交联，所以能够改善 肉类的结构。k i m 等用m t g 处理牛肌球蛋白溶液，然后用s d s p a g e 进行分离，并用光 密度法检测条带，发现交联聚合的肌球蛋白从处理前的1 0 1 2 1 增加到1 3 0 2 7 ，可见聚合作用之明显n 刚。用共焦激光扫描显微镜可观察到肌球蛋白凝胶的形成。 ( 1 ) 改进产品质地结构提高产品质量 k u r a i s h i e d 报道了m t g 能够在i o 。c 的低温下经过夜粘合碎肉，他发现用m t g 处 理的酪蛋白酸钠具有很强的粘性，这种胶粘性很强的酪蛋白酸钠能够将不同的食品粘 合在一起c 3 5 o 用此方法可以将碎肉、肉片、碎鱼重组为牛排、猪排、鱼排等。并且不 需要加入氯化钠和磷酸盐，生产出低盐、低脂的健康肉制品。 6 转谷氨酰胺酶在乳蛋白间的交联机理及应用研究 ( 2 ) 加强保水性提高产品得率 由于微生物转谷氨酰胺酶所催化形成得凝胶有牢固得空间网络，能较强包容大量 水分，从而防止肉制品加工过程中产生得皱缩现象，提高产品嫩度，同时也提高了产 品得率。 ( 3 ) 降低添加剂使用量开发新型保健食品 食盐、硝酸盐、磷酸盐是各种肉制品中必不可少的成分，它们在维持肉品质量( 色、 香、味、质地) 有重要作用。但它们的添加又明显有有损健康的潜在性。实验证明， 在肉制品中微生物转谷氨酰胺酶能降低这些添加剂的使用量，但同时又能保持肉制品 原有的风味。例如将香肠中食盐量降为0 4 ，再加入0 2 5 的微生物转谷氨酰胺酶， 则这种香肠的感官特性与添加1 7 食盐的香肠完全相同，添加3 磷酸盐香肠与不添 加磷酸盐只加入微生物转谷氨酰胺酶的香肠相比，其香肠的抗裂性等指标完全相同。 微生物转谷氨酰胺酶在肉制品中完全可起到磷酸盐类添加剂在增加肠馅内聚力、增加 保水性等方面的作用。同时应用微生物转谷氨酰胺酶可生产良好的乳化剂，开发出低 脂保健型肉制品。 1 2 3 3 在小麦粉制品中的应用 小麦粉中的蛋白质主要是面筋蛋白，含有大量的谷氨酰胺残基，是m t g 的良好底 物。1 9 9 2 年g o t t m a n n 等人首先m t g 处理焙烤食品，他们发现在活面过程中添加m t g 可以提高面团稳定性和面块的体积。s a k a n o t o 等发现m t g 处理能够减少面条烹饪后结 构的破坏，增加面包焙烤后的体积。倪新华等曾使用m t g 对面粉进行品质改良研究， 结果表明m t g 可以催化面筋蛋白形成一( r - 谷氨酰胺) 赖氨酸共价键，从而明显改 善面团的粘质特性，使面团的形成时间、稳定时间、断裂时间增加，面团的弱化度降 低。 1 2 3 4 在水产品中的应用 目前，m t g 在水产品中的应用主要在于增强鱼糜制品的弹性和凝胶强度等方面。 此外，m t g 的另一用途是作为一种处理新型的蛋白质改良剂来重组低值鱼虾，提高产 品的外观、风味、质地，从而提高产品的附加值。陶秀蛾等介绍了m t g 和一定比例淡 水鱼虾配以适当的调味剂，水及淀粉溶液，制成重组鱼虾肉食品的基本工艺，并通过 实验确定了工艺配方，结果表明m t g 作为一种使蛋白质分子交联的食品添加剂，在淡 水鱼虾的深加工中具有改善食品结构，提高产品得率，提高原料的利用率，改善食品 的营养及产品的原有风味，产生良好的口感的作用，从而提高产品的市场价值。 s e k i e t a l 发现内源性的鱼m t g 可使鱼蛋白浆在低温下被交联而提高强度。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 1 3 酶改性蛋白中存在的问题 不论是那种来源的转谷氨酰胺酶，都能够提高蛋白质的功能特性，但酶改性后， 蛋白质的营养价值是否会发生变化以及在食用上的安全性是人们非常关注的问题。 转谷氨酰胺酶催化蛋白质分子内或分子间形成l g 键，由于此键对胃液有很强 的抵抗性，所以不能被胃液分解，但可在肾脏中被y 一谷氨酰环化转移酶分解为赖氨 酸和5 一羟脯氨酸，5 一羟脯氨酸进一步转化为谷氨酸门引。但最近的研究发现，在小肠 刷状缘细胞、血液中也存在着y 一谷氨酰环化转移酶，可分解e 一( r - 谷氨酰) 赖氨酰 的二肽，形成赖氨酸和谷氨酸，因此，使用转谷氨酰胺酶不会影响对蛋白质营养成分 的吸收，即不会降低蛋白质的营养价值婚 。另外，由于转谷氨酰胺酶天然存在于各种 畜肉，鱼虾中，在肉类的烹调过程中，这些内源性t g a s e 会在肉类蛋白质之间形成l - g 键。因此，蛋白质经转谷氨酰胺酶作用后，在食用上是安全的。目前，此酶在食品行 业中的应用还未见不良反应报道，笔者研究将此酶用于酸奶生产能明显提高酸奶的粘 度并能够抑制酸奶后期粘度和酸度的降低，但酸奶光泽度稍差，同时酶的价格相对昂 贵，大批量生产一定程度上提高了生产成本，因此，期待着能筛选到大量产转谷氨酰 胺酶的微生物。 1 4 本论文研究的主要内容 本研究根据转谷氨酰胺酶在蛋白之间进行交联和聚合的机理，而酪蛋白和乳清蛋 白的分子结构中都存在可发生作用的赖氨酸和谷氨酸残基，借助于还原剂或乳品加工 过程中的预热处理过程，使酪蛋白和乳清蛋白之间进行交联，使乳蛋白的功能特性得 到改善。 ( 1 ) 首先，在国内外对酪蛋白和乳清蛋白单独聚合条件研究的基础上，适当调整作用 条件，通过s d s - - p a g e 凝胶电泳技术、中红外光谱技术和电子显微镜技术，来初步确 定酪蛋白和乳清蛋白之间交联的可能性。 ( 2 ) 在确定酪蛋白和乳清蛋白之间交联存在的基础上，通过正交旋转回归设计来确定 获得较高凝胶强度和黏度的酪蛋白和乳清蛋白混合液的最佳作用条件。 ( 3 ) 在上述实验研究的基础上，将t g 酶以不同的添加方式和不同的添加量应用到酸奶 的加工中，测定酸奶的黏度、凝胶强度、持水性、乳清析出率、贮存黏度等物性指标 的变化，为t g 酶在酸奶生产实践中的应用提供理论参考。 1 5 本论文研究的意义 ( 1 ) 转谷氨酰胺酶是一种优良的蛋白交联剂，添加少量的转谷氨酰胺酶，就能明显提 高乳制品品质，增加经济效益。 转谷氨酰氨酶一种酰基转移酶，它有几种不同来源( 本课题所用转谷氨酰氨酶是 8 转谷氨酰胺酶在乳蛋白问的交联机理及应用研究 从微生物中提取的) ，它可以催化蛋白质分子内或分子间形成e 一( r 一谷氨酰基) 赖 氨酸共价键，生成网络状超大蛋白质分子，使蛋白质改性，改性后蛋白质的塑性、凝 胶性、持水性、水溶性和稳定性都得到了改善，同时由于赖氨酸的引入使蛋白质的营 养价值得到了提高。 ( 2 ) 目前世界上乳清资源浪费严重，不仅污染环境，而且浪费大量优质蛋白，合理利 用乳清资源势在必行。 乳蛋白作为全价优质动物蛋白，近年来已经越来越得到消费者的重视，在乳蛋白 中，酪蛋白占蛋白总量的8 0 ，在乳制品生产中酪蛋白的利用率很高，而乳清蛋白却 在干酪加工中大部分流失。据统计，目前世界上尚有4 0 - - - , 5 0 的乳清不能被再次利用， 以废水的形式排放，严重的污染了环境。这些无疑都是对乳清蛋白的很大浪费，而乳 清蛋白又是可获得的营养最全面的天然蛋白质之一。大多数乳清蛋白产品的蛋白质效 价( p e r 值) 为3 1 ，超过了酪蛋白的p e r 值( 2 5 ) ，仅次于鸡蛋的p e r 值( 3 9 ) 。 乳清蛋白不仅易于消化吸收，其必需氨基酸含量高于其他蛋白质，组成也完全符合或 超出f a o w h o 要求。此外。它们独特的氨基酸序列和三维结构也赋予了它们广阔的功 能特性，所有这些性质对食品加工是十分有益的，但其理化功能尚不突出，不能满足 现代食品的开发和加工的需要。 ( 3 ) 转谷氨酰胺酶对酪蛋白等同源蛋白的交联已经形成定论，但对于异源蛋白间的交 联还存在着一些争议，因此有必要对其进行探讨和研究。 目前，此酶对乳清蛋白和酪蛋白等单体蛋白的交联已经形成定论，但对于异源蛋 白间的交联还存在着一些争议，因此有必要对其进行探讨和研究，如果通过该酶的作 用能使酪蛋白和乳清蛋白交联在一起，这不仅对合理开发利用乳清蛋白，保护环境， 有效利用廉价资源，扩大其应用领域具有重要意义。 1 6 展望 本论文的研究过程是在实验室条件下进行的，某些工艺步骤和参数还有待于细化 和在实际生产中进一步完善。转谷氨酰胺酶作为一种优良的食品添加剂，由于其全部 从动物组织或微生物中提取，因此具有食用上的绝对安全性，随着对转谷氨酰胺酶研 究的不断深入，它的来源会越来越广泛，价格也会逐渐的向生产企业可接受的方向发 展，由于添加少量的转谷氨酰胺酶就能够明显改善乳制品的品质，因此，在未来乳制 品生产特别是在重制干酪的生产中具有非常广阔的应用前景。 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 2 实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 材料和试剂 甘氨酸 n - 乙基顺丁烯二酰胺( n e m ) 转谷氨酰胺酶( t g - n ) 乳清分离蛋白( w p i ) ( 蛋白质9 0 ) 酪蛋白( c n ) ( 蛋白质9 4 ) n 、n 一二甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 十二烷基磺酸钠( s d s ) 四甲基乙二胺( t e 皿d ) t r i s d t t 鲜牛奶 发酵剂菌种( 保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌) 蔗糖 其它所有化学试剂均为分析级。 s i g m a 公司 上海生化所 江苏一鸣精细化工有限公司 新西兰乳品公司 新西兰乳品公司 舳也s c o 公司 a m r e s c o 公司 仙皿s c o 公司 m 砸s c o 公司 a l f r e s c o 公司 农科院畜牧场 内蒙古农业大学益得 乳制品研究中心提供 食用级白砂糖 2 1 2 主要仪器和设备 电泳仪d y y 一6 c 型北京六一仪器厂 u v p 美国凝胶成像分析系统 北京基因有限公司 电热恒温水浴锅t u - 2 0 d 英国t e c h n e 公司 电热鼓风干燥箱d h g - 912 3 a上海精宏实验设备有限公司 酸度计 p b 一2 0 北京赛多利斯仪器系统有限公司 磁力加热搅拌器 7 9 - 1 江苏金坛市医疗仪器厂 电子天平 b s 4 0 0 s - w e i 北京赛多利斯仪器系有限公司 脱色摇床t s - 1 型北京六一仪器厂 中红外光谱仪t e n s o r 3 7 一f t i rb r u k e r 电子显微镜日立h - - 7 5 0 0 日本 超净工作台d l - c j - 1 n哈尔滨市东联公司 黏度仪 d v - ev i s c o m e r t e r 美国 质构仪ta-xt2型 英国 生化恒温培养箱h s p 3 0 0 型武汉中科科仪技术发展有限责任公司 1 0 转谷氨酰胺酶在乳蛋白间的交联机理及应用研究 高速离心机 高压灭菌锅 派德森全乳成分分析仪 均质机 l x j i i b y x 0 一l s 一1 8 s i f j 2 0 0 上海安亭科学仪器厂 上海函今仪器仪表有限公司 北京科拓恒通生物技术有限公司 上海标本模具厂制造 2 2 实验方法 2 2 1 转谷氨酰胺酶在酪蛋白和乳清蛋白间的交联机理研究实验方法 2 2 1 1 电泳和凝胶定量实验方法 ( 1 ) 十二烷基钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) s d s - p a g e 电泳参照l a e m m li ( 1 9 7 0 ) 的方法并根据实验需要略作改动，分离胶浓度 为1 5 ，浓缩胶浓度为5 汹3 。样品缓冲液( 含有5 巯基乙醇和2 s d s ) 和样品溶液直接 混合( 体积比为1 ：1 ) ，电泳前煮沸3 5 m i n 。上样量为1 0 u l ，凝胶电泳于2 0 m a 恒流下 进行，电泳时间为3 h 。凝胶染色液用含有0 4 的考马斯亮蓝r - 2 5 0 ，脱色采用快速脱 色法，v ( 乙醇) ：v ( 醋酸) ：v ( 水) = 2 5 ：1 0 ：6 5 ，8 h 即可脱完。 ( 2 ) 蛋白带相对光密度测定方法 凝胶染色以及脱色后，于凝胶成像仪进行成像处理后用l a b w o r k 软件进行蛋白带 光密度扫描分析。 2 2 1 2 不同条件t g 催化聚合酪蛋白和乳清蛋白 ( 1 ) 非变性条件 酶反应体系为2 的酪蛋白和乳清蛋白混合水溶液，用1 n n a o h 或1 n h c l 调节p h 7 0 ， 添加酶量分别为1 0 u g 酪蛋白。反应混合物于4 5 水浴中分别保温0 0 h 、0 5 h 、1 0 h 、 2 0 h 、3 0 h 、4 o h 、8 0 h 、1 2 0 h 、2 4 0 h 后，加入等体积样品缓冲液终止反应，立 即进行s i s p a g e 检测。 ( 2 ) 2 1 入还原剂 酶反应体系为2 的酪蛋白和乳清蛋白混合水溶液，用1 n n a o h 或1 n t c l 调节p h 7 0 ， 加入一定量的2 0 m m o l l d ”，添加酶量分别为l o u g 酪蛋白。反应混合物于4 5 。c 水浴中 分别保温0 o h 、0 5 h 、1 0 h 、2 0 h 、3 0 h 、4 0 h 、8