噬菌体展示技术.ppt

1,噬菌体展示系统Phageondisplay,2,噬菌体展示原理噬菌体展示定义、分类简介噬菌体及淘选过程噬菌体展示应用淘选过程中常见问题及解决方案,噬菌体展示系统Phageondisplay,3,Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。噬菌体表面展示技术：是一种将外源多肽或蛋白质的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,外源基因将随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以与外壳蛋白融合表达的形式展示在噬菌体表面。,什么是噬菌体表面展示技术,4,根据噬菌体不同：温和噬菌体-M13烈性噬菌体-T7根据文库不同：肽库CDNA文库抗体库,噬菌体展示系统的分类,5,M13噬菌体的组成和结构,丝状噬菌体：M13。单链DNA病毒,6407bp。基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有pIII、pVIII两种结构蛋白质。DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒。,6,M13噬菌体的生命周期,PIII蛋白结合于E.Coli的F纤毛细菌的Tol蛋白复合体解聚噬菌体的外壳蛋白，ssDNA转运至胞浆病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体,7,次要外壳蛋白pIII,406aa组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。由三个功能区组成：N1穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。N2受体结合区：负责结合F菌毛。CT疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性,8,主要外壳蛋白pVIII,每子个病毒含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽。以pIII融合子方式表达的是单价的，而以pVIII融合子方式表达的则是多价的。这种多价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而单价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。,9,pIII展示和pVIII展示的区别,pVIII展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合表达外源多肽及蛋白。,10,噬菌体展示技术流程,11,噬菌体抗体库的构建,建库：例子,12,噬菌体质粒-phagemid,噬菌体质粒特征：携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，没有其他噬菌体基因。有包装序列信号。（packingsignal）有供筛选的抗生素标记基因。Helperphage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶。,13,14,筛选的方法亲和淘选,直接包被淘选法：直接将靶分子包被在固相表面优点：简单直接。缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入可能是由于分子的立体封阻或者是靶分子表面的部分变性而引起液相淘选法：将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体复合物。优点：克服直接包被的出现的问题缺点：容易筛到与亲和素（或者链酶亲和素）结合的克隆。,15,噬菌体抗体库淘选示意图直接包被法,噬菌体抗体库与靶分子相互作用洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体将特异性结合的噬菌体洗脱下来，并扩增，用扩增产物进行下一轮筛选三轮淘选后，克隆测序,16,第一步：生物素化抗体与磁珠结合BindtoStreptavidincoatedmagneticbeadbiotin-antigen,噬菌体抗体库淘选示意图液相法,17,第二步：磁珠生物素化抗原复合物与抗体库结合,18,第三步：洗涤洗去非特异和弱结合的噬菌体,19,第四步：洗脱将特异性结合的噬菌体洗脱下来,20,第五步：扩增将洗脱的噬菌体扩增,E.coli,感染和扩增,扩增产物进行下一轮筛选后面的筛选逐步加大筛选压力多克隆和单克隆噬菌体ELISAELISA阳性克隆测序，最终得到特异性结合的克隆序列,21,噬菌体展示系统Phageondisplay,噬菌体展示原理噬菌体展示定义、分类