动力学测定方法的简介.doc

动力学测定方法的简介江西医学检验1997年15卷第2期动力学测定方法的简介江西省临床检验中心李胜远严冰邮编330006自从多通道分析仪,离心式分析仪问世来,临床化学测定方法取得了飞速发展,临床化学测定的自动化已日益普及.购置自动化分析仪,运用动力学方法检测将得到广搓应用_J.本文着重介绍动力学测定法的基本知识,以期对新开展工作者有所帮助.1.化学反应过程和测定方法动力学法和终点法l的区别.在临床化学测定中,一般通过一次以上的化学反应来获得某种物质浓度.绝大多数化学反应又都具有一个动态的反应过程(见附图).此图是反映产物量(或吸光度)与反应时问的关系曲一r,/一+蜒曩期牲性期非蝇性期t化学反应的过程线.虚线a反映二个不同时间:虚线a左侧,随反应时问延长,反应产物量不断增加,此称为反应动态期,虚线a右侧,随时间延长反应产量无明显变化,反应已趋于平衡,称为反应平衡期.任何化学反应都经历动态期朝着平衡的方向发展,但反应速度各不相同.若在反应中加入催化剂或加温来加快反应速度可缩短反应达到平衡所需的时间,但都不会改变化学反应的方向直至达到平衡.如果某反应产物豹测定是在反应的动态期,称这类方法为动态法(或动力学方法);如果是在反应达到平衡期再进行测定的动态期,称这类方法为动态法(或动力学方法);如果是在反应达到平衡期再进行测定则称为平衡法(或终点法).二种测定方法的根本区别在于终点法常是用反应平衡后测定的吸光度(A)表示待测物浓度,而动态法是利用动态期测定单位时间内吸光度的变化(A),即反应速度(或速率),来表示待测物质浓度或酶活力.因此在动态法中为了监测A,就必须严格控制反?23应时间和反应温度,这在一般比色计或分光光度计中很难达到.只有自动或半自动分析仪才能采用动力学法测定.动力学法不仅大大提高了检测准确性和测试速度,而且过去一些不能开展的项目现在也能开展了.因此动态法具有更明显的优越性.它代表了现代临床化学检测的先进水平?.2.动力学化学分析法【3.t】2.1动态期时间与吸光度(产物浓度)曲线.2.11延缓期:在许多化学反应包括酶促反应,在动态期开始时,并不是立即吸光度的变化就与反应时问成线性关系.一般需要1530秒或更长时间,才能达到监铡反应速度的线性期.这一段时问在动力学法中称为延缓期(图中虚线b左侧).不同测定项目有不同的延缓期,在设计动力学方法的监测时间应避开延缓期.21.2线性期:延缓期后,吸光度的变化与反应时间进入成比例的线性关系,这一时期在动力学方法中称为线性期(图中b,c二虚线之间).对待测物液度和酶活力的监测应在线性期时间内进行.2.13非线性期:线性期结速到平衡期开始的一段时问称为非线性期(图中c,a二线之间)在这段时间内,反应速度逐斯减慢,曲线逐渐平坦,此时反应速度常常不能准确反应待测物的含量或酶活力.22延迟时间和测量时间动力学方法测定中,开始反应到开始监测的一段时间为延迟时间延迟时问内反应不成线性,不能进行监劂.不同项目,可有不同的延迟时间.延迟时间在于:平衡反应体系温度;排除干扰物的影响;消除比色池的气泡等等.所以在动力学法中,避开延缓期,并正靖地设置延迟时间和测量时间,才能得出正璃的检测结果2.4J.23非线性24在速率法的测量时间内,分折仪要对反应液进行多次监测.但在实际测定中,由于种种原因可能致使单位时间内监测到的吸光度变化(A/rain)不尽相同,此即非线性.所以在试验中反复出现非线性,应考虑试剂变质,延迟时间设置不适当,样品酶活力是否过高,这些均可造成非线性.24动力学法分类?.24.1一点法:在动态反应中,在预先规定的时间,测定一点吸光度值.其中又分为终止反应法和不终止反应法.使用动力学一点法应注意延缓期必须小到略而不计,结果才可靠,一点法只测某一特定时间的吸光度值,它无法反映整个反应的实际过程,亦无法校正反应的非线性或由延缓期引入的误差.使用一点法只是酶促反应被终止了,而不是反应已经达到平衡.2.4.2二点法:在线性反应期中测定二点吸光度值,根据二点间吸光度的差值来计算被浸物质的含量,二点间隔时间以秒计算.只有自动或半自动生化分析仪才能准确控制吸光度的变化.二点法可以避开延缓期和由干扰物质的付反应所引起的非线性.但又同一点法无法了解反应的实际过程.2.4.3多点法:这是利用自动或半自动生化分析仪,在一个化学反应的动态线性期,进行多点连继监测的一种方法,多用于酶活性测定.不同仪器对.删试的数据采用不同的处理方法,常用detaA法(AA法),回归法和带速率时间(TR)多点法.2.431A法是在酶促反应的线性期,每隔一定时间(230秒)进行一次监测,连续多次,计算相邻点间吸光度差值(AA),求出单位时间内的反应速度(A/min)和平均A/min,用于酶活力或被测物质浓度的计算.2432回归法是利用线性公式v=a十bx对获得的多个数据进行处理,求出斜率(b)和截距(a)在不同时间段求出相应斜率,去掉过大或过小的斜率值,取其线性部分用于结果的计算.24.3.3带速率时间(TR)多点法是设立速率这一参数,电子计算机按速率时间的信号工西医学检验l997年第15卷第2期计算结果,一般速率时间为2O一30秒,这样在不减少数据点的情况下,增大每个计数点的值1015倍.244一点速率双项同测法是在一个反应进行一点法(项目A)与速率法(项目B的二个项目的分析方法.2.4.5带血清信息的速率法是指定带血清信息的测定项目,在第2,3,4光点处分别进行混浊(L),溶血(H),黄疸(I)的测定,因此在速率法分析中使用第5以后的测光点.2.4.6速率法及双项测定法是在一个反应内使用速率法分析二个项目,在测定光点的前半程,侧定项目A,后半程测定项目B.25动力学法报告方式和结果计算-.25.1报告方式:目前酶活力报告有二种方式.一种是国际单位,另一种是由国际单位制导出的Kata单位.国际单位:指每分钟能催化I;mol底物转化所需要的酶量为1个国际单位(即lttmol/min).kata单位:指每秒钟酶反应转化的底物量IKata=Imolts(秒)或lnkata=lnm61/s.二者换算:IU=1000/60nkata=16.67nkata2.52结果计算252.1终点法结果计算实际上包括二种澍定方法,一为化学反应确实达到平衡韵方法.另一种是动态法中一点法的终止反应法.待测物质浓:(样品终点暖光度一样品空白吸光度)一(试剂终点吸光度一试剂空白吸光度)因数因数:标准液浓度/(标准终点吸光度一标准空白吸光度)一(试剂终点吸光度一试剂空白吸光度)2.5.2.2二点法结果计算待冽物质浓度=(AA样品一AA试剂空白)因数因数:标准品浓度/(AA标准品一AA试剂空白)25.2.3速率法结果计算(AA法)待测物质浓度或酶活力=(A/min样品一AA/min试剂空白)因数.因数同上酶活江西医学检验1997年筘15卷第2期力单位(“)/L=A/mini(F)因数因素(F)=10/e?dxVr/Vs上式中e=某一物质吸收光谱特征的物理常数即摩尔消光系数或吸光系数,d=比色池光径(cm),Vr=反应物总体积,Vs=样品体积,10=Imol=10”mo13.酶活性动力学法测定类型:体液内大部分酶含量甚微,直接测定其含量不大可能,通常是测定其催化活性.根据酶催化反应的反应速度间接推算酶的含量.不论是光电比包法或自动,半自动生化分析,都是测定样品中酶催化作用的能力的大小.因此这类方法都属于动力学法,而利用生化分析的则又属于速率法或连续监测法.在酶促反应过程中,只有在线性期时,单位时间内吸光度的变化才与酶活力成正比.因此酶浓度(E)与产物浓度(P)或底物浓度(s)的变化成正比E=k.S/t或E=kip/t,式中t表示时间,K为常数.根据酶促反应产物又分为直接测定法和偶联法.3.1.直接测定法:是直接利用酶促一步法反应中底物或产物的理化特征的变化如吸收光谱分析,即吸光度变化(A).目前最常用的有以下几种方法:3.11色素原基质法:这类方法大多是直接利用人工合成的”色素原”底物.其本身无色经酶作用后.生成有色产物,根据酶促零级反应期吸光度增加的速率,计算出酶的活力.例如:碱性磷酸酶(AI,P)的测定对硝基苯磷酸盐(无色)+H2O=对硝基酚(黄色)+磷酸盐基质无色.产物黄色在405nm有最大光吸收.计算:样品用量10gl,试剂用量50,比色池光径1.0cm.对硝基酚摩尔消光系数18800.则:ALP(WI,)=zAJminFF=10/e?dVr/Vs:10./188001510/10=2713编程时输入因数2713.测定后仪器自动打出ALP的活力单位.?253.1.2有辅酶I或辅酶参加的脱氢酶反应的紫外分光光度法:是利用脱氢酶其氧化型(NAD,NADP)在340rim没有光吸收,而还原型(NADH,NADPH)则在340rim处均有吸收峰在酶促反应中,340nm处均有吸收峰.在酶促反应中,340rim处吸光度的增减速率与待测酶活力成正比.例如:乳酸脱氢酶(LDH)测定II,UI一乳酸+NAD十=丙酮酸+NADH+H+该酶促反应若以乳酸为基质,刚反应向右进行,生成丙酮酸,NAD+被还原为NADH,340nm处吸光度上升,此称为L法;若以丙酮酸为基质,反应向左进行,生成乳酸.NADH被氧化为NAD+340nm入吸光度下降,此称为P法.P法的参考值为L法的二倍,国内多用I法.通过监测340nm处吸光度的增减速率表示样品中LDH的活力.计算:同上,NADH摩尔消光系数6220.则:LDH(v/L)=A/mlnFF=10/622Ox1510/10=81993.2酶偶联法:某些待测酶促反应中,产物或底物均无特征理化特征可供直接浏定.但若在反应体系中加入另外的酶(指示酶),使测定酶的产物与指示酶反应偶联起来,通过测定指示酶反应,间接推算待测酶活力.常用的儡联反应是有辅酶I或辅酶参加的脱氢酶反应.偶联又有二步酶偶联或三步酶偶联法?-.32.1二步酶偶联法:丙氨酸氯基转移酶(ALT)测定ArrI,一丙氨酸+a一酮戊二酸丙酮酸十I一谷氨酸丙酮酸NADH+HL一乳酸十AI前一反应为待测酶本身催化反应,称为主反应.AIT为待测酶,后一反应为偶联的脱氢酶反应.称为指示反应.LDH为指示酶.测定时,通过监1删340nm处NADH氧化生成NAD+的吸光度下降的速率,计算ALT活力.计算同上.3.22三步偶联法:这类测定法主反应的26?产物,既不能监测,叉不能直接与NADH或NADPH参加的脱氢酶反应进行偶联,还需引入另一个反应.才能将主反应与指示反应相联.组成三步酶偶联反应体系.例如肌酸激酶(CK)测定磷酸肌酸+ADP肌酸+ATPATP+葡萄糖葡萄糖一6一磷酸+ADP葡萄糖6一磷酸+NADP+6一磷酸一葡萄糖酸+NADPH+H前式为主反应,CK为待测酶;中闻为辅助反应,HK(己糖撤酶)为辅助酶;后者为指示反应,G6POH(葡萄糖一6一磷酸脱氢酶)为指示反应.此外还有四步酶偶联法,中间需要二个辅助反应才能与脱氢酶反应偶联.4.代谢产物的酶法测定【67l代谢产物的测定一直沿用化学比色法,这类方法操作繁,需时长.特异性差.近年来将代谢产物作为底物,以酶作为试剂.即用酶法测定,使用终点法,也可使用酶动力学方法但不管用哪种方法都需要带标准品.通过与标准品比较求得样品中代谢产物含量.但通常使用酶终点法,通过加大工具酶用量,缩短动态期.甚至在三分钟内就可达到终点.大大缩短了测定时间.也可分直接法和偶联法,基本同上.并具有简便,快速,特异性强,灵敏度高等特点.是化学法所不能比拟的.例如尿素的酶法测定:谷氮酸脱氢酶偶联二点法.尿素+2H0曼2NH+HCONH十a一酮戊二酸+NADH竺墨G酸LI聪)H氧酶谷氨酸+NAD+H20(上接第27页)2.7正常参考值范围取100份门诊体检健康者血清(浆)样本.按上述方法在1小时内测定完备.其中男性江西医学检验1997年第t5卷第2期计算方法同前(3.2.1.等方法)5,同功酶动力学法测定10,”以往同功酶多用电泳法测定.操作繁琐.所需时间长目前如CK.LDH等同功酶都采用酶动力学法测定.操作简单.速度快,且只针对某种有意义的同功酶进行测定】.例如:a一羟丁酸脱氢酶(aHBDH)测定a一酮丁酸+NADH+H+a一羟丁酸+NAD此反应为可逆反应,a一酮戊酸或a一羟丁酸均可作基质.LDH2对底物a一羟丁酸亲和力较高,借此可将LDH2与其他LDH同功酶区别开来.LDH2能a一羟丁为底物,故又可称为a一羟丁酸脱氢酶.参考文献lKaldorG:clinicdlEnzology.preger州bU姒l9832王晓明:诊断酶学方法的现状盈进展,吉林压学91.(4)i311353.;lolphIandLorenzREnzymeDiagT,incsoftheHeart.Leverandpanczas.SKarger.NewYork.198l:9624.清求样一等编酶分析法的原理和应用上海科学技术出版杜.1982:49985王毓三酶动力学测定原理与方法+临床检验杂志l:l19856Dixonmctal:Enz_vmc3rdedLongmnGroupC