（环境科学与工程专业论文）柔性金属对大肠杆菌毒性机理的研究.pdf

循环发生。为了探索铜对细胞的致死率与氧化应激的关系，且验证铜 毒性与羟基自由基导致的细胞结构破坏的猜想，研究了c u ( i i ) 与抗坏血 酸( l a s c a ) 体系对ec d 乃的致死率，并与同能参与f e n t o n 反应的 f e ( i i i ) 和c r ( i i i ) 的作用进行了比较分析，进而用电子自旋共振技术 ( e s r ) 分析了各体系产生的o h 的量与致死率的关系。结果表明：l a s c a 的加入极大增强了c u ( i i ) 对e z 的致死率，且两者共存体系下， e c d j f 死亡率呈c u ( i i ) 浓度依赖。相应的，o 0 1 l 。a s c a 的加入加倍了 o 2h 1 1 c u ( i i ) 体系中的0 h 浓度，与致死率分析中l a s c a 的加入极大 增强了c u ( i i ) 的毒性一致；此外，l a s c c u ( i i ) 共存体系中，c u ( i i ) 浓 度高于o 1m m 时，产生的0 h 浓度与c u ( i i ) 浓度成正比，同样与致死 率分析中c u ( i i ) 浓度依赖结果相吻合。而2 0 0p m 的f e ( i i i ) 和c r ( i i i ) 未 能检测到羟基自由基的产生，它们对细胞的毒性也相对弱于c u ( i i ) 。分 析结果综合表明在致死剂量下c u ( i i ) 的确能诱发0 h 的产生，且产生量 与铜对大肠杆菌的致死率成正相关。 但有趣的是，当c u ( i i ) 浓度为o 0 2m m 时，与o 0 1 l a s c a 共存 体系下，e s r 无法检测到o h ，然而该体系对ec d ，i 的毒性反而大于 检测到较高0 h 浓度的o 2m mc u ( i i ) 单独系统。这意味着，在较低 c u ( i i ) 浓度下，存在氧化应激之外的其它毒性机制。与此同时，最新研 究表明，由于c u ( i i ) 尤其是c u ( i ) 的强亲硫性，在非致死剂量下便能破 坏ec o j i 中外露的铁一硫簇脱水酶而成为其致毒的首要原因，该研究成 果确切解释了本研究中出现的这一矛盾现象。 2 柔性金属对ec d ，i 的抑制作用分析 铜为柔性金属中的一种，为了验证这种由于强亲硫性而致毒的机 理是否具有共通性，首先分析了银、汞、镉、锌、铅、镍、钴、锰在 标准基本培养基中对ec o 矗的抑制作用。并以银为代表，深入分析了 其抑制作用的影响因素。 结果表明，在简单基本培养基中，极低浓度的a g ( i ) 和h g ( i i ) ( o 1 5 “m ) 便能抑制ec d 厅生长，这与这两种金属公认的极强抗菌性 相一致。较高浓度的n i ( i i ) 、c o ( i i ) ( 分别为4 0 0 “m 和2 0 0p m ) 才开 始抑制细胞的生长；其它柔性金属未表现出明显抑制作用；此外，银 对ec d j f 的抑制作用与好氧或厌氧状态无关，而与培养基种类、培养 基组分和菌液浓度高度相关，表明了其毒性与氧化应激无：关。 3 柔性金属对活体细胞外向m a 的作用 延胡索酸酶a ( a ) 是一种典型的铁一硫簇脱水酶，因为其铁一 硫簇外露很容易成为一些有毒物质的攻击对象。为了验证柔性金属是 否能破坏 4 f e 一4 s 簇而使m m a 失活，首先在厌氧条件下提纯了延胡索 酸酶a ，并逐一测定了上述八种柔性金属对纯化m m a 活性的作用。通 过底物保护，失活m m a 的活性还原、e s r 对失活后如m a 的f e s 簇 结构解析以及酶失活过程中同步铁原子释放等研究手段对柔性金属的 作用机制进行了系统分析。 微摩尔浓度的a g ( i ) 、h g ( i i ) 和相对较高浓度的c d ( i i ) 、z n ( i i ) 能以 极快的速度使纯化如m a 失去活性，使如m a 失活的能力与其亲硫性强 弱相吻合，但高达毫摩尔浓度的p b ( i i ) 、n i ( i i ) 、c o ( i i ) 和m n ( i i ) 未对 如m a 活性产生影响。e s r 和铁离子释放分析证实了各金属作用于酶的 活性位点 4 f e 一4 s 】簇，而且失活后的酶能够通过f e s 簇重建而重新获 得活性。a g ( i ) 、h g ( i i ) 和c d ( i i ) 作用后如m a 的 4 f e 一4 s 簇被完全降解， 而z n ( i i ) 作用下失活后则部分呈 3 f e 一4 s 形式。 4 柔性金属对活体细胞内各类酶的作用。 一个关键问题是铁一硫簇酶是否为柔性金属a g ( i ) 、h g ( i i ) 、c d ( i i ) 和z n ( i i ) 使细胞致毒过程中的首要攻击目标。为此必须通过细胞活体内 的研究进行确认。因此，首先测定了各金属对ec d f f 的生长抑制剂量； 继而在对应边界剂量下，分析了各金属对细胞中含外露 4 f e 一4 s 簇的脱 水酶活性的影响，同时研究了各金属对f e s 簇组装( i s c ) 系统的影响。 结果表明致毒边界剂量下的a g ( i ) 、h g ( i i ) 、c d ( i i ) 和z n ( i i ) 便能破坏外 露的 4 f e 一4 s 】簇酶缸m a 、异丙基苹果酸异构酶和6 一磷酸葡萄糖脱水酶， 而且失活后的酶活性同样可以被还原。而且这四种金属不能使几种其 它类型的酶失活，这些酶包括不含f e s 簇的p 一半乳糖苷酶、苹果酸脱 氢酶以及含有内嵌式铁一硫簇的n d hi 脱氢酶；此外四种金属都能破坏 ec d 办中的铁一硫簇组装系统。结果综合表明了活体细胞内各金属在开 始抑制细胞生长的剂量下便能破坏这一类含外露 4 f e 一4 s 】簇的脱水酶， 且其作用具有专一性。 总之，本研究结果表明了柔性金属的毒性机理存在共通性。柔性 金属c u ( i ) 、a g ( i ) 、h g ( i i ) 、c d ( i i ) 和z n ( i i ) 在对ec d 如致毒时，首先破 坏细胞中含外露 4 f e 一4 s 簇的一类脱水酶。且该作用是由于各金属共同 的强亲硫性，通过破坏酶的活性位点 4 f e 一4 s 簇而使酶失活，其致毒能 力与各金属亲硫性强弱相一致。 关键词：柔性金属、铁硫簇脱水酶、毒性机理、亲硫性、大肠杆菌、 电子顺磁共振 v t o x i cm e c h a n i s m s0 fs o f tm e t a l sa g a i n s t a bs t r a c t m e t a l t o x i c i t ym e c h a n i s mh a sg a i n i n gi n c r e a s i n gf o c u sd u et os e v e r e rm e t a lp o i i u t i o na n dh i g h e r p e o p l ec o n s c i o u sw i t hh e a l t ha n de n v i r o m n e n t a ls a f e t ) ，m a n ym e t a l sa r et o x i ct oh u m a n s o v e r l o a d c a nr e s u l tf r o mg e n e t i cd e f e c t st h a ta b r o g a t eh o m e o s t a t i cc o n t r o l s ，o rf r o me x c e s si v ee n v i r o m e n t a l e x p o s u r e t h em e c h a n i s m sb yw h i c hm o s tm e t a l sp o i s o nc e l l sa r eu n c l e a r ，d u ei n1 ) a nt ot h eb r e a d t h o ft h e i rc h e m i c a la c t i v i t i e s al o to ft o x i cm e t a l ss h a r eo n ec h a r a c t e r i s t i c ：t h i o p h i l i ( ：i c y a c c o r d i n g l y ， t h o s em e t a l sa r en a m e ds o rm e t a l ，g e n e r a l l ys p e a k i n g ，c u ( i 】) ，a g ( i ) ，h g ( i i ) ，c d ( u ) ，z n ( i i ) ，p b ( i i ) ， n i ( i i ) ，c o ( i i ) a n dm n ( i i ) a l lh a v es u b s t a n t i a la m n i t y t os u l 向ra n da r ea l li n c l u d e d a l s o ，t h e i rt o x i c 时 r o u g h l yp a r a ll e l st h e i rt h i o p h i l i c i t y ，s u g g e s t i n gt h a tt h e i rp r i m a r yb i o l o g i c a it a 唱e t sa r el i k e l yt ob e e n 纠m e st h a tc o n t a i nk e ys u l m y d 拶lm o i e t i e s i nt h i sr e s e a r c h ，s o f tm e t a lt o x i c i t ya n dt h e i rm e c h a n i s m w e r ei n v e s t i g a t e du s i n gec d ，fa st h em o d e lo r g a n i s m i r o nh a sb e e nap a r t i c u l a rf o c u so fs t u d y ，b e c a u s ei ti sn a t u r a l l ya b u n d a n ti n s j l d ec e h s c u r i e n t d a t ai n d i c a t et h a th i g hl e v e l so fi n t r a c e l l u l a ri r o na r et o x i cp r i m a r i l yd u et oi t st e n d e n c yt or e a c tw i t h e n d o g e n o u sh y d r o g e np e r o x i d ea n dg e n e r a t eh y d r o x y lr a d i c a l sa n dt h e nd a m a g ec e l l s c o p p e rs h a r e s w i t hi r o ni t sa b i l 时t or e a c tw i t hh y d r o g e np e r o x i d e ，a n ds oi th a sb e e nw i d e l ys u s p e c t e dt h a ti t s t o x i c i t yi n v o l v eas i m i l a rm e c h a n i s m h o w e v e r ，o u rl a b o r a t o 叫h a sf o u n dt h a ti 1 1 t r a c e l l u l a rc o p p e r d i r e c t l yd a m a g e de n z y m e st h a tc o n t a i ni r o n s u l f u rc l u s t e r s t o x i c i 够o fc u ( i i ) a g a i n s te 疗u n d e rw e a ka c i d i cc o n d i t i o n sb o t hw i t ha n ( 1w i t h o u tl a s c a w e r ed i s c u s s e d c o m p a “s o nw e r em a d eb e t w e e nc u ( 1 1 ) ，f e ( i l i ) a n dc r ( i i i ) w h i c hw e r ef e n t o na n d h a b e 卜w e i s sr e a c t i o nr e l e v a n t t h et o x i cm e c h a n i s m ，e s p e c i a l l yf o rc u ( i i ) ，r e g a l d i n gt oo x i d a t i v e s t r e s sa n dc o p p e rt h i o l p h i l i c i t yw e r ei n v e s t i g a t e da n dd i s c u s s e d ec d ，fv i a b i l i t yw e r et e s t e dw h i l ee x p o s e dt ov a r i e dm e t a ls y s t e m sa n dt h et o x i cp a r a f n e t e r sw e r e d e t e m i n e d ；l a s c ad e g r a d a t i o nu n d e rv a r i e dc o n d i t i o n sw e r et e s t e d ；t h ea b i l i c yo fc w ，l - a s c a s y s t e mt od i s i n f e c ts t r a i n si s o l a t e df r o mn a t u r a lw a t e rw e r ei n v e s t i g a t e d ；e s rw a su s e dt od e t e c ta n d q u a n t i f yt h e 。o hp r o d u c e d ；c o p p e rt o x i c i t yw a ss y s t e m a t i c a l l yd i s c u s s e dr e g a r d i n gb o t ho x i d a t i v e s t r e s sa n dd a m a g i n gf e sc l u s t e re n z y m e s v r e s u n ss h o w e dt h a tl a s c ao b v i o u s l ye n h a n c e dt h et o x i c i t ) ，o fc u ( i i ) u n d e rp h 4 o ，a n dt h e t o x i c i t yw a sc o p p e rc o n c e n 仃a t i o nd e p e n d e n t ；ec d 矗v i a b i l i t yd r o p p e d t oz e r oi n2 ha f t e re x p o s e dt o 2 0 0 肛m ，2 0p m ，2 工m ，o 2 “mw i t h0 0 1 l a s c a ；t h ec o e x i s t e n c es y s t e ma l s os h o w e dh i 曲p o t e n c y t ok i l lo t h e rs t r a i n si s 0 1 a t e d ；l a ae 1 1 l l a n c e dc u ( 1 i ) b u tn o tf e ( i i i ) a n dc r ( 1 1 1 ) b a c t e r i c i d a le m c i e n c y a td h 4 ，u n d e rw h i c ha l lc e nd e a t hw a ss h o w ni n3 0m i n u t e sa r e rf u l lc o n t a c tw i t h2 0 0 肛m ，2 0 肛m c u ( i i ) a j l d2h o u r sw i t h2 m ，0 2 肛mc u ( i i ) c r ( i i i ) a l o n e ，h i c hi sw i d e l yr e c o g n i z e da si i l n o c u o u s a n ds t a b l e ，a t0 2 m m ，p h 4 ，a l s os h o w e ds u r p r i s i n g l yh i g hd i s i n f e c t i o nc a p a b i l i t y e s rr e s u l t ss h o w e dt h a tl a s c a sa d d i t i o nd o u b i e d0 hc o n c e n t r a t i o no f2 0 0 mc u ( i i ) s y s t e m h o w e v e r ，s o m eh y d m x y lr a d i c a lw a sd e t e c t e db y0 2m mc u ( i i ) a l o n eb u tn o tb y0 0 2m m c u ( i i ) a n d 0 0l l a s c aw h i c hc o n t r a d i c t o r ys h o w e dh i g h e rc e uk i l l i n ga b i l i t y n oo hw e r ed e t e c t e dw i t h c r ( i i i ) f e ( i i i ) a n dl a s c as y s t e m as y n e r g i s me f 诧c te x i s t e db e t w e e nc u ( i i ) a n dl a s c a ，a n dc u ( i i ) p a l y e dt h em a j o rr o l ef o r c a u s i n gc e l lt o x i c i t y i nt h ep r e s e n c eo fl a s c a ，h i g hc o p p e rc o n c e n t r a t i o nu n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n s p r o d u c e dh i g ha m o u n to r o ha n ds h o w e dr e l a t i o n s h i pw i t ht h ec e l ld e a t h ；h o w e v e r ，u n d e rl o w e r c o o p e rc o n c e n t r a t i o nw h i c hd i d n th a so hd e t e c t e d ，c u ( i i ) sa b i l i t yt od a m a g ef e sc l u s t e re n z y m e s m a d et h em 萄o rc o n t r i b u t i o n w h e r e a s ，t h et o x i c i t ) ，o fc r ( 1 i i ) w a sc o m p l i c a t e da n dr e m a i n st ob e e l u c i d a t e d t h eo t h e rs o rm e t a l s ( i n c l u d i n ga g ( i ) ，h g ( i i ) ，c d ( i i ) ，z n ( i i ) ，p b ( i i ) ，n i ( i i ) ，c o ( i i ) ，m n ( i i ) ) t o x i c i t ya g a i n s te c d 厅a n dt h e i ra b i l i t yt od a m a g ef e sc o n t a i n i n ge n z y m e s t o x i c i 妙o fe a c hs o rm e t a la g a i n s tw i l dt y p ee c d 疗m g1 6 5 5w e r ei n v e s t i g a t e du n d e r1 0 wo d ( 0 0 0 5 ) a sar e p r e s e n t a t i v e ，a g ( i ) sa b i l i t yo fc e l lg r o 、v t hw a s d i s c u s s e di nd e t a i l p a r a m e t e r s d i s c u s s e di n c l u d i n go x y g e nc o n d i t i o n s ，m e d i u mt y p e s ，m e d i u mc o m p o n e n t sa n db r a n c h e dc h a i n a m i n oa c i ds u p p l e m e n t a t i o n r e s i s t a n c eo fc o p a ，ap - t y p ea t p a s e ，o v e ra g ( i ) a n dc u ( i i ) w e r e a n a l y z e da n dc o m p a r e d a n a e r o b i cp u r i f i c a t i o no ff u m aw a sc o n d u c t e do r d e r e da sf o l l o w ：p r o t a m i n e s u l f a t et r e a t m e n t ，d e a es e p h a r o s ec o l u m n ，( n h 4 ) 2 s 0 4t r e a t m e n t ，p h e n y ls e p h a r o s et r e a t m e n t ， c o n c e n t r a t i n g ，s u p e r d e x2 0 0t r e a t m e n ta n d 打n a lc o n c e n t r a t i n g f u r t h e m l o r e ，s o rm e t a la b i l i t ) ，t o a t t a c ke x p o s e di r o n s u l f u rc o n t a i n i n ge n z y m e sw a si n v e s t i g a t e ds y s t e m a t i c a l l yb o t hi nv i t r oa n di n v i v o i nv i t r oa n a l y s i sw a sm a i n l yc o n d u c t e dw i t hp u r i 6 e df u m a t h o s ei n c l u d e dd e s t r u c t i o n ，s u b s t r a t e p r o t e c t i o n ，d a n l a g e de n z y m er e a c t i v a t i o na n dr e b u i l d ，e p ra n df el o s sa n a l y s i so fd a m a g e df e - s c l u s t e rs t r u c t u r e i nv i v oe x p e r i m e n tw e r ea l sf o l l o w ：t h r e s h o l dd o s eo fa g ( i ) ，h g ( i i ) ，c d ( i i ) a n dz n ( i i ) w e r et e s t e d u n d e ro d 6 0 0o 2 ；t h e nc e l l sw e r et h e nh a r v e s t e da r e re x p o s u r et ot h em e t a lc o n c e n t r a t i o n st h a ti n i t i a l t o x i c i t ya n d 4 f e 一4 s 】d e h y d r a t a s ee n 纠m e s ( f u m a ，e d d ，i p m l ) a c t i v i t yw e r em e a s u r e da r e n v a r d s ；a s n e g a t i v ec o n t r o l ，e n z y m e st h a td o n tc o n t a i nt h ec l u s t e r ( p g a l ，m d h ) o rh a v es h i e l d e dc l u s t e r s ( n d hi ) w e r ea l s oa n a l y z e d ；m e t a le f f e c ta g a i n s tf e sb u i l da n da s s e m b l yi s cs y s t e mw e r ec o n d u c t e dw i t hp v 翌墨! 瞄瞄圜譬豳_ g a la s s a yo fs u f ：l a c zf u s i o ns 仃a i ns j 2 5 3 ；彳z 行以7 2 4 j k a nm u t a n t ( n a m e df x l 0 1w a sm a d eb vp 一1 t r a n s d u c t i o nf r o mm g16 5 5a 1 1 dt h e nu s e dt oa n a l y z ez n ( i i ) r e s i s t a n c e i nv i t r oe x p e r i m e n t sr e v e a l e dt h a t1 0 w 。m i c r o m 0 1 a rc o n c e n t r a t i o n so fa g ( i ) ：m dh g ( i i ) d i r e c t l y i n a c t i v a t e dp u r i 6 e df u m a r a s ea ，am e m b e ro ft h ed e h y d r a t a s ef a m i l y t h ee n z y m ew a l sa l s op o i s o n e d b yh i g h e rl e v e l so fc d ( i i ) a n dz n ( i i ) ，b u ti tw a su n a f - f e c t e db ye v e nm i l l i m 0 1 a rm r l ( i i ) ，c o ( i i ) ，n i ( i i ) ， a n dp b ( i i ) e p r a n a l y s i sa n dm e a s u r e m e n t so fr e l e a s e di r on - c o n f l 瑚e dt h a td 锄a g ew a l sa s s o c i a t e d w i t hd e s t r u c t i o no ft h e 4 f e - 4 s 】c l u s t e r ，a n di n d e e dt h er e c o n s t r u c t i o no ft h ec 1 1 j s t e rf u l l vr e s t o r e d a c t i v i t y g r o 、v t hs t u d i e sw e r et h e np e r f o 肌e dt o t e s tw h e t h e rd e h y d r a t a s ed a m a g em i g h tu n d e r l i e t o x i c i 够i nv i v o b a r e l yt o x i cd o s e so fa g ( i ) ，h g ( i i ) ，c d ( i i ) ，a n dz n ( i i ) i n a c t i v a t e da l lt e s t e dm e m b e r s o ft h e 【4 f e 一4 s 】d e h y d r a t a s ef a m i l y a g a i n ，a c t i v i t yw a sr e c o v e r e dw h e nt h ec 1 l l s t e r sw e r er e b u i l t t h em e t a l sd i dn o td i m i n i s ht h ea c t i v i t i e so fo t h e rs a m p l e de n z y m e s ；i n c l u d i n gn a d h d e h y d r o g e n a s e i ，a ni m n s u l 如rp r o t e i nw h o s ec l u s t e r sa r es h i e l d e db yp 0 1 y p e p t i d e 7 i h u st h ed a t ai n d i c a t et h a t d e h y d r a t a s e sa r ed a m a g e db yt h ec o n c e n t r a t i o n so fm e t a l st h a ti n i t i a t eb a c t e r i o s t a s i s f a n gf a n gx u ( e n v i r o n r r i e n t a le n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db y 兰：蜓垒q ! 些型塔h 星丛 p r o f e s s o rj a m e sa i m l a y p m f e s s o rk a z u ok a k i i k r 正yw o r d s ：s o rm e t a l s ，e ，c 厅g r 纪厶尬c d 疗，f e sc l u s t e r ，t o x i c i t y ，m o l e c u l a r m e c h a n i s m ， t h i o p h i l i c i t y ，e l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e v 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本版权书。 不保密d 。 学位论文作者签名：币令锡乙指导教师签名：低免 【 日期：1 7 年s 月猸日期：劢l 年 月日 附图目录 图1 1 环境氧化应激：氧化系统和还原系统的失衡4 图1 2 氧气的还原状态及其标准还原电位川一6 图l 一3l a s c a 及d a s c a 的化学机构式8 图l 一4e s r 装置示意图1 0 图1 5 电子自选捕捉剂m 4 p o 与o h 反应式1 1 图l 一6 铁一硫簇的常见结构1 9 图l 一7 技术路线图2 1 图2 一le s r 检测到的+ 0 h 浓度计算方法简图3 5 图2 2 不同浓度ec 础在0 2 mc u ( i i ) 0 0 1 l a s c a 共存体系下的存活率3 6 图2 3c u ( i i ) 单独作用下e c o 厅的细菌存活率3 7 图2 4l a s c a 单独作用下ec d ，i 细菌存活率测定3 8 图2 5c u ( i i ) 和l a s c a 单独与共同作用下的细胞存活率比较一3 9 图2 60 0 1 l a s c a 共存体系下c u ( i i ) 浓度变化对与毒性的影响4 0 图2 7l a s c a 浓度变化对与0 2 肛mc u ( i i ) 共存体系下毒性的影响4 l 图2 8f r a n c e 庭院水池中分离出的菌株( f 株) 的s e m 照片4 4 图2 。9c u ( i i ) 、c r ( i i i ) 、f e ( i i i ) 单独作用下ec d ，f 的细菌存活率比较4 8 图2 一l00 0l l a s c a 与c u ( i i ) 、c r ( i i i ) 、f e ( i i i ) 共存下ec d ，i 的细菌存活率比较4 8 图2 1 1c u ( i i ) 、f e ( i i i ) 、c r ( m ) 存在条件下l a s c a 降解速度分析4 9 图2 1 2c r ( i i i ) 、l a s c a 单独或共存条件下的毒性比较及e d t a 的影响5 0 图2 一1 3 不同浓度c “i i i ) 单独作用下细胞的存活率测定5 l 图2 一1 4 菌体浓度对2 0 0n mc r ( i i i ) 毒性的影响5 1 图2 1 5 + o h 浓度随m 4 p o 量的变化关系5 3 图2 1 6c u ( i i ) + l a s c a 反应体系对ec d ，i 的毒性产生机理示意图5 5 图2 一1 70 2m mc u ( i i ) 士0 0 1 l a s c a 下产生的o h 的e s r 谱图5 6 图2 1 80 0 1 l a s c a + 不同c u ( i i ) 浓度下检测到的o he s r 谱图5 7 图2 一1 9c “l i i ) 、f e ( i i i ) 单独存在以及f e ( i l i ) + 0 0 1 l a s c a 体系下0 h 的e s r 谱图5 8 v 图3 1 低菌体浓度标准基本培养基中各金属对ec 础m g l 6 5 5 的抑制作用6 6 图3 2 好氧、厌氧条件下l b 和m m 中a g ( i ) 对ec o 疗的抑制作用比较6 8 图3 3 不同培养基中a g ( i ) 对ec 撕的抑制作用比较6 9 图3 4l b 培养基中对银产生螫合作用的成分分析6 9 图3 5 菌液浓度对银抑制作用的影响7 0 图3 6 添加支链氨基酸对银抑制作用的影响7 1 图3 7a g ( i ) 对w 3 1 1 0 及d w 3 11 0 ( c o p a 。) 菌株的抑制作用及i l v 的修复作用一7 2 图3 8c u ( i i ) 对w 3 1 1 0 及d w 3 1 1 0 ( c o p a 一) 菌株的抑制作用及i l v 的修复作用7 3 图3 9d w 3 1 1 0 滞后生长的原因分析7 4 图4 1f u m a 结构示意图：曲线部分为f u m a 蛋白，立方体为 4 f e 一4 s 】簇一7 8 图4 2a g ( j ) 浓度对s j 5 2 粗提液中向m a 活性的影响9 1 图4 3b s a 蛋白浓度标准曲线9 2 图4 4a g ( i ) 使s j 5 2 粗提液中f u m a 失活随时间的变化及温度的影响9 3 图4 5b s a 浓度标准曲线9 3 图4 6 硫酸精蛋白处理对应b s a 蛋白浓度标准曲线9 4 图4 7d e a e 阴离子交换处理后所收集各试管中酶浓度及活性分布9 4 图4 8d e a e 阴离子交换柱后对应b s a 蛋白浓度标准曲线9 5 图4 9p h e n y ls e p a r o s e 柱分离后所得各试管中f u m a 的浓度与活性分布图9 5 图4 1 0p h e n y l s e p h a r o s e 处理后对应b s a 蛋白浓度标准曲线一9 6 图4 一l ls u p e r d e x 柱分离后各个试管中f u m a 的浓度及活性分布一9 6 图4 1 2s u p e r d e x 一2 0 0 处理后对应b s a 蛋白浓度标准曲线9 7 图4 1 3s d s p a g e 蛋白纯度确认9 7 图4 一1 4 各柔性金属对纯化f u m a 的作用及不同浓度的银使纯化f u m a 失活的速率曲线1 0 2 图4 1 5l m a l a t e 与f u m a 反应的米氏常数( k m ) 测定1 0 3 图4 1 6f u m a 底物保护分析1 0 3 图4 17 各柔性金属作用下失活后f u m a 的活性修复10 5 图4 一l8e p r 分析a g ( i ) 和z n ( 1 i ) 作用失活后f u m a 的 4 f e 一4 s 】簇结构10 6 图4 一1 95 0 州a g ( i ) 使6 7 州f u m a 失活过程中伴随的f e 释放分析10 7 图4 2 0 柔性金属使f u m a 失活过程示意图10 8 v 图5 1 高菌体浓度下a g ( 1 ) 、h g ( i i ) 、c d ( i i ) 和z n ( i i ) 对e ，js j 3 2 的抑制作用1 2 0 图5 2a g ( i ) 、h g ( i i ) 、c d ( i i ) 和z n ( i i ) 对活体细胞内f u m a 活性的影响及活性修复1 2 l 图5