（遗传学专业论文）乙烯不敏感显性突变基因ers21基因作用机理的研究.pdf

摘要 植物激素乙烯早在一百多年前就被确认，相关的研究使得乙烯广泛的被应用 于农业上。乙烯信号传导途径上各个元件及其突变体的发现，最终确立了乙烯信 号传导的遗传模型。但是这个遗传模型仍无法很好的解释第一亚家族和第二亚家 族乙烯受体的作用机理。在这项课题中。我们研究第二亚家族显性受体突变体基 因e r s 2 的显性作用机理，通过遗传杂交的方法得到带有e r s 2 转基因的e t r l 7 i p 护2 37e i n 4 ，4 ；e r s 2 3 的l o s s o f - f u n c t i o n 功能丧失四突变体，再通过比较e r s 2 ，的 单突变体及e r s 2 一在e t r l 7 ；e r r 2 3 ；e i n 4 4 三突变体中的表型分析，从而推理对 乙烯不敏感显性突变e r s 2 一j 的作用机理。 利用遗传杂交，获得t ：e r s 2 j je t r l 一7 ，e t r 2 - 3 te i n 4 - 4 和t ；e r s 2 - 1 ；e t r 2 一，i e i n 4 4 ；e r s 2 3 的杂交f 1 后代，所以遗传背景中e t r 2 3 和e i n 4 4 始终都是纯合的， 要获得t ：e r s 2 一? e t r l 一7 ；e t r 2 一j ；e i n 4 - 4 je r s 2 - 3 纯合子只要g e n o t y p i n ge t r l l e t r l 7 和e 脚尼坩：一3 即可。g e n o t y p i r l _ g 的结果显示，编号8 l - i 的遗传背景是纯合的e t r l 一7 ； e t r 2 3 ；e i n 4 4ie r s 2 3 四突变体。 e r s 2 一j 单突变体和t ：e r s 2 一，ie r r 2 3 ie i n 4 4 ie r s 2 3 的成株表型差异不大，而 t ：e r s 2 一l ；e t r l - 7 ；e t r 2 3 ；e i n 4 4 和t ：e r s 2 j je t r 2 3 je i n 4 4 ，e r s 2 3 虽然在幼苗时期 差异不大，但在成株可以明显看出e r s 2 一j 在缺少一个第一亚家族乙烯受体的情况 下丧失了部分的显性功能。 三突变体的遗传背景与四突变体相比，只是在三突变体中保留了e r s 2 的野生 型基因，而当这个野生型的e r s 2 基因突变后，对乙烯不敏感的e r s 2 ，基因的功能 便减弱了，说明显性基因e r s 2 在e t r l 一77e t r 2 3 j e i n 4 4 三突变体中的功能可以 经由活化e r s 2 后再传给e r s l ，而不仅仅是直接传给e r s l 。 关键词：乙烯、受体、e r s 2 一基因、三重反应、 v a b s t r a c t i th a sb e e nf o rm o r et h a nac e n t u r ys i n c et h ei d e n t i f i c a t i o no f e t h y l e n ea sag a s e o u s p l a n th o r m o n e ，a n ds t u d i e so nt h ee f f e c t s o fe t h y l e n et o p l a n t s h a v ee n a b l e db r o a d a p p l i c a t i o n s i n a g r i c u l t u r e d i s s e c t i n g o ft h e s i g n a l i n gp a t h w a y h a sl e dt ot h e e s t a b l i s h m e n to fag e n e t i cm o d e lo fe t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y h o w e v e r t h i sm o d e lc a n n o tt e l lh o wt h ed o m i n a n tm u t a t i o n so f t h e r e c e p t o rg e n e s ，s u c ha se r s 2 一i c o n f e r e t h y l e n e i n s e n s i t i v i t y i n o r d e rt of u r t h e r i n v e s t i g a t e t h em e c h a n i s mo f e t h y l e n e i n s e n s i t i v i t yc o n f e r r e db yad o m i n a n tm u t a t i o n ，w ec o m p a r e dt h ep h e n o t y p e s o f e r s 2 一，i nm u t a n t sd e f e c t i v ei nm u l t i p l er e c e p t o r g e n e s u n d e r e t h y l e n et r e a t m e n t ，t h ee r s 2 一，m u t a n td i s p l a y e da ne t h y l e n e i n s e n s i t i v e p h e n o t y p e w h e ne r s 2 一，w a si n t r o d u c e dt oe t r l - 7 ；e t r 2 一，；e i n 4 - 4t r i p l em u t a n t ，e t h y l e n e i n s e n s i t i v i t yw a sr e d u c e ds l i g h t l yt ot h er o s e t t e s ，b u tn o tt ot h es e e d l i n g h o w e v e r , i nt h e e t r l 一7 ；e r r 2 一土e i n 4 一e r s 2 3q u a d r u p l em u t a n tb a c k g r o u n d i nw h i c ht h e w i l d t y p e e r s 2 g e n ew a sl o s t ，t h ef u n c t i o no fe r s 2 r e d u c e dt oa ne x t e n tb yw h i c ht h et r a s n g e n e w a su n a b l et od i s p l a ya p r o m i s i n ge t h y l e n ei n s e n s i t i v i t y a c c o r d i n g l y , e r s 2 - ，i ss t i l la b l et oc o n f e re t h y l e n ei n s e n s i t i v i t yv i aas i n g l e r e c e p t o rg e n ee r s ii nt h eq u a d r u p l em u t a n t ，b u ta ta h i g h l yr e d u c e dl e v e lc o m p a r e dt o i t sf u n c t i o ni nt h e t r i p l em u t a n t s t h em a j o rd i f f e r e n c eb e t w e e nt h eq u a d r u p l ea n d t r i p l em u t a n t si st h ea b s e n c eo faw i l d t y p ee r s 2 g e n ei nt h eq u a d r u p l em u t a n t a n dw e p r o p o s et h a tt h ed o m i n a n c ec o n f e n e db ye r s 2 一c a nb em e d i a t e da n d a m p l i f i e dv i 口t h e w i l d - t y p ee r s 2 t ot h es u b f a m i l yir e c e p t o re r s 1 k e y w o r d ：e t h y l e n e ，r e c e p t o r s ，e r s 2 一，g e n e ，t r i p l er e s p o n s e v _ _ 一 致谢 本研竟是在文启光研宪聂珀直接拍导和周根余教授的悉心关杯下完成的。从 选题、方案制定、实施到最后的结朵分析，都凝聚焉拍导老师的心血和智慧n 同 时导师僻i 博的知识，严谨的科叶态度反对科学事业的执著选术都将使我终生 获置。镬此对两位老师表寺睬儇的谢意， 感谢李建专老揖在实验和生话中对自己的关心， 谢谢到培丽老师给予的关心和帮助， 在实验研究期间碍到| 了谢芳网欣的无私帮助和指导在此向她们表示衷 心的感谢 感谢实验室的会休崴黄列培嗣煮师、谢芳周欣、陈华民张杰邱丽萍 徐婵忘不了一年半的朝夕相处和实验中的相王帮助。团结的集体才会取得成功 这是诛们教会我的。谢谢， 感谢所有关心我菇老师、同学和朋友， t - t - 特别感谢一直支持我，关蟮我的父母和姐妲。谢谢他们一直以采的理解 和支持。他们的爱一直是我前进的动力。 列茜 昌燃掣 苎二里型塞茎主圣丝墨苎塑堡里兰圣壁笪! 些量一 第一章拟南芥中乙烯受体的作用与乙烯信号传导 乙烯是五大类植物激素之一，它在植物不同生长发育阶段起调节作用，如种 子荫发、病原反应、压力反应、果实成熟、叶片脱落、豆类根瘤菌的形成等等( a b e l e s ， 1 9 9 2 ：o d o n n e l le ta l ，1 9 9 6 ：p e n n i n c k x e ta l ，1 9 9 6 ) 。 n e i j u b o w 首先在豌豆的幼苗中观察到了所谓的乙烯的“三重反应”，即幼苗在 处理乙烯后会出现：向邋性生长、茎的延伸受到抑制、茎的加租生长( n e u u b o w ， 1 9 0 1 ) 。在拟南芥中“三重反应”包括：下胚轴的加粗生长、顶端严重弯曲的弯钩 和下胚轴、根细胞扩大受到抑制( b l e e c k e re ta l ，1 9 9 8 ：g u z m a na n de c k e r ，1 9 9 0 ) 。 利用“三重反应”可以进行简单的遗传筛选。获得乙烯不敏感突变体和组成型乙 烯反应的突变体。 e t r l 是植物中第一个成功克隆的乙烯受体基因( c h a n g e ta l ，1 9 9 3 ) ，这个基 因的克隆也帮助了整个乙烯受体家族的发现。拟南芥中另外一些与乙烯反应有关 的基因突变体c t r t ，e i n 2 ，e i n 3 及其相关基因的发现，导致拟南芬中乙烯信号传导 途径的遗传模型最终建立。 虽然基于“三重反应”筛选到的突变体似乎已经达到饱和，但乙烯信号传导 的遗传模型仍有许多空白需要来填充和完善。许多新的经过改进的筛选方法正在 得到应用，希望可以筛选到乙烯信号传导途径中新的基因。 1 乙烯受体基因： 1 1 乙烯受体基因的结构 拟南芥中有五个乙烯受体基因。e t r l 、e r s i 、e t r 2 、e r s 2 孑曰彤4 ，它们在 结构上与原核生物的组氨酸激酶结构域具有很高的同源性( c h a n g e ta 1 ，1 9 9 3 ；h u a 兰二皇型童茎! 兰壁墨堕塑生望皇圣堡堡羔堕兰一 e ta 1 ，1 9 9 5 ；s a k a ie ta 1 ，1 9 9 8 ：h u a e ta l ，1 9 9 8 ) 。而后者被认为是原核生物和低 等的真核生物用来感受外界环境变化和压力，如磷酸化、化学刺激及渗透压变化 等等( u r a o ，2 0 0 0 ) 。 e t r l 是第一个被发现的乙烯受体基因，它在编码蛋白质序列的结构上与细菌 的双组分系统十分相似。e t r l 蛋白n 一末端具有三个跨膜节段，作为信号输入部 分，e t k l 蛋白结合乙烯的部位被证明是在其跨膜节段( s c h a l l e ra n db l e e c k e r ， 1 9 9 5 ) 。 g a f 结构域位于三个跨膜节段之后，它的具体功能还不清楚，但在原核生物 中它可以结合c g m p ( k a n a c h e r e ta l ，2 0 0 2 ) 。 c 末端是信号输出部分，其序列与细菌的双组分系统的组氨酸激酶结构域及 反应调节器高度同源( c h a n g e ta l ，1 9 9 3 ) 。e t r l 具有组氨酸激酶活性( g a m b l ee t a l ，1 9 9 8 ) ，且e t r l 是组氨酸激酶的概念已被广泛接受。但进一步的研究发现， 受体在感受乙烯时并不需要e t r l 的组氨酸激酶活性( w a n g e ta l ，2 0 0 3 ) 。 在这五个乙烯受体中e t r l 和e r s i 的序列具有很高的同源性。而另外三个 乙烯受体e t r 2 、e r s 2 帚e t n 4 的序列之间高度同源。于是，人们将乙烯的五个受 体基因根据彼此之间的的序列同源性及蛋白质之问的相似性分为两大亚类：第一 亚家族乙烯受体和第二亚家族乙烯受体( f i g u r e l b ) 。 第一亚家族乙烯受体包括e t r l 和e r s l ，而e t r 2 、e r s 2 和e i n 4 则属于第 二亚家族乙烯受体( h u ae ta l ，1 9 9 7 ；h u a e ta l 。1 9 9 8 ) 。亚家族内部的受体之间彼 此分享很高的氨基酸相似性，而两个亚家族之间受体的氨基酸序列之间的相似性 却没有如此之高。如第一亚家族乙烯受体之间的氮基酸序列的相似性可以达到 7 9 - 第二亚家族乙烯受体之间也可以达到6 8 ，7 4 ，但两个亚家族之间的氨基酸 序列的相似性只有5 7 - 6 5 ( h u ae ta l ，1 9 9 8 ) 。另外同亚家族之间的受体还 有其保守的特征，这一点是两大亚类之间差异最大的部分( h u ae ta 】，】9 9 8 ) 。 笙：望丝塑堑! 苎塑墨竺竺堡旦皇圭! 巡竺旦一 细菌的双组分系统含有两个保守基元，通常称为传感蛋白( s e n s o r ) 和反应调 节器( r e s p o r i s er e g u l a t o r ) ，这两个组分配对起作用，控制细菌对专一信号的反应， 传感蛋白定位在细胞膜上，由一个细胞外输入端和一个细胞质组氨酸激酶结构域 组成。反应调节器只有两个结构域：一个接受器结构域( r c c i e v e r d o m a i n ) 和一 个输出结构域( o u t p u t d o m a i n ) 。当传感蛋白的n - 末端输入域接收到环境刺激信 号时，能使保守的氨基酸残基发生自身磷酸化作用，然后这个磷酸基团从组氨酸 转移到反应调节器的接受器结构域上的天冬氨酸残基，接受器的磷酸化状态控制 输出结构域，后者又介导下游步骤。很多细菌的输出结构域都是转录调节物。 第一亚家族乙烯受体含有三个疏水的跨膜区，第二亚家族乙烯受体含有四个。 第二亚家族乙烯受体缺少一至几个被认为是对组氨酸激酶的催化活性必需的保守 氨基酸残基。这些在细菌组氨酸激酶结构域非常保守的五个残基为h ，n ，g 1 ，f 和g 2 ( p a r k i n s o na n d k o f o i d ，1 9 9 2 ) ，在e t r l 和e r s l 中同样保守，而且自身磷 酸化发生的位点( h 一3 5 3 ) 也在同样的位置。但是经典的组氨酸激酶结构域在第二 型乙烯受体中却出现了变异。e t r 2 和e r s 21 - _ 不含有原本十分保守的自身磷酸化 发生的位点( h 一3 5 3 ) ，在第二亚家族乙烯受体基因序列中也找不到g 1 特征性基元 基因的同源序列。g 2 基元存在于e t r 2 ，但在e r s 2 和e i n 4 中却没有明显的结构 域。至于f 基元则在所有第二亚家族乙烯受体中都丢失了( h u a e ta l ，1 9 9 8 ) 。 除了两个亚家族之间受体结构上的不同外，与e t r l 、e t r 2 和e i n 4 三个受 体不同的是e r s l 和e r s 2 不含c 束端的接受器结构域。据推测，e r s l 和e r s 2 可能是利用另外三个受体e t r i 、e t r 2 和e i n 4 的接受器或是剐的反应调节器( h u a e ta l ，1 9 9 5 ；h u ae ta l ，1 9 9 8 ) 。酵母双杂交实验显示e t r l 与c t r l ( 个m a p k k k 激酶) 可以相互作用，而e r s i 与c t r i 的作用相对于e t r l 来讲就显得比较微弱 ( c l a r ke t a l ，1 9 9 8 ；c h a n ge ta l ，1 9 9 9 ) 。到底c 末端的接受器结构域在与c t r l 的作用中超着什么样的作用，还需要进一步的研究。 笙二皇垫塑堑! 圣丝墨竺竺堡塑兰圣丝笪兰生! 一 1 2乙烯受体的作用机制： 曾认为乙烯受体会像细菌的双组分系统那样作用，因为它们在蛋白质结构上 是如此相象，而且已经证明e t r l 具有组氨酸激酶活性( g a m b l ee ta l ，1 9 9 8 ；) 。 除了其组氨酸激酶活性之外，e t r l 还被发现可以通过定位在膜上的两个分予内的 二硫键形成二聚体来起作用( s c h a l l e r e ta l ，1 9 9 5 ) 。当e t r l 刚被克隆出来的时候， 曾错误地认为只要受体结合了乙烯就会激活组氨酸激酶活性，进而发生m a p k k k 的级联反应，从而开启乙烯反应。进一步的研究发现，e t r l 可以和c t r l ，一个 定位在内质网上的类似r a f 蛋白( c h e ne ta l ，2 0 0 2 ：g a oe ta l ，2 0 0 3 ) 作用，从而 引发m a p k k k 的级联反应。但是最近的研究发现，去掉了组氨酸激酶结构域的 e t r i 突变体仍旧具有功能( w a n g e ta l ，2 0 0 3 ) 。这预示着e t r i 很有可能是与其 它有功能的受体相互作用来行使其功能( w a n g e ta l ，2 0 0 3 ) 。 对于乙烯受体是如何作用的，现在仍知之甚少。最初通过遗传筛选得到的乙 烯受体突变体都是显性的获得功能( g a i n o f - f u n c t i o n ) 型的突变，并不能代表受体 本身的基因功能。于是也就不能利用遗传分析来分析受体与c t r l 基因的上位关 系，因为只有丧失功能型( 1 0 s s o f - f u n c t i o n ) 突变基因本身的表型才可以用来判断 基因之间的上位性关系。丧失功能( 1 0 s s o f - f u n c t i o n ) 型的乙烯突变体也在筛选显 性突变基因的“基因内突变”后而相继找到( h u aa n d m e y e r o w i t z 。1 9 9 8 ：w a n g e t a l ，2 0 0 3 ) 。 受体基因的l o s s - o f - f u n c t i o n 单突变体没有什么明显的表型，但双突变体在没有 乙烯的情况下却表现出轻微的组成型的乙烯反应。三突变体在没有乙烯的情况下， 则显现出很强的组成型的乙烯反应，类似c t r l ，突变体的表型。四突变体e t r l ；e t r 27 e r s 2 ；e i n 4 则表现出比c t r l - ，突变体更严重的表型，并且是不育的，只能通过杂合 簦二兰塑堕茎主圣塑墨竺塑堡旦皇圣壁堕! 堡! 子来保存( h u aa n dm e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ) 。至于五突变体直到现在都没有获得。这 些受体基因丧失功能( 1 0 s s o f - f u n c t i o n ) 型突变体，暗示c t r i 基因受受体基因的 正调节。上位性分析显示第二亚家族乙烯受体需要第一亚家族乙烯受体的帮助来 完成自身的功能，两类乙烯受体之间的作用很可能发生在g a f 结构域( w e na n d c h a n g ，2 0 0 1 ) ，这一点与观察到的第一亚家族乙烯受体双突变体e t r l ? e r s l 表现 出严重的组成型乙烯反应表型是一致的( w a n g e ta l ，2 0 0 3 ) 。所有这些都显示，乙 烯受体是乙烯反应的负调控子，有自己独特的作用。但是乙烯受体作用的生化和 分子机制仍不清楚。 2 乙烯信号传导： 2 1 乙烯信号传导的相关基因： 遗传筛选使人们得到了乙烯信号传导途径中的相关基因。除了乙烯的五个受 体基因之外，还有c t r l ，e 1 n 2 及e i n 3 。通过遗传分析已经成功确立了这些作用 基因在乙烯信号传导途径中的位置。其中c t r l 是乙烯的五个受体基因上位性基 因，e i n 2 和e i n 3 则是c t r l 的上位性基因。 c t r l 编码的蛋白质类似于哺乳动物及果蝇中的r a f 蛋白激酶家族的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶( k i e b e r e t a l ，1 9 9 3 ) 。在激酶的结构域中，c t r l 和r a f 的氨基酸 序列同源性达到4 1 ，它含有所有已知的蛋白激酶所共有的1 1 个亚基结构域 ( s u b d o m a i n s ) ，其n - 端含有r a f 蛋白的保守半胱氨酸基元和富含丝氨酸苏氨酸的 序列。 在动物里，r a f 蛋白是分裂原激活的蛋白激酶激酶激酶 ( m i t o g e n 。a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e ，m a p k k k ) ，它通过使m a p k k 磷酸 化调节细胞的生长和分化，m a p k k 又使m a p k 磷酸化。在各种多细胞真核和酵 笙二里型堕茎! 圣堕墨箜堕堡望兰圣塑堕兰堕兰一 母细胞里，m a p k k 激酶、m a p k 激酶、m a p 激酶参与各种发育或胁迫信号转导 的磷酸化级联反应( p h o s p h o r y l a t i o n c a s c a d e ) ( p o s a se ta l ，1 9 9 6 ) 。不同的r a f 蛋白均有三个高度保守的区域c r l 3 。c r i 由r a f 蛋白结合位点和富含c y s 的锌 指结构组成：c r 2 包含的氨基酸残基中，丝氨酸和苏氨酸占了很大比例；位于r a f 蛋白c 一端的c r 3 是激酶的催化区。c t r l 的c 一端与c r 3 区高度同源。但c t r i 缺乏c r 2 区域中的锌指结构和结合位点。c t r l 的氨基酸序列表明，其结构类似 于m a p k k k 。因此，推测植物体内的乙烯信号传导可能涉及类似的磷酸化级联反 应。 c t r i 功能丧失( 1 0 s s o f - f u n c t i o n ) 型突变导致组成型的乙烯反应，可推断出 c t r l 激酶在乙烯信号传导途径上充当一个负调节物。c t r l 由一个调节子和激酶 结构域组成。在哺乳动物中，当调节子和激酶结构域相连的时候，m a p k k k s 处 于失活状态，只有当调节子和激酶结构域分开时，m a p k k k s 的磷酸化级联反应 爿启动。在拟南芥中已经证明，e t r l 和e r s l 的激酶结构域可以和c t r l 的调节 子相结合，从而释放c t r l 激酶结构域，来激活m a p k k k s 的磷酸化级联反应( c l a r k e ta l ，1 9 9 8 ；c h a n ge ta l ，1 9 9 9 ；g a oe ta l ，2 0 0 3 ) 。但是，直到今天，虽然在m e d i c a g o 的m a p k k 过渡表达能够造成拟南芥产生组成型乙烯反应，但是在拟南芥中介于 受体和c t r l 激酶之间的中间因子还没有找到，也没有相关突变体或基因克隆的 报道。 e 1 n 2 和e 1 n 3 的突变都会导致对乙烯的不敏感，可推断出e i n 2 和e i n 3 在乙 烯反应中起正调节作用。遗传上位性分析显示，e i n 2 和p m ，的突变体的表型可以 掩盖c t r l 突变体的表型，说明e i n 2 和e i n 3 是c t r l 的上位性基因。 e i n 2 ( a l o n s o e t a l ，1 9 9 9 ) 编码的蛋白与n - r o m p 蛋白具有同源性，后者则涉 及到许多有机体的金属离子的转运。e i n 2 5 突变造成改编码蛋白在n 段跨膜域产 生一个终止子，可能相当于一个无效突变。在e i n 2 5 突变体的遗传背景下过度表 笙= 里丝壹堑! 圣堕墨堡塑堡里兰圣丝笪墨堕兰一 达e i n 2 的c - 末端结构域可以导致类似于c z r l 突变体那样的组成型乙烯反应，而 且可以恢复茉莉酸的反应，说明e i n 2 的c - 末端结构域负责乙烯的调节( a l o n s o e t a 1 ，1 9 9 9 ) 。 在g n 3 一j 突变体的遗传背景下表达e i n 2 的c 一末端结构域可以导致类似于 8 i n 3 j ；e r r l 双突变体的表型，说明e i n 3 是e i n 2 的上位性基因。相应地，在e i n 2 一j 突变体的遗传背景下过度表达e i n 3 就会导致组成性乙烯反应( a l o n s o e la l ，1 9 9 9 ) 。 值得注意的是，过度表达e i n 2 的c - 末端结构域导致的组成性乙烯反应只出现于幼 苗中，植株成苗期的生长和发育是正常的，这预示着e i n 2 的c - 末端结构域还有未 知的功能。 e i n 3 编码个含6 2 8 个氨基酸的定位在细胞核上的蛋白质，含有酸性氨基酸、 富含谷氨酸、脯氨酸结构域( c h a o e ta l ，1 9 9 5 ) ，这些结构域在转录激活因子的结 构域中已经发现。现己证明e i n 3 编码的蛋白是一个转录调节因子。 e 1 n 3 ，e i l l ( e i n 3 一l i k e d 和e i l 2 ( e i n 3 一l i k e 一矽在功能上有冗余性，过度表达e 儿j 和脱2 可以补偿e i n 3 一j 的缺失突变( c h a o e la l ，1 9 9 5 ) 。d n a 的结合试验帮助人 们筛选到了e i n 3 蛋白的作用目标，即e r f l ( e t h y l e n e r e s p o n s e f a c t o r ) ，它属于一 个大的植物特异性转录因子的大家族一e r e b p ，t h e e t h y l e n e - r e s p o n s e - e l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n ( s o l a n o e ta l ，1 9 9 8 ) 。e r e b p s 最初被确 定为顺式作用d n a 结合蛋白，可以结合g c c 框。g c c 框是在几个病原体相关的 基因( 它们中的许多与乙烯反应相关) 启动子中找到的反式因子。 e i n 3 蛋白首先以同型二聚体的形式结合于e r f l 上游的一个特异性序列，这 个序列先前是作为植物中的乙烯反应因子被发现和确定下来的f s o 】a n oe ta l ，1 9 9 8 ) 。 e r f j 作为乙烯的首要作用目标被诱导。一旦被诱导，e r f 就结合g c c 框来调节 下游的乙烯反应( f i g u r e 2 ) 。在e i n 3 突变体的遗传背景下过度表达朋州可以激活 一系列的乙烯反应，表明e r f i 可能作用于e i n 3 下游乙烯反应的一个分支。 苎：兰塾查茎! 圣堡墨箜堕堡旦量至堕! 竺! 一 在拟南芥中发现的大量的e r e b p s 中，只有一小部分是受乙烯调节的( t h a r a c t a 1 ，1 9 9 9 ：y a m 娜o t oe ta l ，1 9 9 9 ) ，且并非所有和乙烯反应有关的e r e b p s 都是编 码转录激活因子，其中有些是编码转录抑制因子的( f u j i m o t o ，2 0 0 0 ) 。虽然需要 g c c 框和乙烯结合因子来调节乙烯反应，但是一些与乙烯反应相关的基因的启动 子中却既没有乙烯结合因子也没有g c c 框，这暗示着在乙烯信号传导中还有其它 的一些调节因子。 除了上述提到的，最近通过酵母双杂交又发现了两类和e i n 3 作用的因子( g u o a n d e c k e r ，2 0 0 3 ：p o t u s c h a ke ta l ，2 0 0 3 ) 。这两类因子在酵母双杂交中可以和e i n 3 发生作用，被命名为e b f l ( e i n 3 - b i n d i n g - f a c t o r l ) 和e b f 2 ( e i n 3 b i n d i n g - f a c t o r 2 ) 。e b f l 和e b f 2 都编码一个含有f 框的蛋白质，后者与 各种生物中的蛋白质降解有关( r u e g g e r e ta l ，1 9 9 8 ：h e l l m a n na n de s t e l l e ，2 0 0 2 ) 。 e b f i 和e b f 2 突变可以导致对乙烯处理的高度反应，同时提高了e i n 3 蛋白积累 ( g u oa n d e c k e r ，2 0 0 3 ：p o t u s c h a kc ta l ，2 0 0 3 ) ：这进一步支持了它们在调节e i n 3 蛋白质降解中的作用。因为e i n 3 蛋白在乙烯反应中是作为转录激活因子来起作用 的，所以人们可以推测在外界没有乙烯的情况下，e b f l 和e b f 2 参与了e i n 3 蛋 白质的降解，而e i n 3 蛋白质的降解是可以被乙烯抑制的，所以在外施乙烯的情况 下，e i n 3 蛋白质的降解被乙烯抑制，从而导致了e i n 3 蛋白积累，最终激活下游 乙烯反应基因。 2 2 乙烯信号传导途径中具有争议的组分： 遗传分析，五个乙烯受体，c t r l ，e i n 2 ，e i n 3 ，及e r f l 的发现揭示了拟南 芥中调控乙烯反应的一条线性的通路( f i g u r e2 ) 。通过遗传筛选，人们还得到了其 它一些可以改变三重反应的突变体，它们在乙烯信号传导途径中的作用还需要进 兰：里型塞茎!圣塑星堡竺堡旦皇圣堕垡!堡旦一 一步的研究。 r a n l 基因的发现暗示乙烯受体发生作用需要铜离子，c u ( i ) ( h i r a y a m a e ta l ， 1 9 9 9 ) 。m n 突变体可以对顺势一环辛烯( 一种可以在野生型植株中抑制乙烯作用 的复合物) 发生反应而出现三重反应的表型( s i s l e r e ta l ，1 9 9 0 ；h i r a y a m ae ta l ， 1 9 9 9 ) 。r a n i 编码的蛋白，与导致人类m e n k e sa n d w i l s o n 病的蛋白( b u l l e ta l ， 1 9 9 3 ：c h e l l y a n dm o n a c o1 9 9 3 ；c h e l l ye ta l ，1 9 9 3 ；m e r c e re ta l ，1 9 9 3 ；t a n z ie ta l ， 1 9 9 3 ：v u l p e e ta l ，1 9 9 3 ；y a m a g u c h ie t a l ，1 9 9 3 ) 及酵母的c c c 2 p ( f ue t a l ，1 9 9 5 ) 很相似。这些蛋白属于p 型阳离子运输a t p 酶，与铜离子运输有关。c c c 2 是一 个铜离子转运蛋白，在酵母细胞中定位在后高尔基体的残基上，并在铜离子协同 因子转运到酵母膜蛋白的过程中起作用。相应地，r a n l 可能是帮助形成有功能的 乙烯受体( w o s e s t ea n dk e i b e r ，2 0 0 0 ) 。上位性分析显示，r a n l 在乙烯受体基因家 族上游作用。乙烯不敏感突变体e i n 2 和e i n 3 不能抑制r a n l 3 突变体的致死表型， 说明r a n l 一3 突变在不依赖乙烯的通路上起作用，调节细胞的扩大。而这些结果也 表明，铜离子不仅在结合乙烯上是必需的，在信号传导中形成有功能的乙烯受体 方面同样需要铜离子( h i r a y a m a e t a l ，1 9 9 9 ) 。 人们通常用传统的遗传筛选的方法，即基于乙烯的三重反应来筛选突变体， 但现在看来用这种筛选方法来筛选突变体已经达到饱和，筛到的新的突变体多是 原来筛选到的突变体的等位基因突变。所以现在需要一种新的筛选方法来筛选乙 烯信号传导途径中新的突变体。于是筛选到了在乙烯处理中表现出对乙烯微弱的 不敏感的五个w e i 突变体( w e a k e t h y l e n ei n s r n s i t i v e ：a l o n s oe ta l ，2 0 0 3 ) 。在这五 个w e i 突变体中，已经克隆到了w e i l ，w e i 4 和w e i 5 三个基因，而且被证明分别 是t 1 r 1 ，e r s l 和e 乜j 的等位基因。w e i 2 和w e i 3 很可能是在乙烯信号传导途径中 未发现的新的突变体。t 1 r 1 已经被克隆，被确定是通过蛋白质降解机制在生长素 传导途径中起作用，蛋白体以及由w e i 产生的对乙烯微弱的不敏感很可能是乙烯和 翌= 里丝堕茎! ：苎竺星堡盟堡旦兰兰堕兰堕量一 生长索共同作用的结果。w e i 4 ，e r s l 的等位基因，是第一个发现的突变在细胞质中 而导致对乙烯不敏感的突变体。w e i 5 ，肌的等位基因，e i n 3 的同族体，已经证 明当其被过度表达时可以补偿e i n 3 功能丧失的突变。w e i 5 ；e i n 3 双突变体可以完 全抑制由c t r l ，带来的组成型的对乙烯不敏感。w e i 5 基因的发现和确定，进一步 证明了胧j 在乙烯信号传导途径中的作用。 除了发现的对乙烯微弱的不敏感的五个w e i 突变体外，m a p k s 在拟南芥和苜 蓿中表现出来的调节乙烯信号传导的作用，暗示着m a p k k k 通路的作用( f a t m ac t a l ，2 0 0 3 ) 。在没有a c c 的情况下过度表达苜蓿中的s i m k k ，可以导致拟南芥三重 反应的表型。当加入乙烯生合成前体a c c 后，在e i n 2 和e i n 3 的遗传背景下a c c 可以诱导m a p k 的活性，但在e t r l 。，的遗传背景下m a p k 的活性则不被诱导，说 明s i m k k 及其下游的m a p k s 可能在e 1 n 2 和e i n 3 的上游并被一个m a p k k k 负调节在拟南芥中这个负调节子是c t r i 。 2 3 拟南芥中乙烯信号传导途径的建立； 基于乙烯的三重反应的遗传筛选方法筛选到了对乙烯不敏感的突变体e t r l 一， e i n 2 一和e i n 3 一及对乙烯组成型反应的突变体c t r l ( r o m a ne ta l ，1 9 9 5 ) 。进一步 的筛选工作又筛选到了对乙烯不敏感的受体突变体基因e t r 2 ，e i n 4 ，和e r s 2 一， ( s a k a ie ta l ，1 9 9 8 ：h u ae ta 1 1 9 9 8 ) 。 e r s 2 一j 和e r s l j 是人工突变体是在野生型的拟南芥中转入了人工突变的基 因，从而导致了对乙烯的不敏感。上述乙烯受体的突变体都是显性的对乙烯不敏 感的。c l r t 突变体可以掩盖由乙烯受体突变体带来的对乙烯不敏感的表型，所以 c t r l 是乙烯受体基因的上位性基因( k i e b e re ta l ，1 9 9 3 ) 。e i n 2 和e i n 3 通过遗传 分析证明是c t r l 的上位性基因。e i n 2 ，和e i n 3 ，突变体的表型是一致的，上位性 0 笙皇型塑堑! 垒塑星竺塑堡旦兰垒堕笪兰堡望 分析无法确定这两个基因的上下游关系。上位性分析只能分析两个突变基因之间 的关系，而不能定位两个基因的上下游关系，特别是当一个突变基因是另一个修 饰基因的抑制子或激活子时。所以在未发现功能丧失突变体( 1 0 s s o f - f u n c t i o n m u t a n t s ) 之前，是无法确定乙烯受体基因是如何通过c t r i 基因作用的。 丧失功能( 1 0 s s o f - f u n c t i o n ) 型的乙烯突变体经由基因内突变筛选而被相继找 到( h u aa n dm e y e r o w i t z ，1 9 9 8 ；w a n ge ta l ，2 0 0 3 ) 。受体基因的单突变体没有什 么明显的表型，但双突变体在没有乙烯的情况下却表现出轻微的组成型的乙烯反 应表型。三突变体在没有乙烯的情况下，则显现出很强的组成型的乙烯反应，类 似与c t r l 突变体的表型。四突变体e t r l ie t r 2 ，e r s 2 ；e i n 4 则表现出比c t r l ，突 变体更严重的表型。所有的这些都显示，乙烯受体是乙烯反应的负调控子，有自 己独特的作用。 c t r l 功能丧失( 1 0 s s o f - f u n c t i o n ) 导致组成型的乙烯反应，可推断出c t r l 激酶在乙烯信号传导途径上充当一个负调节物。 e i n 2 和e i n 3 的突变都会导致对乙烯的不敏感，可推断出e i n 2 和e i n 3 在乙 烯反应中起正调节作用。 乙烯信号传导途径中一些其他组分r a n l ，e b f l 和e b f 2 及其相关的突变体 也相继被发现。通过对这些突变体的研究，建立起一个乙烯信号传导途径的遗传 模型( f i g u r e 2 ) 。 结合乙烯导致受体基因失活，c t r l 没有受体基因的诱导也将处于失活状态， 受c t r i 负调控的m a p k k 途径得以活化并开启e i n 2 和e 1 n 3 ，从而启动乙烯反应。 e i n 3 蛋白首先以同型二聚体的形式结合于e r f l 上游的个特异性序列，诱导 e r f l 表达。一旦被诱导表达，e r f 就结合g c c 框来调节下游的乙烯反应。 在没有乙烯或乙烯结合的抑制子存在的情况下，乙烯的受体基因因为不能结 合乙烯而处于活化状态，c t r l 随之被激活，m a p k k k 途径被抑制。e i n 2 处于失 1 1 豫一章拟南芥中乙烯受体的作用与乙烯信号传导 活状态，乙烯反应的相关基因的转录开关被关闭，e i n 3 蛋白则通过e b f l 和e b f 2 介导的途径被降解。 根据遗传突变体的表型和基因功能推测认为铜离子，c u o ) ，不但和受体结合 乙烯有关，并且是形成有功能的乙烯受体的金属辅助因子，所以r a n i 突变体由于 无法形成有功能的乙烯受体而表现出很严重的c t r l j 的表型。对于这些信号传递 元件的细胞内作用位置的了解显示：五个乙烯受体可能位于膜上，e t r l 已经定位 于内质网膜，而e i n 2 位于膜上，但是目前并不了解e i n 2 在哪一种膜上。e i n 3 和 e r f i 则在细胞核内m a p k k k 途径的作用成分很可能在细胞质中，这也是哺乳 动物m a p k k k 作用的地方。 2 墨二兰塑堕芟! 圣壁墨苎塑堡旦兰圣苎垡兰堡昱 f i g u r el a f i g u r e2 1 3 f i g u r el b e r s 2e t r 2 曰 0 1 e r s l p r o t e i nd e g r a d a t i o n 兰三皇 圭壁至墼壁星竺窒壅型! 竺! ! 型堕塑塑望l 一 第二章乙烯不敏感显性突变基因e r s 2 一的作用机理 摘要 拟南芥乙烯受体基因e r s 2 一是一个第二亚家族受体显性基因突变。先前的研 究认为第一亚家族受体基因在乙烯信号传递上具有特殊功 ；g ( w a n g e la l 。，2 0 0 3 ) ，但 是对第二亚家族基因的作用方式并不清楚。我们利用显性性状的特性，对乙烯受 体第二亚家族基因作进一步的功能分析，从而了解第二亚家族如何在乙烯信号传 递途径上作用。由于乙烯受体基因具备功能冗余性，单一或少数的受体基因功能 丢失无法造成明显的表型。利用遗传杂交，可获得多种受体缺失型突变体，从我 们得到的突变体组合分析，我们发现拟南芥第二亚家族受体基因e r s 2 必须通过 其它野生型受体基