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硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 摘要 激光共焦扫描显微镜作为一种具有高纵深分辨率的现代显微成像设备，在基因工 程、生物医学、生命科学、材料科学等众多领域具有重要的应用价值。那么本课题就是 要开发一种能够实现高速采集图像数据、扫描效果更好、能够提高扫描图像分辨率的激 光扫描系统。本文的主要研究内容包括以下三个方面： 首先本文对激光共聚焦扫描成像系统的光学原理及成像的重要特点进行了讨论，分 析了系统的扫描成像控制技术。本课题采用的为光学扫描。 其次本文系统的介绍了共聚焦高速扫描的硬件系统构成，即采用单片机a t 8 9 s 5 2 为 核心，由快速振镜模块、慢速振镜模块、电源转换模块、信号转换模块、d a 转换模块、 探测器模块、a d 数据采集模块、串口通讯模块等搭建的硬件平台。 最后在对硬件系统有了充分的理解和掌握的情况下，再结合扫描硬件电路的运转特 点，对软件编程进行合理安排和设计，以完成扫描的全部过程与需要。 在解决以上问题的基础上，结合实验构建了一个共聚焦高速扫描与成像系统。 关键词：激光共聚焦扫描显微镜快速振镜a t 8 9 s 5 2 单片机图像处理 a b s t r a c t l a s e rc o n f o c a l s c a n n i n gm i c r o s c o p y ( l c s m ) i sam i c r o s c o p i ci n s t r u m e n tw h i c h p r o v i d e sh i g hd e p t hr e s o l u t i o n i tp l a y s 锄i m p o r t a n tr o l ei ng e n ee n g i n e e r i n g ，b i o m e d i c i n e ， l i f es c i e n c e ，m a t e r i a ls c i e n c ea n ds oo n w ew i l ld e v e l o pal a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gs y s t e m w h i c hw i t hh i g h s p e e di m a g ed a t aa c q u i s i t i o n , b e t t e rs c a n n i n g ，a n dc a ni m p r o v et h es c a n n e d i m a g er e s o l u t i o n t h ec o n t e n to ft h i sd i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h ef o l l o w i n gt h r e ep a r t s ： f i r s t l y , d i s c u s s e dt h eo p t i c a li m a g i n gp r i n c i p l eo fl a s e rc o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p i c i m a g i n gs y s t e m a n a l y z e dt h ec o n t r o l l i n gt e c h n i q u eo fs c a n n i n gi m a g i n g w eu s e do p t i c s s c a n n i n g s e c o n d l y , i n t r o d u c e dt h eh a r d w a r eo ft h eh i g h s p e e dc o n f o c a ls c a n n i n g s y s t e m a t 8 9 c 5 2 s i n g l e c h i pm i c r o c o m p u t e ra st h ec o r e ，i n c l u d i n gc o u n t e rr o t a t i n gs c a n n e rm o d u l e s ， s l o w - s c a ng a l v a n o m e t e rm i r r o rm o d u l e s ，p o w e rc o n v e r s i o nm o d u l e s ，t h es i g n a lc o n v e r s i o n m o d u l e ，d ac o n v e r t e rm o d u l e ，d e t e c t o rm o d u l e ，a dd a t a a c q u i s i t i o nm o d u l e s e r i a l c o m m u n i c a t i o nm o d u l ea n ds oo n l a s t l y , w i t ht h es t u d yo ft h eh a r d w a r es y s t e m ，c o m b i n e dw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e o p e r a t i o no fh a r d w a r e ，t h ep r o g r a m m i n ga n dd e s i g no fs o f t w a r ec a nc o m p l e t et h ee n t i r e p r o c e s so fs c a n n i n ga n dm e e tt h en e e d so fs y s t e m o nt h eb a s i so ft h ea b o v ep r o b l e m s o l v i n ga n dc o m b i n e dw i t he x p e r i m e n tw ea c h i e v ea k g h s p e e dc o n f o c a ls c a n n i n gs y s t e m k e yw o r d ：c o n f o c a ls c a n n i n gm i c r o s c o p y , c o u n t e rr o t a t i n gs c a n n e r , a t 8 9 c 5 2s i n g l e c h i p m i c r o c o m p u t e r , i m a g ea n a l y s i s i i 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名： 硼年夕月( j - 日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名： 吲年7 盯日 硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 1 绪论 1 1 引言 人类主要依靠眼睛去认识和了解客观世界，但是人眼在观察事物的时候空间的极限 分辨率约是3 1 0 。4 m ，也就是说人类对于宏观世界以外的微观世界是无法直接用眼睛来 观测的，必须借助显微成像技术。显微成像技术可以将人类想要观测的微观过程及结构 进行放大成像，这样可以使人类方便的直观的观察和了解微观世界。很多的学科和领域 均需要对微观世界进行研究，例如现在发展迅猛的材料科学、生物医学、核物理、微电 子学等等。 公元前一世纪开始人们就开始通过球形的透明物体来观察微小的物体，1 6 6 5 年前 后，英国的胡克在显微镜中加入了粗动和微动调焦的机构、照明系统以及承载标本的工 作台，从而发明了第一台光学显微镜，自此以后，人类通过光学显微镜对微观世界进行 观测，从而加以了解与研究。光学显微成像技术是人类观测微观世界一种常用且有力的 工具，其最大的优点就是对所观测的样本无破坏性，而且这个有点对于很多科学领域是 十分重要的，例如生物医学、材料科学等等。当然普通的光学显微镜也存在着两大致命 的缺点：( 1 ) 光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制，因此一般光学显微镜的分辨率 与照明波长相同的数量级；( 2 ) 它的焦深有限，一般我们观测时使用的是场光源，而且 观测所得的是一个宽视野图像，从而降低了信噪比，使图像的清晰度和分辨率均受到了 影响。为了弥补普通光学显微镜存在的缺陷，在近几十年中，人们采用了一些其他的手 段，例如在生物医学的研究中，人们广泛利用电镜的高分辨率和高清晰度来观察细胞、 亚细胞的结构乜3 ；同时，近年来分子生物学的出现与发展，非视觉性化学分割法显示了 其重要的应用价值。例如生命科学家不能够在显微镜下通过直接观测来确定细胞的组分 及生物分子的功能，而是需要依赖生化及遗传学技术，但在进行电镜分析时，必须对观 测样本进行干燥、固定等处理，这样也就造成了通过电镜无法观测到活的细胞以及细胞 的生物现象；而生化分析中常常需要对观测的细胞、组织的提取物进行生物大分子研究， 但在提取的各项工序中，往往会对生物分子与细胞间的时空关系造成破坏；因此电镜和 分子生物学本身同样存在着缺陷，这给人们对微观世界的研究带来了困境，所以人们希 望有一种新的显微分析手段的出现，来解决现阶段所面临的困境。 随着科学技术的发展，人们不再仅限于观测到事物的二维图像，在越来越多的应用 领域，如医疗、生命科学、生物、材料科学、遗传基因学、半导体工业等，都需要对微 小物体的三维机构加以了解和研究，如生物细胞、集成电路等。这就要求不仅要得到具 有高分辨率的无前后表面叠加的断层图像，还要能够获得清晰的三维图像。而普通显微 镜所成的像是物面前后一定厚度内的所有断层图像的叠加，显然不能达到上述要求。而 1 l 绪论硕士论文 作为现代光电技术相结合的新型成像系统的激光共焦扫描显微镜，它不仅可以排除离焦 光线造成的图像模糊，从而能够在像面上获得高倍放大率、高对比度的图像，还因其具 有亚微米级轴向分辨能力，能够实现图像的层析，所以可以在一系列不同高度上建立高 分辨率的光学断层图像，还可以通过计算机图像处理技术的使用，从而实现细微结构的 三维成像。因此激光共焦扫描显微镜是研究事物细微结构的有效技术手段，自m i n s k y 在二十世纪五十年代提出后，其受到国内外学术界和科技界工作者的广泛关注和深入研 究。激光共焦扫描显微镜在生物医学、分子细胞生物学、遗传学、材料科学、精密机械、 核物理形态学、微电子学、分子及原子物理、神经学、药理学、遗传学等领域都有着广 泛的应用。 1 2 激光共焦扫描显微术的发展 激光共焦扫描显微技术是通过近几十年的不断改进慢慢发展起来的。m i n s k y 在1 9 5 7 年首次提出了共焦显微术的概念，因为当时普通光学显微镜因为采用的是场光源会在观 测样品时产生多种散光，m i n s k y 为了消除散光现象，他提出了一个利用点光源的新成 像系统的模型，在这样的一个新成像模型里由于采用了点光源来照明样品，然后用很小 的探测器进行采集，但是这样又造成了观测区域较小的缺点，而后通过对样品进行移动 还克服该缺点，这样就可以记录样品不同部分的信息。虽然m i n s k y 提出了该成像模型， 但是由于当时没有非常适合的光源，所以观测所产生的图像质量并不好，故没有引起人 们对于共焦显微镜太多的关注。而后在1 9 6 7 年，e g g e r 和p a t r a n 利用n i p k o w 盘为核 心的共焦显微镜第一次成功的产生了一个光学横断面，但是由于n i p k o w 盘在设计中仍 然存在着技术并不完善的干扰，所以该共焦显微镜也没有获得太大的成功。在1 9 7 7 年， 牛津集团的c j r s h e p p a r d 和t w i l s o n 进一步完善了共焦的原理部分，他们首次描述 了光与被照明物体的原子之间的非线性关系以及激光扫描器的拉曼光谱学。接着在1 9 7 8 年，g j b r a n k e n h o f f 发明了一种有较高数值孑l 径的透镜。1 9 7 9 年，k o e s t e r 成功设计 了一种新型的共焦扫描装置。而后1 9 8 5 年，w i j n a e d t sv a nr e s a i n t 第一次成功的演 示了用荧光探针标记的生物样本的光学横断面，这就标志着共焦显微镜所有的关键技术 均已经成熟口1 。 直到8 0 年代末，共焦显微镜才开始引起了人们的高度重视，美国、日本、德国和 英国等国家开始投入大量的人力和财力对共焦显微镜进行研究，经过十几年的不懈努 力，在理论和实践上都获得了一定的成就。在理论上，较全面的研究共焦显微成像系统 的各种特点，并根据其特点提出了许多提高成像分辨率和改进成像质量的方法；在实践 方面，根据共焦显微技术而研制的具有高性能的激光共焦扫描显微镜已经陆续投入市 场。 激光共焦扫描显微镜经过了四十多年的发展，不仅在系统结构上而且在扫描成像上 2 硕士论文 共聚焦高速扫描与成像系统研究 都取得了较大的进展，其系统分辨率及成像质量都得到了较大程度的提高h 嘲。当然， 随着新兴技术的不断发展，陆续出现了其他各种新型的共焦扫描显微技术，它们分别是： 1 、光纤共焦扫描显微成像技术 用单模光纤将激光器发出的光传输到共焦显微系统，此设计不需将激光器放在显微 镜的输入端，从而有效的避免了激光器制冷系统产生的振动。将共焦显微系统中的收集 信号的针孔也用单模光纤替代，而分束器用光纤耦合器替代构成了一个紧凑和灵活的光 纤共焦显微镜。类似于大型光学元件系统，可以通过光束扫描、机械式物体扫描或透镜 扫描将上述的描述系统用于显微成像，光纤系统的最大的优点是可以通过机械的移动光 纤来实现扫描，因为光纤很轻，故可以在横向和轴向上进行快速的扫描。 2 、4 共焦扫描显微成像技术 4 丌共焦扫描显微镜是在共焦扫描显微镜的基础上再增加一个物镜，并使两个相对 放置4 而构成的。4 共焦显微术是通过提高物镜数值孔径来进一步提高显微镜的分 辨率，但在4 丌共焦显微术中存在的最大技术障碍是难以将两个物镜的焦点完全调整到 重合，所以该共焦显微术仍需要进一步的改进。 3 、多光子激发荧光扫描显微技术 多光子激发是指荧光团同时吸收n 个光子，引起能级跃迁，从而激发出波长短于照 明光波长的荧光光子。多光子激发荧光扫描显微技术具有以下优点：1 ) 不需要采用针 孔也可获得高信噪比的图像；2 ) 可以在较长波长照明光的照明下激发紫外波段的荧光 成像；3 ) 引起更小的光漂白和光毒性；4 ) 在生物样品中成像深度更深。因为多光子激 发荧光扫描技术具有上述优点，所以被公认为是目前细胞、亚细胞水平活体组织显微成 像的先进技术。九十年代以来，多光子荧光共焦扫描成像技术是光学成像界研究的热点 之一，而且得到了医学、生物及化学界等各个领域的普遍关注。 1 3 课题的研究内容、目的和意义 激光技术已经具体应用于很多的生产领域，例如：激光打标、激光焊接、激光切割、 激光加工等。但这些具体的应用都是以激光扫描技术为基础的，都是激光扫描技术的具 体的生产应用。但是现在企业之间的竞争越来越激烈，产品的寿命周期越来越短，产品 的种类变的越来越复杂多样，需要处理的数据量越来越大，而且要求的效果越来越好， 能处理的图像格式越来越多。其中最突出的问题就是越来越大的数据量的处理及时，高 效。 激光共焦扫描显微成像系统是一种新颖的光学显微成像系统。利用激光共焦原理和 扫描技术，实现高平面分辨率和大景深成像，并使显微图像数字化，以便于计算机存储 和处理。通常传统的光学显微镜在平面分辨率和观察景深上存在着无法克服的矛盾。即 若显微镜具有高的平面分辨率，则其观察景深小；反之，若显微镜观察景深大，则平面 3 l 绪论硕士论文 分辨率就很低。而该系统具有高平面分辨率和大纵深的成像特性，可以对微观物体进行 三维显微成像，在半导体工业、材料科学、生物学和医学中有着广泛的应用。激光扫描 技术和数据采集技术已经研究多年了，以往都是通过软件查询的方式控制扫描的，虽然 这种方式结构简单容易实现，但是其扫描的速度比较慢，对于要求高速采集图像的系统 无法满足要求，所以如何解决上述问题是当前学术界十分紧迫的任务之一。那么本课题 就是要开发一种能够实现高速采集图像数据、扫描效果更好、能够提高扫描图像分辨率 的激光扫描系统。 1 4 论文的主要研究内容 本学位论文主要包括以下几个方面的研究内容： 1 、激光共聚焦扫描显微系统成像原理与扫描技术分析：详细了解激光共聚焦扫描 显微系统成像原理，着重研究激光共聚焦显微镜与传统光学显微镜相比具有的特点；掌 握激光共聚焦显微镜的扫描原理，为后期单片机软件设计以及p c 机软件设计打下基础。 2 、共聚焦高速扫描成像系统硬件搭建：拟搭建的电路框图如下： 本系统拟采用单片机a t 8 9 s 5 2 为核心，主要包括快速振镜模块、慢速振镜模块、电 源转换模块、信号转换模块、d a 转换模块、三态门模块、探测器模块、放大器模块、 a d 数据采集模块、串口通讯模块。通过电平转换模块把快速振镜数据输出板中输出的 象素使能信号( r s 2 3 2 电平) 和象素时钟信号( r s 4 2 2 电平) 转换成单片机a t 8 9 s 5 2 所 能接收的t t l 电平；三态门模块控制象素使能信号和象素时钟信号是否有效，象素使能 信号接入单片机的外部中断和外部计数端口，象素时钟信号接入a d 数据采集卡的触发 端，单片机对象素使能信号计数，在外部中断服务程序中把象素使能信号的个数读出， 经过d a 转换模块输出模拟电压信号驱动慢速振镜振动，当扫描结束时关闭三态门，象 4 硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 素使能信号和象素时钟信号均无效。通过m a x 2 3 2 串行电平转换芯片实现了单片机与p c 机的数据通信。通过串口中断进行两者间的异步数据传输，使得用户可以随实际扫描要 求而相应选择不同的扫描分辨率和幅度。 3 、共聚焦高速扫描成像系统软件设计：在对硬件系统有了充分的理解和掌握的情 况下，再结合扫描硬件电路的运转特点，将对软件编程进行合理安排和设计，以完成扫 描的全部过程与需要。首先，商讨和确定本次软件工程设计的要求如下：在一个平面坐 标系下，照射在互相垂直方向的两个振镜激光反射光线( 分别设为x 方向和y 方向) 在软件控制下沿一个简单的矩形平面框做逐行扫描。x 方向上的振镜控制该光线在x 方向上的运动速度和范围( 长度) ，y 方向上的振镜控制该光线在y 方向上的运动速度 和范围( 宽度) 。在与单片机相通信的微机系统中，人为设定该扫描电路的工作开始、 扫描的幅度和分辨率，并且在最后利用a i d 卡采集扫描数据，最后经过一系列后续处 理得到图象输出。 2 激光共焦扫描显微成像系统原理硕士论文 2 激光共焦扫描显微成像系统原理 2 1 前言 激光扫描共焦显微系统( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ，简写为l s c m ) 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种高新科技产品，它是将光学显微镜技术、激光扫描技 术以及计算机图像处理技术三者有机的结合在一起的高新技术设备。简单的来说，激光 扫描共焦显微系统是在光学显微成像基础上装上激光扫描装置，然后再利用计算机图像 处理技术，获得样本的系列“光学切片 以及各个层面的信息，这种功能称为“显微 c t ”，激光扫描共焦显微镜现在多个科学领域得到广泛的应用，例如：生物学、遗传学、 材料科学以及地质科学等等阻，。 1 9 8 5 年，一条有关共焦显微镜产品的报道引起了生物界的轰动，在报道中瑞典斯 德哥尔摩皇家技术学院公开宣称制成了一台名为p h o i b o s 的特殊仪器，使用仪器可以用 来观测活的细胞的横断面，从而为观测现实活细胞的三维结构图像找到了一种新的方 法。该仪器通过生物样品在垂直方向做缓慢的移动，这样以便激光光束在生物样品的不 同深度上聚焦，一般横断面得厚度约为i - 2um ，然后将光束扫描所得到的图像通过计 算机进行处理、显示和存储。正是因为瑞典和英国在1 9 8 5 年发明了在固定的显微镜光 路中驱动光束扫描的方法，使共焦显微技术得到了极大的改进，并使共焦显微镜系统成 为了更为实用的产品。近年来除了瑞典推出的上述产品外，还有英国的b i o r a d 公司、 日本的o l y m p u s 公司、德国的l e i c a 公司也先后推出了，这些l s c m 系统在很多领域都 得到广泛的应用。 2 2 激光共焦扫描显微镜的原理分析 激光共焦扫描显微成像技术是采用共轭焦点的技术，它采用激光作为光源，并使光 源、被测样品、探测器处在彼此对应的共轭位置上。原理图如图2 1 所示。其工作原理 为激光光源发出的激光射入激发光源针孔，而后激发光源针孔射出的光线经双色反射镜 发射后再由显微物镜聚焦到样品中的某一点，在该点所激发出来的荧光又透过显微物镜 后又透过双色发射镜聚焦到探测器表面前的检测针孔，最后由光电倍增管( p h 。 t o m u l t i p l e t u b e ，p m t ) 探测收集，并将收集所得的信号输入到计算机进行处理、成像以 及存储，这样就得到了焦面上一点的成像。如果激光光束做二维扫描就可以实现平面的 光学断层成像，通过样品在垂直方向的缓慢移动，就可以使不同深度的样品层进入焦平 面，从而得到不同深度样品层的像。在整个成像过程中，只有来自样品焦平面上的光线 能探测器的检测针孔前正确聚焦，从而可以穿过检测针孔而成像，而其他处于样品焦平 6 硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 面以外的光线到达检测针孔时处于离焦状态，这样就直接被检测针孔滤除，所以非共焦 面的背景均呈黑色，反差增强，成像清晰。 激光共焦扫描显微镜可在横向上打破衍射极限所决定的分辨极限，因为瑞利准则所 确定的分辨率是对物体上两点而一言，但在l c s m 系统中，成像的仅有一个物点，因此 只要照明点和探测点足够小就可能获得突破瑞利衍射极限的高分辨率，其实质是通过牺 牲视场来提高分辨率口刮。 口嬲 一 焦点内光线 焦点夕 光线 图2 1 激光共焦扫描显微镜原理图 物辘 _ - _ - _ - _ - 徉晶考 激光共焦扫描显微镜相对于普通光学显微镜来说在性能上有着显著的特点，激光共 焦扫描显微镜不仅具有比普通光学显微镜更高的平面分辨率，而且具有很高的深度分辨 率，因此可以对生物标本的不同深度进行光学断层扫描成像，而后利用图像处理及图像 分析技术将采集的荧光图像进行分析处理，最后还可以利用计算机对生物体的三维采样 离散数据场进行三维重构，这样就可以生成物体的三维图像，满足人们的各种实际观测 需要。激光共聚焦扫描显微镜相对于普通光学显微镜在结构上的主要特点是在探测器前 7 2 激光共焦扫描显微成像系统原理 硕士论文 安置了一个空间滤波器，正是由于激光共焦扫描显微镜在结构上具有这个特点，使其能 够较好的抑制住共焦点以外光线进入探测器的感光面，从而提高了系统分辨率。 ( x ，y 1 ) ( 乏- ，q ，) ( x 。，y ) ( ：，q1 ) ( x = ，y ：) s 。 i哆 己j 南 d 2d 2 d t 图2 2 激光共聚焦扫描显微镜光学成像原理 - d 激光共聚焦扫描显微成像系统的光学成像原理如图2 1 所示。点光源s 发出的光 线，经过系统在放置空间滤波器d 的接收面( x 。，y ：) 上成像。设( x 。，y 。) 代表被探测物体 上的扫描点位置，物体的透射率函数为t ( x 。，y 。) ，光源向坐标为( x 。，y 。) 。则光线透过 物体之后的光场复振幅为： u l ( x o ，y o ，x 。，y 。) = t ( x 。一x o ，y ，一y o ) 办1 ( x o ，y o ) ( 2 1 ) 其中h i ( x o ，y o ) 是透镜l 1 的振幅脉冲响应函数，也可以用下式表示： 1 1 ( x o , y 。) = ，异( 号。，t 1 。) e x p g 。+ q 。y 。) j k d ：】必。咖。 ( 2 2 ) 式中：互g 。，q 。) 是透镜l 1 的瞳孔函数。 经过l 2 透镜，在接收面( x 。，y ：) 上的光场复振幅分布为： ：，y z ，t ，y s ) = ，璺( x o , y o , x s , y s 沙z ( 台一，告一乩) 出。砂。 ( 2 3 ) 式中：m 为系统的成像放大率，h ：为透镜l 2 的振幅脉冲响应函数。如果当空间滤波器d 孔径为8 函数时，则空间滤波器后的光场复振幅分布为： u 2 ( 0 ，o , x s , y 。) = ，啊( ，y 。y ( x ，- x o , y 。一y 。) 办2 ( - x o , 一y 。) d x 。d y 。 ( 2 4 ) 其光强分布为： 地乒峥彬以啊班嘞溉。，叫2 汜5 ， 硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 当采用反转坐标，即( 吨，叫。) = h 2 ( x o ，y o ) ，式( 2 5 ) 可写成： ，( t ，y 。) = l 啊吃+ 1 1 2 ( 2 6 ) 其中：木表示卷积。 由此可知：如果光源和空间滤波器孔径均为6 函数时，该系统为相干成像系统，此 时两个透镜均对系统分辨率有贡献。但是在现实中点光源和空间滤波器的尺寸均为有限 大小，此时系统为部分相干成像，成像质量将有所下降。在实践中发现，当增大孔径时， 采集的荧光信号的增强是以损失平面分辨率和深度分辨率为代价，从而在某种程度上削 弱了激光共聚焦扫描显微镜光学断层扫描成像的优势。 我们已经知道激光共聚焦扫描显微镜相对于普通光学显微镜而言具有较高的平面 分辨率，下面从空间域来分析激光共聚焦扫描显微镜平面分辨率特点。设图2 2 中透镜 l 1 ，透镜l 2 具有相同瞳孔函数1 0 。即 e ( 号l ，1 1 1 ) = 最( 亏2 ，t 1 2 ) = c i r c ( 二) ( 2 7 ) 式中：a 表示透镜半径，r 表示透镜径向距离。 则其脉冲响应函数为： 啪) ：吃o ) ：r 型、1 ( 2 8 ) ， 式中：丫= 2 n r a 2 是归一化的坐标分量。d 为像距。九为入射光的波长。j 1 为一阶b e s s e l 函数。 若当点物体t ( x o ，y o ) = 6 ( x 。一x 0y ，一y o ) 时，代入式( 2 6 ) 得： 川= ( 半) 4 汜9 ， 图2 3 点物体的成像光强分布 此时，光强度分布如图2 3 实线表示。而普通光学扫描显微镜的强度分布如图2 3 9 2 激光共焦扫描显微成像系统原理硕士论文 中虚线所示。根据瑞利判据若两个物点刚好被分辨，则要求一个物点像的主极大和另一 个物点像的第一极小相重合。因此，可以定义，0 ) = 0 的第一个零点为扫描光学显微镜 的平面分辨率。由图2 3 可知激光共聚焦扫描显微镜具有更高的平面分辨率。 激光共聚焦扫描显微镜的另一个重要特点是具有高的深度分辨率，许多学者均己研 究了共焦系统的深度分辨率特性。研究共焦系统的深度分辨率特性的方法有很多。深度 分辨率函数就是其中之一，其可以如下定义： 巳， j ( z ，) = il c ( 既u ) l 桶 ( 2 1 0 ) 乞 式中：u 是离焦量，光学坐标u 与实际的轴向位移量之间的关系为： u = 4 k z s i n 2 2 ) ( 2 1 1 ) 式中：k 为波数，z 为系统实际轴向位移量，s i n o c 为数值孔径。 痢是归一化的空间频率，由下式给出： 筋= m l 2 s i n c z( 2 1 2 ) c ( m ，u ) 是共焦传输函数，它表示为： ( 2 1 3 ) 式中：，i c 表示卷积运算，p 1 ，p 2 是考虑离焦因素的两个透镜瞳孔函数。 对于反射式共聚焦系统，p i = p 2 = p ，孔径为圆形时，则有： p ( q ) ：i e x p 三_ ，材q 2 q 1 其中：o = 亏2 + q2 ，于是有： 嘶一叫2 了e x p j u q 2 + 矛n 。1 警 e x p j u q 2 q d q ( 2 1 5 ) 为了便于讨论，我们只考虑一维情况。根据傅里叶光学，对于反射式相干共聚焦系统， 其像强度为： ，( z ) = i c ( m ，“) t ( m ) e x p ( 2 r c j m z ) d z 2 ( 2 1 6 ) 式中：t ( m ) 为透镜透射率函数t ( z ) 的傅里叶变换。 若t ( z ) = 1 ，则式( 2 1 6 ) 为： 1 0 硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 ，) ：f s i n u 21 ( 2 1 8 ) 一 lu 2 由上可知，深度分辨率函数能够更为准确地表达系统深度分辨率特性。激光共聚焦 扫描显微镜深度分辨率函数j ( u ) 随离焦量变化曲线如图2 4 所示。由图2 4 可知，j ( u ) 的函数值随着离焦量的增加而下降，因此共焦光学成像系统具有较高的深度分辨率。而 在普通相干成像系统中，由于j ( u ) 是一个常数，则系统没有任何深度分辨性能。 由于函数j ( u ) 非常复杂，为了能够与横向分辨率那样定性地确定一个共焦系统深 度分辨率，一般可以先作出j ( u ) 与u 的关系曲线，当两个轴向物点相对应的两个j ( u ) 函数的叠加分布曲线极大值和极小值之间的差异等于1 ：0 7 3 6 时，则深度分辨率等于此 时两个轴向物点之间的距离。 j ( u ) 图2 4激光共聚焦扫描显微镜深度分辨率函数与离焦量关系 激光共焦荧光扫描显微镜与激光共聚焦扫描显微镜同样具有较高的平面分辨率和 深度分辨率特性，也可以对生物标本进行荧光断层扫描成像，但因为辐射荧光光谱较宽， 所以激光共焦荧光扫描显微镜是一种非相干光学成像系统。迄今为止，共焦荧光扫描显 微镜系统横向分辨率和纵向分辨率的分析都是基于对系统传递函数的计算来进行评价 的。这主要是因为传递函数描述了系统本身的性质，与具体的观测物体并没有关，但是 实际光学系统的分辨率不仅仅与光学系统本身有关，还与探测系统、光在被观测样品中 的传播规律等诸多因素有关。下面从理论上推导出共聚焦荧光扫描显微镜的三维光学传 递函数激光共焦荧光显微系统成像原理如图2 5 所示堙 枷。 )7 - l夏，l 2 d ： 他 为 c ) ，-j 7 = ) 2 ( ， 式 d um 童(、， l f u，l色 ，l 式 入 代 2 激光共焦扫描显微成像系统原理硕士论文 探测器 d - d o 点光源 舀) z 图2 5共聚焦荧光扫描显微镜原理示意图 在激光共焦荧光显微系统中，从点光源发出的激光通过半透镜后由物镜聚焦到以荧 光探针标记的样品上，样品中被激发出来的荧光再经过物镜，半透镜入射到一个孔径极 小的空间滤波器上，而在空间滤波器后l m 安置个高灵敏度探测器设物空间点的坐标为 ( x ，y ，z ) ，其坐标原点选在点光源在物空间的共姚点，z 轴方向选在光轴方向。设荧 光物体的分布为0 ( x 。一x ，y s - y ，z s - z ) ，其中( x 。，y 。，z 。) 表示扫描点位置。( x 。，y 。，z 。) 表示荧光像点坐标。像空间点的坐标原点位于x y z 坐标系坐标原点在像空间点的共轭 点。设波长为入的点光源在物空间的振幅脉冲响应函数为h ，( x ，y ，z ) ，而在探测器面 一上荧光波长为九，的振幅脉冲响应函数为红。一兹，y 一兹，z 一兹) 。m 为系统的放大 率信数。设位于空间滤波器后面的探测器灵敏度为： f 1 d ( x d ，y d ) = 【0 式中：r d 为探测器孔径。 假设从样品中发射的荧光强度与激发光的强度分布成正比，并且假定样品对激光 发光的吸收很小，则样品上扫描点荧光强度分布为眦嗡1 ： 6 ( x 。，j ，。，z ，) = i 魄( x ，y ，z ) l o ( x 。- - x ，y ，- y ，z ，- z ) ( 2 2 0 ) 该荧光分布通过透镜在像空间的分布为： 1 2 焉 硕士论文 共聚焦高速扣描与成像系统研究 台垅，z a ；x 。，咒，磊) 砸怖纠2 水呜屿z 芬魄哨咒叫弓一 汜2 1 ， 探测器小孔中心与像空间坐标系原点重合，即乃= 0 ，则探测器获得强度为： 咐s ，y s , z s 、) = 、i b d ，y d ，z u ；x 占，y s ，z 3 d b d ，y d d d y d ( 、2 2 2 ) 代入式( 2 1 6 ) ，则 p c x ，y 。，z 。，= j 甄j 萤啊c 五y ，z ，1 2 i 办：c x i x 7 d ，y 一羞争，z 1 2 。c x d ，y d ，出d 砂d o ( x 。一x ，y 。一y ，z ，一z ) d x d y d z ( 2 2 3 ) 式中：m 为系统放大率。 由三维成像理论可知共焦扫描荧光显微镜的三维点扩展函数p s f ( p i o n ts p r e a d f u n c t i o n ) 为： p s f ( x , 咖弘蚓2 p x d 可y d 爿2 盹州奶帆2 4 ， 由点扩展函数的三维傅里叶变换可以计算出系统的三维光学传递函数为： o t f ( l ，乃，以) = ，雕f ( x ，y ，z ) e x p b 2 = j ( x f + 玩+ z f ：) d x d y d z ( 2 2 5 ) 式中：六，六，正为x ，y ，z 方向的空间频率。 计算三维传递函数时，可先计算x ，y 方向的傅里叶变换，最后计算z 方向的傅里 叶变换，即： o t f ( f ，乃，以) = h ( 六，乃，z ) e x p - 2 r t j z f ： d z ( 2 2 6 ) 式中：h ( 六，z ) 是离焦量为z 的两维光学传递函数。即： 由卷积定理的： 日( 六，z ) = 朋f ( x ，y ，z ) e x p - 2 r c j ( x f + 圻) b 砂( 2 2 7 ) 日( 六，z ) = - 2 风】木h 。 ( 2 2 8 ) 2 激光共焦扫描显微成像系统原理硕士论文 式中： h 。= ff m ，m e x p - 2 x j ( x f , , + 玩) 蛔 ( 2 2 9 ) h i = | ( x ，y ，z ) 1 2 e x p 【_ 坷( 织+ 玩) 蛔 ( 2 3 0 ) h ：= ，i h 2 ( x ，y ，z ) 1 2 e x p b 2 r t j ( x f 。+ y y , d y ( 2 3 1 ) 对位置坐标( x ，y ，z ) 引入光学坐标，在激发光波长为入时，光学坐标定义如下： 甜。：孕i n(232)xsm(x 甜j2 一 l 么 ：孕(233)ysma ”y2 _ l z 材：丝z s l n 仅( 2 3 4 )材= z 仅 l z j 4 ) 九 式中：假定折射率为1 ，s i n o 【为物镜的数值孔径。 定义归一化的空间频率： s = ? l 六 ( 2 3 5 ) f ：去 ( 2 3 6 ) s l i l 仪 = l 正 ( 2 3 7 ) 则二维光学传递函数为： h ( s ，z ，：) = d 7 2 ( s ，f ，“：) h o ( s ，f ) 】木h l ( s ，f ，甜：) ( 2 3 8 ) 通过计算可以得到： ， q ( j ，f ，“：) = 2 ( 1 一o 6 9 , f f i s 2 - t 2 ) + o 0 0 7 6 ( s 2 + t 2 ) + o 0 4 3 ( s 2 + f 2 ) ； 寸一 o l 其中a = u z 0 2 + ，2 ) 2 ，j 1 为第一类一阶b e s s e l 函数。 1 4 s i 2 ( 2 3 9 ) s i 2 硕士论文 共聚焦高速扫描与成像系统研究 ， h 2 ( s ，f ，u ：) = 式中p = 等 33 2 ( 1 0 6 9 1 3 万) 十o 0 0 7 6 1 32 ( s 2 + f 2 ) + o 0 4 3 1 3 i ( s 2 + f 2 ) i 寸一 0 式中：v ，2 音。其中： v h b 的状态。a b 之间的电压差不小于2 0 0 m y 。 r s 4 2 2 标准全称是“平衡电压数字接口电路的电气特性”，它定义了接口电路的特性。 r s 4 2 2 只有五根线，t x + ，t x 一发送对，r x + ，r x 一接受对，实际上还有一根信号地线。r s 4 2 2 这种传输方式，最大的优点是可以有效的抗共模干扰，提高通信距离，最远可以传送 1 2 0 0 m 。r s 4 2 2 采用平衡驱动，差分接收电路，取消了信号地地接法，平衡驱动器相当 4 0 硕士论文共聚焦高速扫描与成像系统研究 于两个单端驱动器，当输入同意信号时其输出是反相的，如有共模信号干扰时，接收器 只接收差分信号电压，从而大大提高了抗共模干扰的能力，并能在较长距离内明显提高 传输速率。 本系统的快速振镜数据输出板中输出的象素时钟信号为r s 4 2 2 电平信号，可以采用 专用的芯片s n 7 5 1 7 5 实现其到t t l 电平的转换。s n 7 5 1 7 5 其外部管脚图如图3 1 7 ( a ) 所示，逻辑符号如图3 1 7 ( b ) 所示： 3 b g n d 3 a 2 b 3 yz2 a u 3 4 e n u i 2 y 4 y 1 2 e n n 4a乙ni y 4 b l a v c c l b 1 y 2 y 图3 1 5 ( a ) s n 7 5 1 7 5 外部管脚图图3 1 5 ( b ) s n 7 5 1 7 5 逻辑符号 该芯片由四组转换器所组成，前后两组共用一个使能信号，一组转换器中由两个信 号输入端、一个使能控制端和一个输出端所构成。其转换关系如下所示： 表3 8转换函数表 a - be n a b l eo u t p u ty 0 2 v hh 一0 2 v 0 2 v h 9 一0 2 v hl lz 开路 h 9 h ：高电平l ：低电平x ：不相关? ：不确定z ：高阻态 3 1 6 程序的下载模块 单片机的工作主要是通过程序来控制的，要使得单片机实现相应功能必须要有相 应的程序在单片机中工作。编好的程序般是通过下载线或者烧录器烧入到单片机中。 本设计是采用了e a s yi s p 下载线把程序下载到单片机中。e a s yi s p 下载实际上是一种 4 1 3 扫描与成像系统硕士论文 串行通讯，通过连接单片机的m o s i ( 数据串行输入) 、m i s o ( 数据串行输出) 、s c k ( 同 步控制时钟) 和r s t ( 复位) 端与p c 机的c o m 口进行通讯。其内部电路原理图如3 1 8 所示，其中7 3 h c 3 7 3 是数据锁存器， r 删i d p o n d 1 1 4 v 2 o _ _ 1 5 v 3 o - 1 6 v 4 o - - 1 7 v 5 o - 1 8 v 6 0 - 1 9 v 7 o - - 2 0 v 8 0 一 2 l v 9 o _ 2 2 v 1 0 0 一 2 3 v 1 l 0 一 2 4 v 1 2 o - 2 5 1 3 0 d b 2 5 是2 5 针的c o m 口接口。 i 二 图3 1 8e a s yi s p 下载线原理图 3 1 7a d 数据采集卡 数据采集( d a q ) 是指从传感器和其他待测设备等模拟和数字被测单元中自动采集 非电量或者电量信号，送到上位机中进行分析、处理，数据采集系统是结合基于计算机 或者其他专用测试平台的测量软硬件产品来实现灵活的、用户自定义的测量系统h 刚。 而数据采集卡是实现数据采集功能的计算机扩展卡，可以通过u s b 、p x i 、p c i 、i s a 等 总线接入p c 。本激光扫描成像系统中，与数据采集卡相连的是由快速振镜驱动板输出 的像素时钟信号，由于该像素时钟信号频率已经达到了4 m h z ，所以我们选用了台湾凌 华科技公司的型号为p c i - 9 8 1 2 的数据采集卡，该数据采集卡是基于p c i 总线的通用高 速数据采集板，因为p c i - 9 8 1 2 的数据采集速度最大可以高达2 0 m h z ，能够完全满足本 次设计系统的像素时钟信号4 m h z 的要求，而且p c i - 9 8 1 2 还具有高速多通道多种触发方 式等特点，还有p c i - 9 8 1 2 支持多种软件开发平台，如：v c c + + 、v b 等等，这样给开发 带来了很多便利。 p c i - 9 8 1 2 的主要性能：3 2 位p c i 总线，即插即用；每通道最高2 0 m h z 采样频率；4 路单端同步输入通道；1 2 位模拟量输入分辨率；4 个a d 转换器，为每一个模拟量通道 提供一个转换器；板上带有