（环境科学专业论文）毛细管电泳在线富集苯氧羧酸类除草剂.pdf

佳。本论文成功地将研究的两种在线富集技术应用到手性毛细管电泳中，为手性农药的环境安全监测提供了新的技术支持。关键词：毛细管电泳，苯氧羧酸类除草剂，在线富集，阴离子选择性耗尽进样一扫集法浙江工业大学硕士学位论文a b s t r a c tc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si sac l a s so fl i q u i d p h a s em i c r o e x t r a t i o na sc a p i l l a r yf o rt h es e p a r a t i o nc h a n n e l ，a sh i g h - v o i l a g ef o rd r i v i n gf o r c e am a j o rd r a w b a c ko fc ei st h el o w s e n s i t i v i t y i nav a r i e t yo fm e t h o d st oi m p r o v ec ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y ，o n - l i n ec o n c e n t r a t i o ni sas i m p l e ，c o n v en i e n ta n de f f e c t i v em e a n s t h ea r t i c l ew h i c hi sf r o mt h eb e g i n n i n go fi n c r e a s i n gs a m p l e 一画e c t i o na n dc o m p r e s s i n gs a m p l ez o n ec o n d u c t st w oo n l i n ec o n c e n t r a t i o nd e e p l y , a st ob r o a d e nt h er a n g eo fa p p l i c a t i o n so fc h r i a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s d e t a i l sa r ea sf o l l o w s ：1 a no n - l i n ec o n c e n t r a t i o nm e t h o db a s e do ns w e e p i n gi sc o n d u c t e do nt h et h r e ep a i r so ft h ec h r i a lp h e n o x ya c i d h e r b i c i d e s( 2 ，4 一d r o p so fp r o p i o n i ca c i d ，2 - ( 3 ，4 ，5 一t r i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d )p r o p i o n i ca c i da n d2 一( 3 一c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i ca c i d ) ，a n di n v e s t i g a t e dt h ei n f l u e n c eo fi n j e c t i o nt i m eo nt h ee n r i c h m e n te f f e c t u n d e rt h eb e s tc o n d i t i o n s ，a st oc o n v e n t i o n a lp r e s s u r e 蝎e c t i o n ，t h i sa p p r o a c hc a na l l o wt h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fc h i r a lp h e n o x ya c i dh e r b i c i d e se n a n t i o m e r si n c r e a s i n gb y4 9 0 0 - 110 0 0t i m e s2 ad u a la n ds e q u e n t i a le l e c t r o s t a c k i n gm e t h o db a s e do na s e i -s w e e p i n gw a sd e v e l o p e df o ro n - l i n ec o n c e n t r a t i o no fc h i r a lp h e n o x ya c i dh e r b i c i d e s t h ee f f e c to fh i g hc o n d u c t i v i t yz o n e ，w a t e rp l u ga n di n j e c t i o ni i i浙江工业大学硕士学位论文t i m ew a si n v e s t i g a t e d u n d e rt h eb e s tc o n d i t i o n s ，a st oc o n v e n t i o n a lp r e s s u r ei n j e c t i o n ，t h i sa p p r o a c hc a t la l l o wt h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fc h i r a lp h e n o x ya c i dh e r b i c i d e se n a n t i o m e r si n c r e a s i n gb y2 2 5 7 10 5t a m e s t h et w oo n - l i n ec o n c e n t r a t i o nc a ni n c r e a s et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya b o u t3 - 5o r d e ro fm a g n i t u d e so ft h ep h e n o x ya c i dh e r b i c i d e s a m o n gt h e m ，e s p e c i a l l yt h ea s e i s w e e p i n ga c h i e v e st h eb e s te n r i c h m e n te f f e c t i nt h i st h e s i s ，t w oo n l i n ec o n c e n t r a t i o n sw es t u d i e da r ea p p l i e dt ot h ec h r i a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss u c c e s s f u l l y k e y w i o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，p h e n o x ya c i dh e r b i c i d e s ，o n l i n ec o n c e n t r a t i o n ，a n i o ns e l e c t i v ee x h a u s t i v ei n j i e c t i o n s w e e p i n gi v缩写符号a f m cb g sc ec z ec t a ce k se o ff a s sg c m sh p l cl c m sl v s sn 匝k cm s sn a c e兀ts d ss e is f es p m 咂y - c dg - s p e浙江2 1 2 且k 大学硕士学位论文符号说明英文名称中文名称a n a l y t ef o c u s i n gb ym i c e l l ec o l l a p s e胶束解离堆积b a c k g r o u n ds o l u t i o n背景电解质溶液c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s毛细管电泳c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s毛细管区带电泳c e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d e十六烷基三甲基氯化铵e l e c t r o k i n e t i cs u p e r c h a r g i n g电动力增压e l e c t r o o s m o t i cf l o w电渗流f i e l d - a m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g场放大进样g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y气相色谱质谱h i g l ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y n l a s ss p e c t r o m e t r y液相色谱- 质谱l a r g ev o l u m es a m p l es t a c k i n g大体积进样m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y胶束毛细管电色谱m i c e l l et os o l v e n ts t a c k i n g胶束有机溶剂堆积n o n a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s非水毛细管电泳i s o t a c h o p h o r e s i s等速电泳s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠s e l e c t i v ee x h a u s t i v ei n j e c t i o n离子选择性耗尽进样s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n超临界流体萃取s o l i d - p h a s em i c r o e x t r a c t i o n固相微萃取3 , - c y c l o d e x t r i nv 环糊精m i c r o s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n微固相萃1 1 选题背景浙江工业大学硕士学位论文第一章前言帚。早月i j 苗农药伴随和支撑着现代农业的发展，其使用量大，品种复杂，而且地域分布范围广。我国是农业大副1 1 ，每年平均发生病虫害约2 7 2 8 亿亩，全国农业每年对农药的使用量为1 0 一3 0 万吨，每公顷使用农药约2 4 2 地。其中杀虫杀螨剂占到6 2 ，杀菌剂占2 1 ，除草剂约占1 7 ，植物生长调节剂和杀鼠剂所占比例较小。苯氧羧酸【2 】是最早开发成功并广泛用二f 农林业生产的一类有机选择剂除草剂，自从1 9 4 2 年美国z i m e m a npw 和h i t c h c o c k 在研究植物激素过程中，除草剂新品种的研制与开发开始步入新的领域。此类除草剂具备价格低廉，除草速度较快，除草谱较宽等优点，在生产中一直发挥重要作用，广泛用于小麦、玉米和水稻田防除阔叶杂草。苯氧羧酸类除草剂在为农林业生产做出巨大贡献的同时，也对环境造成了极大的危害。因此对苯氧羧酸类除草剂的研究也已成为当前许多分析工作者关注的焦点之一。在对苯氧羧酸类除草剂的分离分析方法中，毛细管电泳是近年来发展起来的一类简单方便且高效的新兴分离技术。毛细管电泳【3 】技术是以高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一种新型的液相分离技术，因其特有的选择性成为高效液相色谱技术的补充，近2 0 年来得到了迅猛的发展。毛细管电泳技术具备分离效率高、分析速度快、进样体积小、成本低、自动化程度高以及分析对象广等优点，在分析检测中显示了巨大的潜力，目前已广泛应用于生物工程4 1 1 1 、医学临床检验1 2 】、法庭科学、药物分析 1 4 - 2 9 1 及小分子的测定 3 0 - 3 4 1 等领域。用毛细管电泳技术检测农药残留，国外研究较早。1 9 9 4 年s c h m i t t 3 5 l 等用毛细管胶束电动色谱( k c ) 法同时分离并检测了育畜磷、异柳磷、氯亚胺硫磷、苯线磷和马拉硫磷。之后，国内外的诸多学者在这方面也做了大量的研究工作，张裕平【3 6 】讨论了灭多威等五种氨基甲酸酯类农药的毛细管胶束电动色谱现象；h i n s m a n n 等3 7 1 通过自动在线浓缩样品，采用c 1 8 的固相微柱可将水样中的农药浓缩1 2 倍。以s d s 作胶束，添加少量的乙腈，可在1 3m i n 内分离测定水中的7浙江工业大学硕士学位论文种不同种类的农药。f r i a s 等【3 8 1 采用固相萃取( s p e ) 预浓缩，m e k c 法测定了地下水样中的1 1 种三嗪类农药。检出限在o 5 0 9n g m l 之间，相对标准偏差低于3 2 。毛细管电泳技术在农药残留及其它方面得到了很大的发展，但由于毛细管电泳进样量小和在柱检测的光程短，若采用通用的紫外检测时灵敏度仅为1 0 1 0 5m o l l ，与h p l c 相比检测灵敏度大约要降低2 个数量级，从而限制了其在痕量分析中的应用。所以如何提高毛细管电泳的检测灵敏度，且不会使区带发生明显展宽，一直以来都是c e 技术研究中的一个关键问题。近年来发展较快的方法有：发展灵敏度较高的检测器，设计特殊类型的检测池，利用扩展室提高检测光程，引入离线和在线检测的富集技术等。目前，国内外的许多学者在如何提高毛细管检测灵敏度方面做了大量的工作。a i b e r t 等人3 9 1 研究了1 t a b 的浓度对砷酸类离子分离的影响，实验结果表明采用t t a b 可使被分析物的检测灵敏度提高3 0 4 0 倍。b e n n u d o 【4 0 】等人采用毛细管电泳场强放大富集法对食品中的丙烯酞胺类物质进行分析，标准品和实际样品中被分析物的检测限分别达到了1n g l 和3n g l 。w e n g 4 1 1 等人采用毛细管场强放大富集技术和安培检测器联用检测了人体尿液中的单胺物质，使被分析物的检测灵敏度提高约5 0 倍。虽然毛细管电泳在农药残留的分析分离中做出了一定的贡献，但是对于痕量和超痕量物质的检测仍然不能达到理想的效果。近年来，在线富集技术开始广泛应用于对农药的检测分析，但是对手性农药的毛细管电泳研究报道的还比较少，本文通过手性苯氧羧酸类除草剂的在线毛细管电泳进行研究，旨在提高毛细管电泳的检测灵敏度基础上，拓宽毛细管电泳的应用范围。1 2 实验的技术路线由于毛细管电泳富集技术在提高检测灵敏度以及降低方法的检出限方面所表现出的巨大作用，其应用越来越受到国内外研究者的关注。为了提高毛细管电泳对手性农药的在线检测灵敏度，本实验从提高样品引入量和对样品区带压缩两方面入手本，在预实验( 最优手性分离条件的确定) 的基础上，在胶束毛细管电动色谱模式下，采用扫集法和阴离子耗尽进样扫集法两种富集技术对手性苯氧浙江工业大学硕士学位论文羧酸类除草剂进行在线富集。本实验首先采用扫集法对手性苯氧羧酸类除草剂进行在线富集。其主要流程为：背景缓冲液充满整个毛细管后，在一定的压力下导入一段含磷酸和手性选择剂的区带，接下来，在反向电压下导入样品溶液，由于样品在胶束相中发生分配作用，从而导致样品溶液在其中的运动速度小于在含磷酸区带中的运动速度，由此达到富集效果。阴离子选择性耗尽进样扫集法：是样品堆积和扫集法的联用技术。样品堆积是基于样品区带和背景电解质区带的电场强度不同所引起的分析物电泳速度骤变而实现的。运用此方法时须将样品溶解于低电导溶液中，毛细管中则需充满高电导的背景缓冲溶液。当在毛细管中引入一定长度的样品溶液后，低电导的样品溶液和高电导的背景缓冲液共存于毛细管中。在毛细管两端施加电压后，由于样品溶液的电导率低使得该区带具有高场强，样品离子在该区带的迁移速度加快。当样品离子穿越样品溶液和背景缓冲溶液的界面时，由于电导增高，电场强度骤然降低，使其迁移速度骤降从而导致样品区带的长度缩短、浓度提高，达到富集的目的。阴离子选择性耗尽进样扫集法结合上述两种富集方法来提高灵敏度的，其主要原理为：先使b g s 充满整个毛细管，接着压力进入一段水柱，然后在反向电压下通过电迁移使溶解在低电导溶液中的样品阴离子进入毛细管并以较快的速度穿过水柱，当样品离子穿过水柱和缓冲液交界处时，其速度减慢并在界面处堆积；然后，同样在毛细管两端施加反向电压，胶束从进样端进入毛细管，对已经堆积的样品进行进一步的扫集，达到二次富集的效果，最终样品区带被压缩，样品进样体积增大，在胶束电动模式下进行分离。本实验选取化学结构相似且常用的3 种苯氧羧酸类除草剂作为研究对象，分别为：2 ，4 滴丙酸、2 ( 3 ，4 ，5 三氯苯氧酸) 丙酸和2 ( 3 氯苯氧酸) 丙酸。这些农药在我们的生产和生活中扮演着非常重要的角色，能够将其手性分离且达到较高的富集倍数，对实际生产以及环境监测都有重要的意义。1 3 论文的创新点浙江工业大学硕士学位论文论文主要研究了扫集法和阴离子选择性耗尽进样扫集联用方法用于苯氧羧酸类除草剂的对映体分离与富集。本论文从提高样品引入量和对样品区带压缩两方面入手，深入研究了两种在线富集技术，主要考察了影响其富集效果的因素。具体内容如下：1 研究了扫集法在线富集2 ，4 一滴丙酸、2 一( 3 ，4 ，5 一三氯苯氧酸) 丙酸、2 一( 3 一氯苯氧酸) 丙酸三对手性苯氧羧酸类除草剂，考察了进样时间对富集效果的影响。在选定的最佳富集条件下，同常规压力进样相比，该方法可以使手性苯氧羧酸类除草剂的六种对映体的检测灵敏度分别提高4 9 0 0 1 1 0 0 0 倍。2 研究了一种在线顺序富集方法阴离子选择性耗尽进样一扫集法富集手性苯氧羧酸类除草剂，考察了高电导区带，水塞区带及进样时间对富集效果的影响。在选定的最佳富集条件下，同常规压力进样相比，该方法可以使手性苯氧羧酸类的六种对映体的检测灵敏度分别提高2 2 5 7 1 0 5 倍。4浙江工业大学硕士学位论文第二章毛细管电泳在线富集技术的研究进展2 1 引言目前，毛细管电泳技术在分析检测中得到了非常广泛的应用，但其灵敏度低仍是限制其进一步发展和应用的主要原因。普通商品化的毛细管电泳仪都配备紫外检测器，由于毛细管内径小导致检测光程短，检测灵敏度较低，其检测限约为1 0 m o l l ，远不能满足痕量分析的要求，使得该技术在应用上受到一定限制。如何提高毛细管电泳在线检测灵敏度或降低其检测限成为一项具有挑战性的工作。提高毛细管电泳检测灵敏度的方法【4 3 】一般可以分为两类。一是通过对毛细管进行改造或者使用灵敏度较高的检测器，如使用z 型、泡状检测池和多重反射毛细管，通过改变其光程来提高富集效果，这种方法通常可以将灵敏度最大提高几十倍 4 4 - 5 2 】。电化学检测器和激光诱导荧光检测器做为灵敏度较高的检测器，虽可以将检测灵敏度提高几个数量级 5 3 - 6 0 】，但是前者要求样品具有电化学活性，后者仪器比较昂贵，进一步研究的空间都较小。二是通过改进方法实现对样品的富集，样品富集包括样品前处理技术和样品在线富集两种。所谓前处理技术【6 1 】就是通过提取、净化、浓缩等步骤将样品中的目标物最大可能地完全提取出来。传统的样品前处理技术如液液萃取、索氏提取、层析、沉淀和过滤等，普遍存在操作繁琐耗时、误差偏大，需要使用大量的对人体和环境有毒或有害的有机溶剂、难以实现自动化等缺点。为实现样品前处理的自动化、在线检测有效性以及尽量减少有机溶剂的使用。近年来，发展了多种微萃取技术，例如超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 6 2 - 6 4 1 、固相微萃取( s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 【6 5 - 6 6 1 、微固相萃取( m i c r o s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，“一s p e ) 【6 7 1 、基于中空纤维的液相微萃取( 唧l p m e ) 6 s - 6 9 和1 分散液相微萃取( d l l m e ) 等。在线富集技术的研究大致分为两部分：其一，利用毛细管电泳自身所具备分离特点通过对样品进样量、背景电解质的类型和配比以及进样程序等进行调控而实现，一般不需要改造现有商品仪器。近几年已发展了许多在线样品检测和富集浙江工业大学硕士学位论文的方法，例如扫集( s w e e p i n g ) 、场放大进样( f i e l d - a m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) 、等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 、胶束有机溶剂( m s s ) 和胶束解离堆积( a n 位) 及暂态阱等；其二，使用内涂层毛细管，即将可以提高分离和富集效果的物质涂布到毛细管内壁上。前一种在线富集技术由于其易操作在近年来得到了迅速地发展。采用毛细管电泳在线富集技术不仅可以对带电荷的样品离子进行测定，同时也适用于中性分子或混合样品离子的测定。在线富集技术可在多种分离模式下进行，如毛细管区带电泳( c z e ) 、非水毛细管电泳( n a c e ) 、胶束电动色谱( m e k c )以及芯片毛细管电泳。这些在线富集技术为其广泛应用于痕量分析领域奠定了基础【7 l - 7 7 1 1 。2 2 在线富集方法在线富集技术是近年来毛细管电泳研究的主要方向之一。限制毛细管电泳技术发展和应用的一个主要原因是其检测灵敏度较低，在线富集技术是目前提高在线检测灵敏度的最简单方便且富集效果较好的一类方法。在线富集技术通常可以分为等速电泳，扫集，动态p h 联接，样品堆积，暂态阱，胶束解离堆积和有机溶剂堆积等。目前，对在线富集技术的联用也是热点之一，主要联用方法有：动态p hl 陕接一扫集法，选择性耗尽进样一扫集法及电动力增加等。下面就以上几种富集技术及其联用技术的原理，特点等做了简单综述。2 2 1 等速电泳等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 的基本原理是不连续的介质在流体运动所产生的作用力驱使下完成的进样，是基于离子淌度差异而进行富集的的一种电泳模式 7 8 。8 叭。按前导电解质、样品区带、尾随电解质顺序导入毛细管中，当电压驱动力的作用下，毛细管两端所有离子开始以不同的速度泳动，目标物按照这种淌度差异，得到连续但不重叠的梯形区带。m a z e r e e u w 等用此方法成功地对两类抗毒蕈碱类药物，即普鲁本辛和新斯的明进行了测定；v a n d e r v l i s 等在区带电泳模式下运用等速电泳的方法快速测定了普鲁本辛、间羟叔丁肾上腺素和新斯的睨三对药物。同时，h i r o k a w a 8 1 1 等用瞬时浙江工业大学硕士学位论文s i t p 对系列稀土元素、锶离子、锂离子和碘化物离子等进行了测定。i t p 在分析阴离子的时候，通常需要改变e o f 的方向或对毛细管表面进行修饰，或在其中加入适当的添加剂( 施加反向电压时) 以达到富集。i t p 同时适用于低盐、无盐和高盐样品的富集，该方法可以将目标物的检测灵敏度提高3 个数量级。采用i t p 法的缺点是分析时间长，要求电解质的纯度高，而且该方法只能富集带电离子，因为样品离子的电导受前导离子和尾随离子的限制，且必须介于两者之间。2 2 2 扫集扫集法( s w e e p i n g ) 是在1 9 9 8 年由q u i r i n o 和t e r a b e 第一次提出【8 扪。它是一种在线富集非极性分子的方法在胶束电动色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i ec h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) 模式下使用。该方法灵敏度的提高是由样品在胶束相中分配能力的大小或者是样品与胶束相之间亲和力的大小来决定的。在背景缓冲液添加表面活性剂可形成胶束缓冲液。不含胶束的缓冲液中含有被溶解的样品，当胶束穿过这一区带时，样品在胶束相中进行分配、富集，富集后的样品在m e k c模式开始分离。样品与胶束的亲和力越强，富集效果越好。通常灵敏度可提高5 0 8 0 0 0 倍。不带电化合物在带负电的p s 作用下扫集并分离如图2 1 所示。图2 1 a ，样品进入到毛细管中，此时各部分具有相同的电导率，不含胶束；图2 1 b ，在毛细管两端加上电压后，阴离子胶束从阴极端进入到样品区带后和目标物相互作用，目标物在这种作用力的驱使下向前迁移并进一步压缩这一区带；随着胶束的继续迁移，在被压缩后的样品区带和缓冲液之间形成一个已经被富集的目标物区带且不含胶束；图2 1 c ，当胶束在驱动力的推动下，完全穿过样品区带后，对目标物的扫集结束；图2 1 d ，目标物开始电泳分离。浙江工业大学硕士学位论文- - 聒嘲- - _ - - 4 ba 匕童意，黧獬擎警铲冬警爹弘匿夏二鐾窭亟匦蛰+i一、c 一巡薹翌二至二 之受翌翌羹圈+& 娥。，。刚。铷。4 ，d 一匹王歪玉瑶三三卫耍豳+气气一蔫掰“ 薅。鼢m “。图2 - 1 扫集过程示意图 8 3 f i g2 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fs w e e p i n g 8 3 根据目标分析物的不同，在线扫集技术中表面活性剂的种类有以下几种：阴离子和阳离子表面活性剂、非离子性表面活性剂、聚合物表面活性剂、带有磺酸基集团的环糊精和微乳液等都可以作为电泳过程中荷电的胶束相“】。t e r a b e 等 8 5 - 8 6 报道了在以不含表面活性剂的背景缓冲作为荷电胶束的情况下，用乙二胺四乙酸( e d t a ) 作为螯合剂，在区带电泳模式下对工厂用水中的痕量p d ( i i ) 、c u ( h ) 、z n ( i i ) 等金属离子进行在线富集实验，该方法可将上述离子的检测灵敏度提高5 - 6个数量级，最低检出限在2 4 2 5 2 1 0 1 1m o l l 之间。该方法最大的优点在于适用性强，中性物质和带电荷的物质都能再合适的条件下被富集，且操作简单、富集效率高，现用于商品化的毛细管电泳仪器上技术成熟。2 2 3 动态p h 联接动态p h 联接最初由c h e n 等8 7 】建立，是基于分析物在不同p h 值的背景缓冲液与样品基质里迁移速率不同而进行富集的一种在线富集技术，可用于富集两性离子组分和弱酸性的组分。z h a o 8 8 1 用该方法分析了4 种酚酸化合物，对羟基苯酸、香草酸、香豆酸和丁香酸，灵敏度提高了3 0 0 倍。动态p h 联接法还应用于苯胺的分析，不需要任何的预处理过程，采用u v 检测，与常规进样比较可提高灵敏度1 0 0 1 6 0 倍，最低检测限为p p b 级8 9 】。以动态p h 联接对阳离子化合物富集进行富集为例，如图2 - 2 所示。图2 - 2 a ，背景缓冲液( c t a c ，p h 为4 5 ) 充满整个毛细管，在此条件下，导入一段带正电荷的目标化合物样品( p h 为2 0 ) ；图2 2 b ，毛细管两端分别施加反向分离电浙江工业大学硕士学位论文压，背景缓冲液与样品区带以及两者形成的界面均在同一电渗流淌度下泳动，因为带正电荷的目标物同时受到朝着阴极方向电泳淌度的影响，所以带正电荷的目标物泳动速率要比电渗流小，在与i g s 之间形成的界面上因醋酸离子的导入，样品区带的p h 增加；图2 2 c ，带正电荷的目标物由于p h 值变化而发生质子化反应变转化为中性物质，富集发生。最后中性化和富集的目标物区带作为单独的区带迁移通过b g s 。另外，目标物在c z e 中和其他物质发生分离必须是部分带电。f o c u s i 髓鏊震鹋鬻黼趟剐 # _ _ _ 脚 臣藓翌墨= 添委囵黎辆鬻瓣瓣罐i a n 禁 匿墨委翟 二国翰f 黼辩臻蒜渊譬图2 - 2 动态p h 联接示意刚9 0 】f i g2 - 2s c h e m a t i cd i s g r a mo fd y n a m i cp hj u n c t i o n 9 0 2 2 4 样品堆积2 2 4 1 常规堆积模式常规堆积模式的基本原理是通过压力进样将溶解在低导介质中的样品泵到高导缓冲溶液中，由于样品离子在低导和高导介质中电泳速度的突变，目标物在两区域的边界处富集并达到分离的一种简单模式。采用压力进样时，原始进样长度( ，o ) 与堆积后样品区带长度( f t ) 有以下关系：木f ，|2 - 1 )c t = c o 宰y( 2 - 2 )其中，如为原始进样长度，c m ；v 为样品溶液中电场场强与背景溶液中场强之比，即e 。i s ：厶为堆积后样品区带长度，c m ；c o 为目标物原始浓度，m g l ；9浙江工业大学硕士学位论文c 。为堆积后样品浓度，m g l 。由公式( 2 1 ) 和( 2 2 ) 可知，y 值随着b g s 区带与样品区带两者电导率的改变而改变。y 值越大，检测灵敏度越好。由于在多数实验过程中，可能存在因样品区带和b g s 区带所形成的界面处聚集物的相互扩散与混和会造成丫值的降低、电导率发生改变和富集后的样品区带增宽 9 l 】等情况，从而会影响富集效果。扩散与混和很有可能是因为b g s 区带和样品区带两者的电渗速率存在差异导致的。1 ， 苴越大，区带增宽和层流效应越显著，而且电渗速率的改变随着进样时间的推进会使这种效应呈叠加形式出现。所以，随着导入样品量的增加，这种方法的分离效率越来越差，大概只能达到1 0 倍左右的富集效果。2 2 4 2 场放大进样场放大进样( f i e l da m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) 采用电动进样，最早由m i k k e r i l 蜊提出的。电动进样本身可达到一定的预富集效果，虽然一次进样只能进一种电荷的离子，但富集倍数可以提高很多。场放大进样是通过先引入低导溶液，如水，然后再引入高导溶液即b g s ，因为低导溶液的电场强度要远远大于b g s的电场强度，所以在样品被泵入后，在低导区的速度要比缓冲液区域的速度大得多，由于速度之间的差异，导致目标物在两区域的界面处发生聚集，从而达到了富集的效果。这一理论可以用如下的公式解释，当样品溶解在与运行缓冲溶液成分相同的稀缓冲溶液或纯水中时，待加上分离电压时，根据毛细管中电场强度分布可得如下的关系式：丝：丝：生( 2 - 3 )一= 一= 一z - 毛p oc s、其中，e 。和e b 分别为毛细管中样品区和其余缓冲液区的电场强度，v m ；p 。和p o 分别为样品溶液的电阻率和运行缓冲液( b g s ) 的电阻率，q m ；c s 和c b 分别为毛细管中样品区和其余缓冲液区的样品浓度，m o l l 。因为p 。 p o ，故e 。 e b ，样品离子在电场强度大的样品区被快速的驱使至界面处，但在进入到高浓度缓冲溶液区域，由于电场强度为e b 骤降，速度降低，从而导致样品目标物聚集在样品区带与b g s 形成的界面上，富集完成。b e r m u d o 等【9 3 1 人采用毛细管电泳场强放大富集法对食品中的丙烯酞胺类物浙江工业大学硕士学位论文质进行分析，标准品和实际样品中国标物的检测限分别达到了1n g l 和3n g g 。w e n g 等【9 4 】人将场放大进样技术与安培检测器联用，对人体尿液中的单胺物质进行检测，使目标物的检测灵敏度提高约5 0 倍。l a r a 等 9 5 1 人采取场强放大富集与胶束毛细管电泳同时测定了人体尿样中五种酚噻嗪物质，检测限约为2 5n g m l 。2 2 4 3 大体积样品堆积1 9 9 2 年，c h i e n 和b u r g i 提出大体积样品堆积技术【9 引。大体积进样( l a r g ev o l u m es a m p l es t a c k i n g ，l v s s ) 是通：过电压极性的转换来使原本很长的样品区带压缩来实现富集的。该方法中，样品区带长度一般占毛细管有效长度的1 3 到1 2 。施加负极性电压后，毛细管进样端流出因电渗流反向而推出的水介质，最后目标物( 阴离子化合物) 在样品区带和b g s 界面处堆积。目前这种方法广泛应用到对药物、染料、头发等中的酚类化合物和重金属物质的富集9 7 1 0 2 1 。l v s s 技术的关键在于监测负极性电压过程中电流的变化情况以保证良好的重现性。在进行电泳分离之前推出了大部分水介质( 电流值到达最初值的9 5 9 9 ) ，此刻就可以得到高的分离度。l v s s 的不足之处是只限于低淌度离子的分析，并且难以同时实施对阴、阳离子目标物的富集。解决方法是：若样品是阳离子，在降低电渗流，还要改变电渗流的方向，可以在b g s ( 低p h ) 中添加阳离子表面活性剂或者使用经过涂渍的毛细管1 0 3 j 0 4 】；若样品是阴离子，则可以在b g s ( 低p h ) 中添加阳离子表面活性剂或尽可能减小电渗流直至小于样品的电泳淌度。一般来说，通过调控电渗流的大小都可以满足实验的需要。2 2 4 4p h 调制堆积p h 调制堆积法最早是由l u n t e 等【1 0 5 1 提出的。p h 调制堆积法适用于高盐样品，如：尿液或血液等，因为本身含盐量较高，电导一般很高，用上面介绍的f a s s 和l v s s 法均无法实现对其的富集，而p h 调制堆积法可以通过改变分离缓冲溶液的p h 值使带电目标物的迁移速度甚至迁移方向发生改变来实现富集。其中碱堆积和酸堆积可分别应用在对阴离子和阳离子的富集1 0 6 。1 0 9 l 。富集阳离子时，溶解样品的缓冲体系是偏弱碱性：的，而运行缓冲溶液一般为偏酸性的，在进行富集前，需要在毛细管中引入一段强酸。对于阴离子富集，则反之。酸堆积的原理如图2 3 所示：( a ) 导入样品溶液；( b ) 导入强酸溶液，由二于毛细管内的偏碱性离子和h 发生中和反应，会在此出现低电导片段；( c ) 阳离：子则在低导区域加浙江工业大学硕士学位论文速运动至样品溶液和b g s 形成的界面上进而发生聚集；( d ) 阳离子目标物因淌度差异自发分成各自的区带并完成电泳分离。如图2 3 所示。而碱堆积常常需要在缓冲液中加入电渗流改性剂( 如t t a b ) 使电渗流改向，否则o h 无法进入毛细管形成低电导区域。”警塾= ；i9 矿4 4 4 * 4 _ 2 ia 瑟：菱麓黪势麓麓鬈愁譬= 芝篡愁黧麓黧黧黧熬黧篡篡纛纛纛= = 黝赫蚺赫撕m b 0 _ 薛b 豳朦峨蕊一c 圈豳黔一r _ _ de _ tvo ，爨粼溅徽慧黧纛溅燃渊瀚心篓拦拦警嚣麓溢省互鬣羹誓麓耥獭轳疆菱lb u f f e r溺黼n a o hl _ l i i 爨：蠓豢耩翱曝 麟藏爨毳l 转e 匹= ：叠l 辑辚韶酬瓣f i v r y 釜鼗图2 - 3 酸堆积原理示意图 1 1 0 】f i g2 - 3s c h e m a t i cd i s g r a mo fs t a c k i n g 1 1o 】2 2 5 暂态阱s u e y o s h i 等1 1 1 1 建立了基于胶束暂态阱( t r - t r a p p i n g ) 的富集分离方法，该方法和扫集类似的一点是样品制备需在不含胶束的溶液中进行。s u e y o s h i 提出，本方法与扫集的不同之处在于，当胶束浓度梯度穿过区带，由于胶束浓度的降低与电渗流连接，不会存在富集完成后由于在含胶束的中的扩散而立即展宽【1 12 1 ，因而灵敏度更好。其原理主要是基于捕捉和释放机理，采用将胶束区带区段灌注进行富集和分离。t r - t r a p p i n g 的富集过程如图1 6 所示，图1 6 a ，充满整个毛细管后，再灌注一段胶束区带：图1 6 b ，因速率不同在胶束区带两端溶液界面上形成胶束浓度梯度，当毛细管两端加上负电压后，目标物会在电渗流的作用下被暂时捕捉3 1s ，之后随着时间的推移，胶束浓度不断降低，时间起始位0 时刻时，目标物开始被释放。浙江工业大学硕士学位论文l a l矿敷# fl 簿图2 - 4 暂态阱分析示意副1 1 3 】f i g2 - 4c o n c e n t r a t i o np r o f i l ea n ds c h e m a t i cb r o a d e n i n go ft h em i c e l l a rz o n ei nt r - t r a p p i n g 1 1 3 】2 2 6 胶束解离堆积q u i r i n o 和h a d d a d 于2 0 0 8 ：年报道了在线富集技术( a n a l y t ef o c u s i n gb ym i c e l l ec o l l a p s e ，a f m c ) 1 1 4 o 富集的机理是将样品制备在含有高淌度阴离子的胶束溶液中，此溶液在电场力的作用下迁移到界面处并发生崩解，同时目标物也被释放到此界面上并富集。a f m c 的富集过程如图1 7 所示，在外加电场的驱动下，当携带样品的胶束迁移到样品区带和形成的界面上时，胶束由于浓度的减小而迅速崩解，当低于c m c 时，目标物被释放并逐渐富集。但是，由于舢m c 中样品区带的电导率较高，展宽效应导致扩散而影响了富集效率。g u i d i n g 等【1 1 5 1 首先在毛细管胶束电动模式下运用a f m c 技术，对可的松、氢羟肾上腺皮质素和强的松龙等3 类类固醇进行分离富集，灵敏度提高1 6 0 2 0 0倍。q u i r i n o 等将成功地将a f m c 应用到对二烷基邻苯二甲酸酯1 1 1 6 l 以及h y p o l i p i d a e m i c 类物质【1 1 7 1 等药物的富集研究中。要一一棼邕浙江工业大学硕士学位论文撩鞋舞漱满蛾蔼黔黛蕊一气鼍臻撵绷襄图2 - 5a f m c 分析过程示意图 1 18 】f i g2 - 5a n a l y t e si ne l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h yb ym i c e l l ec o l l a p s ei nad i l u t i o nz o n e 1 18 】2 2 7 胶束有机溶剂堆积胶束溶剂堆积( m s s ) 于2 0 0 9 年由q u i r i n o t l l 9 1 提出，是一种新型的样品在线富集技术。m s s 必须满足的条件有：( 1 ) 样品基质：是一段胶束区带，该区带中不含任何有机添加剂；( 2 ) 背景缓冲溶液：是一段加入了少量有机添加剂的无胶束区带；( 3 ) 样品区带所带电荷与基质中刚好相反。进样后，富集堆积便发生在样品分析物与胶束之间因电导差而形成的界面上。为了保证进样后的浓度骤变，且不会发生堆积或者不被稀释而迅速解离，m s s 通常要求样品基质电导与相近或二者相差不能超过4 0 。m s s 模式富集机理：施加电压后由胶束携带的目标物在电泳的作用下慢慢向两区域的界面处迁移，而此时，含有机溶剂的与胶束之间的作用力逐渐减弱甚至消失；目标物由于失去这种作用力而暴露在基质中，且会因为所带电荷相反而向着背离胶束的方向迁移，从而使目标物在界面处得到富集堆积。当所有由胶束携带的样品经过以上过程都迁移到界面处时，电泳开始。m s s c z e 分析方法虽然对带电荷的有机分析物效果明显，但在分析有机阴离子和有机阳离子时的方法上具有一定的局限性。当目标物为阴离子时，样品基质中需添加阳离子表面活性剂，采用反向电压；当目标物为阳离子时，则添加阴离子表面活性剂，采用正向电压【1 2 0 】。1 4竺錾l 器夏! 麴，一二鍪晶浙江工业大学硕士学位论文2 2 8 动态p h 联接扫集动态p h 联接主要是用于分析淌度随缓冲液p h 改变而变化的物质，对淌度小和中性的化合物则无效。若将它和扫集技术结合，不仅可以同时分析弱离子和中性化合物，且富集效率有叠加的效：果m 1 1 。在动态p h 联接扫集联用中，调节样品基质的p h ，保持与不同，同时将样品配置在不含p s 的介质中。动态p h 联接一扫集联用富集技术是通过缓冲液( ：比如硼酸盐的络合作用或s d s 的分配作用)以及样品区带间p h 值的差异而导致目标分析物在边界处聚集而达到富集效果的。y u 等【1 2 2 】运用动态p h 联接一扫集技术对中药中有毒的吡咯双烷类生物碱进行了分离和富集。2 2 9 选择性耗尽进样扫集选择性耗尽进样一扫集法( s e l e c t i v ee x h a u s t i v ei n j e c t i o n s w e e p i n g ，s e i s w e e p i n g ) 是样品堆积与扫集法两种在线富集方法的结合1 2 3 1 2 6 1 。由于分离是在m e k c 中完成的，此方法也可以称为s e i s w e e p i n g m e k c 。根据被分析物的特征，将该方法分为阴离子选择性耗尽进样- 扫集( a s e i - s w e e p i n g ) 和阳离子选择性耗尽进样扫集( c s e i s w e e p i n g ) 。阳离子选择性耗尽进样扫集( c s e i s w e e p i n g ) 是在施加正向电压作用下注导入样品，在施加反向电压的作用力下进行分离的一种富集技术，最初是由t e r a b e 1 2 7 1 等人提出来的。一般来说，都需要对进样时间进行优化，否则会导致富集效果的降低。阳离子选择性耗尽进样扫集法尤其适用于对带正电的物质的分离和富集，分离富集的灵敏度大大提高，最低检测限可降低大约l o 万倍。n