（纺织材料与纺织品设计专业论文）静电纺PLA丝素明胶复合管状支架的构建及其性能[纺织材料与纺织品设计专业优秀论文].pdf

静电纺p l a 丝素明胶复合管状支架的构建及其性能中文提要 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的构建及其小土4 厶匕f i e 中文提要 构建小口径管状支架用于组织工程血管是当前研究的热点。静电纺丝技术能够制 得纳米到亚微米级纤维，且制得的纤维具有高比表面积和孔隙率，可模仿细胞外基质 的组成和结构。采用静电纺丝技术开发组织工程血管具有特殊优势，不但可以模拟细 胞外基质的组成和结构，且可通过调整收集滚轴的直径以形成所需口径的管状结构。 本文通过静电纺丝法先将丝素与明胶共混，制得丝素一明胶纤维层( 内层) ，然后 丝素一明胶再与p l a ( 外层) 复合，制备了p l a 丝素一明胶复合管状支架。首先，研 究不同质量比例、纺丝液质量分数、滚轴转速等工艺条件对丝素一明胶管状支架的形 貌结构、孔隙率、微细结构和溶失率的影响，以确定静电纺丝素一明胶纤维层的最佳 工艺，并在其上种植细胞，研究其生物相容性；其次，研究不同纺丝液质量分数、滚 轴转速、管壁厚度及乙醇处理等条件对p l a 管状支架的形貌结构、孔隙率和生物力 学性能的影响，以确定静电纺p l a 纤维层的最佳工艺条件；第三，采用上述最佳工 艺条件制备p l a 丝素一明胶复合管状支架，测定该复合管状支架形貌结构、孔隙率和 生物力学性能；最后，通过细胞培养、溶血实验和短期皮下植入试验研究其生物相容 性，为其成为一种良好的组织工程血管支架提供实验依据。 结果表明：制备丝素- 日月胶纤维层的最佳工艺条件为丝素一明胶质量比例7 0 ：3 0 、 纺丝液质量分数1 3 、滚轴转速1 0 0 0 r m i n 、电压3 0 k v 、极距1 3 c m ，需经乙醇处理； 制备p l a 纤维层的最佳工艺条件为纺丝液质量分数5 、滚轴转速2 0 0 0 r r a i n 、电压 2 5 k v 、极距1 5 c m ，需经乙醇处理；静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架具有较高的 孔隙率和优异的生物力学性能，其拉伸强度、爆破强度和缝合强度均达到血管移植要 求；经乙醇处理后，复合支架的生物力学性能显著提高，在水中稳定性较好，几乎不 溶于水；小鼠胚胎成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞均可在其上粘附、生长和增殖；复 合管状支架的溶血率为3 2 ，符合生物材料溶血试验要求；皮下植入试验显示支架 周围肌肉组织中没有巨噬细胞和淋巴细胞，没有引起组织炎症反应。实验结果表明该 l 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的构建及其性能 中文提要 复合管状支架可作为一种良好的组织工程血管支架。 关键词：静电纺丝；丝素；明胶；p l a ；管状支架；组织工程血管 n 作者：王曙东 指导教师：张幼珠 静电纺p l a 丝素明胶复合管状支架的构建及其性能 a b s t r a c t f a b r i c a t i o na n dp r o p e r t i e so ft h ee l e c t r o s p u n p o l y l a c t i d e s i l k f i b r o i n - g e l a t i nc o m p o s i t et u b u l a rs c a f f o l d a b s t r a c t f a b r i c a t i n gs m a l l - d i a m e t e rt u b u l a rs c a f f o l df o rt i s s u ee n g i n e e r i n gb l o o dv e s s e li sah o t r e s e a r c h c u r r e n t l y e l e c t r o s p i n n i n gt e c h n o l o g yc o u l do b t a i nn a n o s c a l et om i c r o s c a l e d i a m e t e rf i b e r s ，t h ef i b e r sc a np r o v i d eab i o m i m e t i ce n v i r o n m e n tw i t hh i g hs u r f a c ea r e at o v o l u m er a t i oa n dp o r o s i t yt h e r ea r ep a r t i c u l a ra d v a n t a g e st od e v e l o pt i s s u ee n g i n e e r i n g b l o o dv e s s e lv i ae l e c t r o s p i n n i n g ，b e c a u s ei tn o to n l yc a n p r o v i d eab i o m i m e t i c e n v i r o n m e n t ，b u ta l s oc o u l dp e r f o r mat u b u l a rs t r u c t u r ew i t han e e d e dd i a m e t e rb y a d j u s t i n gt h ed i a m e t e ro ft h em a n d r e l - t y p ec o l l e c t o r i nt h i s t h e s i s ，ac o m p o s i t et u b u l a rs c a f f o l do fp l af i b e r s ( o u t e rl a y e r ) a n ds i l k f i b r o i n ( s f ) - - g e l a t i nf i b e r s ( i n n e rl a y e r ) w a sf a b r i c a t e db ym u l t i - e l e c t r o s p i n n i n gu s i n ga r o t a t i n gm a n d r e l - t y p ec o l l e c t o r , i e ，f i r s ts f - g e l a t i na n dt h e np l aw e r es e q u e n t i a l l y e l e c t r o s p u n ( p l a s f - g e l a t i n ) f i r s t l y , t h ea u t h o rr e s e a r c h e dt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n t t e c h n i c a lp a r a m e t e r s ，s u c ha s q u a l i t yr a t i o ，c o n c e n t r a t i o n ，r o t a t i n gs p e e d ，e t c ，o nt h e m o r p h o l o g y , p o r o s i t y , m i c r o s t r u c t u r ea n dw a t e r - d i s s o l v e dr a t eo ft h es f - g e l a t i nt u b u l a r s c a f f o l d ，a n df i xo nt h eo p t i m u mt e c h n i c a lp a r a m e t e r so fe l e c t r o s p u ns f - - g e l a t i nl a y e r s e c o n d l y , t h em o r p h o l o g y , p o r o s i t y , b i o m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so ft h ep l a t u b u l a rs c a f f o l d a f f e c t e db yc o n c e n t r a t i o n ，r o a t a i n gs p e e d ，w a l lt h i c k n e s s ，a n de t h a n o lt r e a t i n g ，e t s ，w e r e i n v e s t i g a t e d ，a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ft h ee l e c t r o s p u np l al a y e rw e r ef i x e d f i n a l l y , t h ep l a s f - g e l a t i nc o m p o s i t et u b u l a rs c a f f o l dw a sf a b r i c a t e dw i t ht h eo p t i m u mt e c h n i c a l p a r a m e t e r sv i ae l e c t r o s p i r m i n g m o r p h o l o g i c a la n db i o m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s o ft h e c o m p o s i t es c a f f o l dw e r ee x a m i n e d ，i np a r t i c u l a r , t h eb i o c o m p a t i b i l i t yo ft h es c a f f o l d sw e r e e v a l u a t e d 讥v i t r oa n di nv i v ob ym e a n so fc e l lc u l t u r e ，h e m o l y s i st e s ta n ds u b c u t a n e o u s i m p l a n t a t i o nt e s t t h er e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ： t h eo p t i m u mt e c h n i c a lp a r a m e t e r so f e l e c t r o s p u ns f - - g e l a t i n ( q u a l i t yr a t i o7 0 ：3 0 ) l a y e r a n dp l a l a y e rw e r es e ta sf o l l o w s ( 1 i s t e di nt h eo r d e ro fv o l t a g e ，p o l a rd i s t a n c e ，f l o wr a t e a n dm a n d r e lr o t a t i n gs p e e d ) ：( a ) s f - g e l a t i n ：3 0 k v , 13 c m ，0 2 m l ha n d1 0 0 0r e v o l u t i o n sp e r 静电纺p l v 丝素明胶复合管状支架的构建及其性能 a b s t r a c t m i n u t e ( r p m ) ；( b ) p l a ：2 5 k v , 1 5 c m ，o 1 m l ha n d2 0 0 0 r p m t h ee l e c t r o s p u np l a s f - g e l a t i n c o m p o s i t es c a f f o l dp o s s e s s e d ap o r o u ss t r u c t u r ea n de x c e l l e n tb i o m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，a l l t h et e n s i l es t r e n g t h ，b u r s tp r e s s u r es t r e n g t ha n ds u t u r er e t e n t i o ns t r e n g t ho ft h ec o m p o s i t e s c a f f o l dr e a c h e dt h ec r i t e r i o nf o rv a s c u l a rg r a f t a f t e re t h a n o lt r e a t m e n t ，t h eb i o m e c h a n i c a l p r o p e r t i e so ft h ec o m p o s i t es c a f f o l di n c r e a s e dr e m a r k a b l e l y , a n dt h e s c a f f o l dc o u l d d i s s o l v ei nt h ew a t e rh a r d l y b o t h3 t 3m o u s ef i b r o b l a s t sa n dh u m a nu m b i l i c a lv e i n e n d o t h e l i a lc e l l s ( h u v e c s ) c a na d h e r e ，g r o wa n dp r o l i f e r a t eo nt h ec o m p o s i t es c a f f o l d t h eh e m o l y t i cr a t eo ft h ec o m p o s i t es c a f f o l dw a s3 2 ，w h i c hf u l f i l st h en e e do f h e m o l y s i st e s to nb i o m a t e r i a l s t h es u b c u t a n e o u si m p l a n t a t i o nt e s ts h o w e dt h a tt h e r ew e r e f e w e rm a c r o p h a g e sa n dl y m p h o c y t e sw e r eo b s e r v e d ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ec o m p o s i t e s c a f f o l dc o u l di n d u c em i n o ri n f l a m m a t o r yr e a c t i o n si nv i v o t h et e s tr e s u l t ss h o wt h a tt h e e l e c t r o s p u np l a s f - g e l a t i nc o m p o s i t et u b u l a rs c a f f o l dp r e s e n t sa p p r o p r i a t ec h a r a c t e r i s t i c s t ob ec o n s i d e r e dac a n d i d a t es c a f f o l df o rt i s s u ee n g i n e e r i n gb l o o dv e s s e l 。 k e yw o r d s ：e l e c t r o s p i n n i n g ；s i l kf i b r o i n ；g e l a t i n ；p l a ；t u b u l a r ；t i s s u ee n g i n e e r i n g b l o o dv e s s e l i v w r i t t e n b ys h u d o n gw a n g s u p e r v i s e db yy o u z h uz h a n g 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学 或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律 责任。 研究生签名：壮日 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 期： 期： 静电纺p l a j 丝素一明胶复合管状支架的构建及其性能第一章序言 第一章序言 心血管类疾病严重危害人类身体健康，血管重建在临床外科中具有十分重要的地 位，仅美国一年就有1 4 0 万例动脉旁路移植手术，大多数需要合适的血管移植物【l 】。 自1 9 5 2 年v o o r h e e s l 2 首次研制成功维纶人造血管，并于次年用于临床取得成功以来， 人们陆续开发出各种材料，多种成型方法的人造血管。目前大口径的人工血管( 6 l m n ) 替代人体大中动脉( 如腹主动脉、髂动脉等) 已获得广泛的成功，而小口径人工血管( 6 m m ) 替代人体小动脉和静脉却一直未获得满意的效果，远期通畅率不高【3 1 。目前小口 径血管重建仍多采用自体血管移植。然而，由于自体可供采集的血管数量有限，或者 由于患者自身原因而不能使用自体血管，因此研制一种优良的小口径血管替代品就显 得特别迫切。 现在普遍采用的移植血管主要是用涤纶( d a c r o n ) 、尼龙( n y l o n ) 和聚四氟乙烯 ( e p t e f ) 等非降解材料编织而成，但这些材料不支持内皮细胞的粘附和生长，血管难 以充分内皮化，此外，材料不降解，对血管的长期适应性也造成障碍。随着组织工程 学的发展，构建组织工程化血管日益受到国内外专家学者的重视。1 9 8 6 年w e i n b e r g 等 【4 】用胶原和血管壁细胞在体外首次构建了组织工程血管( t i s s u ee n g i n e e r i n gb l o o d v e s s e l ，t e b v ) 。 1 组织工程血管的研究现状 1 1 组织工程血管的定义 组织工程学是2 0 世纪8 0 年代提出的- f 7 新兴交叉学科。组织工程的先驱性工作可 以追溯n y a n n a s 等的开创性研究，他们尝试用胶原和糖胺聚糖构建人工皮肤类似物。 最先用“组织工程”这一名词的学者是w o l t e r 和他的同事们，他们在眼科植入物研究中 观察到聚甲基丙烯酸甲酯( p m m a ) 表面形成了内皮样结物。1 9 9 3 年v a c a n t ijp 等【5 】在 s c i e n c e 上发表了一篇名为t i s s u ee n g i n e e r i n g 的文章，首次定义了组织工程学，即一 静电纺p l ，丝素棚腔复音管状支架的椅建厦其性能第一t 曼童 门运用工程学和生命科学的原理和方法，研究正常的和病理的哺乳类组织的结构和功 能的相互作用，开发研究能修复损伤组织和器官形态和功能的生物替代品的科学。 组织工程血管是一种用组织工程的方法构建具有良好的生物相容性和力学特性 的血管替代物，其基本构件是血管支架和种子细胞，根据支架材料和种子细胞的不同 以及支架材料和种子细胞的不同组合，组织工程血管的构建有许多模型。无论哪种构 建模型，组织工程血管都应具有如下条件陶：( 1 ) 具有如图l 所示的模拟体内血管壁 三层结构，即外膜、中膜和内膜：( 2 ) 具有生物相容性，不易产生血栓，不易发生免 疫排斥反应：( 3 ) 具有生物学特性，如对药物刺激有舒缩反应；( 4 ) 具有血管的力学 特性。即有粘弹性和能承受一定的压力。 内腹 中腱 ，l 履 图1 血管壁三层结构示意图 1 2 组织工程血管的材料 理想的组织工程材料应该具有以下特点m ：无毒性，即无论材料本身还是其降解 产物都不能产生炎症和毒性反应；良好的生物相容性；生物可降解性及降解可调节性； 不引起机体免疫排斥反应：可塑性和一定的机械强度；良好的表面活性，即具有三维 立体多孔结构，有利于细胞粘附、生长、增殖。总之，在构建组织工程血管时必须提 供具有特定三维的立体( 管状) 支架，作为血管细胞种植的基质材料，使接种细胞能 定位、粘附、局域化生长增殖，同时材料可使细胞在支架空间分布排列有序，分化具 有特定功能并合成适当的细胞外基质( e c m ) ，再者组织工程血管移植机体内时支架 材料还应兼有力学支持功能，抗血流压力等，此类材料根据来源及性质可分为天然材 料，人工合成材料和复合材料( 即将天然材料与台成材料进行复合) 。 1 2 1 天然材料 天然的支架材料来源于生物体，具有良好的细胞亲和力，能为细胞生长、第殖、 分化提供近似体内组织发育的e c m 支架条件，其生物相容性、顺应性以及免疫排斥 静电纺p l a t 豢棚胶复合管状盘槊的构建丑其性能磬一章序言 性低等特点优于合成材料。天然生物材料分为大分子结构材料，如丝素蛋白、胶原蛋 白、弹性蛋白、壳聚糖、明胶等；脱细胞组织基质材料，如脱细胞真皮基质、脱细胞 血管基质等。 w e i n b 唧和b e l l 离首先建立了以胶原蛋白和血管细胞在体外培养构建血管模型， 该组织工程血管外膜完整并能分螂血管性血友病因子( v w f ) 和肝素，作为中膜成 份平滑肌细胞( s m c s ) 生长分化均良好；b o r s c h e l 口从鼠髂动脉获取脱细胞血管基质， 再种植鼠血管内皮细胞，将制各的组织工程血管植入同基因鼠股动脉，术后未抗凝治 疗，4 周后其通畅率为8 9 ，组织学染色可见其腔面完全内皮化，并见向血管壁长入 的平滑肌细胞；w i l s o n 等1 9 ) 用犬颈动脉脱细胞血管基质为支架，作异体冠状动脉旁 路移植，术后不使用抗凝药物，观察4 年通畅率达9 3 ，无血栓和动脉瘤发生，在生 理血压范围内，柔顺性与正常动脉相同；h a r d i n g sl l ”1 等用纯天然人体蛋白做组织工 程学血管支架，作冠状动脉旁路移植，支架为h u m a n f l b r o n e c t i n ( 6 5 ) 和f i b f i n o g e n ( 3 5 ) 的混合物，其弹性、抗压强度、抗拉强度均比较令人满意，生物相容性明显好于 一般人工台成材料；张幼珠等1 制备了丝素明胶共混纳米纤维组织工程支架，并在 该支架上进行小鼠成纤维细胞( l 9 2 9 ) 和人脐静脉内皮细胞( h u v e c s ) 培养实验，实 验显示细胞在该支架上生长良好，为将该支架制造成组织工程血管打下基础，图2 是 h u v e c s 在该维织工程支架上培养一段时间后的扫描电镜( s e m ) 图。 图2 h u v e c 培养一段时间后s e m 图：( a ) 5 天，( b ) 2 1 天 1 2 2 合成材料 合成材料主要是高分子聚合物材料，分为生物非降解聚合物材料和生物降解聚台 物材料。早期曾采用非降解的合成材料制作血管替代物，如聚甲基丙烯酸甲酯 ( p m m a ) ，膨化聚四氟乙烯( e p t e f ) ，涤纶( d a c r o n ) 等。但是由于这些材料不能降解， 构建的血管不具各血管收缩性且易发生吻合口处内膜增生，这些非降解材料逐渐被淘 静电纺p l a 丝素- 明胶复合管状支架的构建及其性能第一章序言 乇瓯c h 哇3 4 壬j ( c h 2 畦 取越越犁艄脚och2ch2c畦密ch2(。h哇(3 取唧k 甲c 掣吐苷吐 - 1 3 一 亡h 3 “ 4 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的构建及其性能第一章序言 胞亲和性还不能满足组织工程和其他生物医用领域飞速发展的需要。因此，设计与合 成新型的生物材料，尤其是针对不同组织与器官的具体要求而进行专门设计，是聚合 物组织工程材料发展的重要方向之一。如将天然材料与合成材料进行复合，制备兼有 二者优点的新型材料，是近年来组织工程材料研究的重点。 1 2 3 复合材料 天然生物材料和合成材料都存在一定的不足，将两者按照一定的方法予以组合可 构建成一种复合基质，可以发挥两者的各自优势。高分子合成材料可以提供一个稳定 的环境并且可塑造成各种形状，生物材料在维持组织完整、保护实质细胞、介导信号 传导、调控细胞表型、诱导细胞粘附、增殖、分化和移行等方面具有不可忽视的作用。 近年来，复合材料是组织工程学研究的重点，有关复合材料制各组织工程血管已有大 量报道。 熊猛【1 5 】通过用交联胶原包埋处理聚羟基乙酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ，p g a ) ，形成胶原 加聚羟基乙酸管形支架，并接种牛血管内皮细胞于其内腔面，采用动态旋转培养技术 体外培养l o 天，该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状，内 皮细胞在其内表面形成较完整内皮细胞层，覆盖率约( 7 2 6 士3 5 ) ，表明此材料可以作 为组织工程血管的较理想支架：h e 等 1 6 1 以胶原和可降解的纳米纤维共聚物 【p o l y ( 1 l a c t i d - c o - e - c a p r o l a c t o n e ) ，p ( l l a - c l ) 按7 0 ：3 0 的比例制备血管支架，其纤维直 径为1 0 0 , - 一2 0 0 n m ，并种植人的冠状动脉内皮细胞体外静态培养，结果证实细胞能在 表面良好生长，具备良好的粘附能力，能保持原来的细胞表型，表明有望作为血管组 织工程理想的支架材料；潘勇等f ”1 将p g a 纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶 原纤维相混合，构建组织工程血管支架，证明胶原包埋处理的p g a 纤维无纺网是良好 的携带血管平滑肌细胞的多孔生物降解材料。 1 3 组织工程血管的制备方法 作为有效的细胞支架，光有材料本身是不够的，组织工程血管的关键技术之一在 于将生物材料制成具有特定形状和孔结构的三维管状支架。研究表明管状支架的形态 结构、孔隙率的大小、生物力学性能的好坏等因素对细胞在支架上的生长、增殖、分 化以及支架移植手术等具有重要的影响，而这些因素与采用的制备方法有直接关系。 对于组织工程血管学来说，由于血管形状变异较大，对支架的形状构造的要求不如骨、 5 静电纺p l a 丝素明胶复合管状支架的构建及其性能第章序言 软骨支架那么严格，因此，血管支架的设计和力n 7 - l l 较简单，甚至h e u r e u x 等f 1 翻报道 不依赖支架，直接用s m c 和皮肤成纤维细胞培养获得组织工程血管。然而，产业化 生产和进入临床应用是组织工程研究的最终目的，随着对带瓣膜的静脉、冠状动脉、 心脏瓣膜等具有复杂结构的组织工程血管支架研究的深入，设计和加工技术的提高就 显得十分重要。目前，制备组织工程血管支架的方法主要有溶液浇铸颗粒滤沥法、 气体发泡法、相分离法、快速成型法以及近年来出现的静电纺丝法。 1 3 1 溶液浇铸颗粒滤沥法 溶液浇铸颗粒滤沥法通常采用一定粒径的水溶性无机盐或糖类晶体作为致孔 剂，将其均匀分散于聚合物溶液中，然后在模具中浇铸成膜，待有机溶剂挥发后，得 到聚合物致孔剂复合物，通过热处理可获得适当的结晶度；最后用水洗出致孔剂即 可获得不同结晶度的多孔管状支架。用该技术可以制备出孔隙率高达9 0 以上、孔隙 相互通透的管状支架。其孔径大小由致孔剂的粒径控制，孔隙率通过致孔剂与聚合物 溶液的比例调节，支架的结晶度由热处理条件控制1 9 1 。由于溶液浇铸颗粒滤沥法简 单方便、使用性广，成为组织工程血管的常用制备技术。其不足之处在于支架的孔隙 形态及连通性不够理想，且必须使用有机溶剂和水，这严重阻碍了水溶性生物活性物 质与支架的复合，另外还可能会残留少量有机溶剂。 1 3 2 气体发泡法 气体发泡法【2 0 i 采用气体作为致孔剂，在制备过程能够避免使用有机溶剂。通常是 将聚合物置于高压c 0 2 中至饱和或超临界状态，然后迅速降至常压，形成多孔管状 支架，孔隙率在9 0 以上，但孔与孔之间多为非连通结构。发泡法中影响孔隙率和孔 结构的因素主要有聚合物分子量和结晶性、平衡时间、降压速度等。此方法有利于将 生物活性物质引入支架中，实现持续释放。将此方法和溶液浇铸粒子沥出法相结合 后可显著改善孔的连通性及孔径大小。 1 3 3 相分离法 相分离法又称冷冻干燥法，是将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻，使其 发生相分离，形成聚合物富集相和溶剂富集相，然后置于模具中，迅速冷却，再经冷 冻干燥除去水分和溶剂，即得到多孔管状支架。支架孔隙率可达9 1 - 9 5 ，大孔尺寸 达2 0 0 1 a m ，但孔的尺寸总体较小。影响因素主要有油水比、聚合物溶液浓度和聚合物 6 静电纺p l a 丝素明胶复合管状支架的构建及其性能第一章序言 分子量【2 n 。该法避免了高温，有利于生物活性物质的引入和控制释放，但必须考虑有 机溶剂的影响。 1 3 4 快速成型法 这是一种来自机械制造领域的支架制备方法，它主要采用离散堆积原理，先由 c a d 软件设计出管状支架的三维实体模型，然后根据工艺要求，把三维模型按一定 厚度进行分层，得n - 维截面信息；再将分层后的数据进行处理，转化成数控代码， 在计算机控制下数控系统以平面加工方式有序连续地加工出每一个薄层，并使它们自 动粘结成型，这样就把复杂的三维成型问题变成了一系列简单的平面成型问题。其中 三维打印【2 刁和熔融堆积成型【2 3 1 是目前用于组织工程血管支架制备的两个主要的快速 成型方法。快速成型法优点在于快速性和高“柔性”：可根据不同的个体，迅速制备出 符合个体特征的多孔管状支架，成型时间短，利于大规模的生产。其不足之处在于支 架孔隙率偏低，通常小于8 0 ，成型精度也有待提高。 1 3 5 静电纺丝法 根据细胞外基质由5 0 - - 5 0 0 r i m 纤维构成的特点( 2 4 】，可以通过不同方法构建由纳 米纤维组成组织工程血管支架。纳米纤维具有高比表面积、多孔结构，更有利于细胞 的粘附、生长及增殖。目前形成纳米纤维细胞支架的方法主要有相分裂、自组装和静 电纺丝法，但只有静电纺丝法可直接形成管状结构。静电纺纳米纤维开发组织工程血 管具有特殊优势，因为它不但能够形成所需口径的管状结构，特别是能够制备3 6 m m 口径的血管，而且能够模仿细胞外基质的组成和结构，为细胞提供良好的生长 环境，为自体血管的再生和重建提供重要前提。静电纺丝法制备组织工程血管支架是 将高聚物溶液或熔体在高压静电作用下不断分化和拉伸形成纳米纤维，通过高速旋转 的滚筒收集方法，获得平行排列或无纺布状排列的纳米纤维管。目前，天然材料如丝 素蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶【2 5 。2 8 1 ；人工合成材料p l a 、p c l 、p l g a 、p g a 2 9 - 3 1 等均可进行静电纺丝制备组织工程血管支架。 7 静电姊p 皑寮期胶复台譬状支架的拘建及j 性能 筇一常序言 2 静电纺丝与组织工程血管支架 2 1 静电纺丝技术简介 静电纺丝法( e l e c t r o s p i n n i n g ) 是一种利用高分子溶液或熔体在强电场作用下形 成的喷射流进行纺丝的工艺，是目前制备高分子微、纳米纤维的一个重要方法。其基 本原理是电场对带上几千到几万伏高压静电的聚合物溶液或熔体作用，当聚合物溶液 或聚合物熔体表面上的电场力克服其表面张力时，在电场力作用下喷射形成一股稳定 的流体。射流拉伸成一直线至定距离，然后弯曲，进而成循环形或螺旋形路径行走。 静电力使射流伸长数千倍甚至数万倍，于是射流变的非常细。最后溶剂挥发或熔体固 化，带电流体在电场力作用下被收集装置( 平板或滚轴) 收集，产物是由微、纳米级 纤维组成的无纺布状的纤维或呈平行排列的膜( 管) ，其示意图如图4 所示。 ( a ) 图4 静电纺丝装置示意图：( a ) 平板收集装置：( b ) 滚轴收集装置 早在1 9 世纪末，r a y l e i g h l 3 2 僦把电纺丝作为电喷洒的一部分首先进行了报道： 1 9 3 4 年，f o 啪a l 拈l 划设计出了第一台静电纺丝装置，并申请了相关专利，但由于纺丝 工艺很难稳定，生产效率低下，一直来得到人们的重视：随着纳米科技的迅速升温， 这种可制各纳米纤维的纺丝技术引起了人们的极大兴趣，从静电纺丝介质、工艺参数 的探索和高聚物、溶剂的选择到纺丝过程的理论分析、数学模型的建立已有大量报道 【”删；而近来，国内外学者更着重于静电纺丝在实际应用方面的研究，特别是静电纺 丝产品应用于生物医用材料，已成为研究热点。 2 2 静电纺丝技术用于制备组织工程血管支架的优势 在应用于组织工程血管支架制各时，相比以往的支架制备技术和以往所得支架， 静电纺丝具有以下一些优点：对设备和环境条件要求不高，易于实现；此法在常温下 摹 蒸 昆 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的构建及其性能 第章序言 进行，可避免高温引起的聚合物降解、支架变形等情况，且温和的制备条件有利一些 生物活性因子的复合；溶剂在纺丝过程中挥发较为彻底，减小溶剂残留对细胞生长可 能带来的影响：制备过程中不需使用致孔剂，不会出现致孔剂去除不全的问题，且孔 隙间贯通性好；比起纤维连接法中用传统熔融纺丝或溶液纺丝制得的纤维，此方法能 得到更细的超细纤维，从几十纳米到几微米，因此所得支架具有更大的比表面积，能 为细胞生长提供更多的表面；从支架结构形貌上看，静电纺丝支架能更好地在形态上 模拟细胞外基质( e c m ) ；更为重要的是，采用不同管径的滚轴收集装置，可以形成不 同口径的管状支架，满足了外科手术中对口径的要求。 2 3 静电纺丝制备组织工程血管支架的研究现状 静电纺丝开发组织工程血管具有特殊的优势，因为它不但能够形成所需口径的管 状支架，特别是能够制备3 - - 一6 m m 口径的血管，而且能够模仿细胞外基质的组成和结 构，为细胞提供良好的生长环境，为自体血管的再生和重建提供重要的保障。目前已 有关于静电纺丝法构建组织工程血管支架的报道。 h h - o y u k i 等【4 1 】通过静电纺丝法制备了p l c l 管状支架，并重点对其顺应性进行测 试，探讨了管壁厚度对其力学性能的影响( 图5 ) ，研究表明该管状支架是一种顺应 性较好的组织工程血管支架；c m v a z 等【4 2 】通过多层静电纺丝法制备了p l a p c l 双 层复合组织工程血管支架，研究了其孔隙率和孔径等形态结构，表征了其力学性能， 并在支架上培养小鼠胚胎成纤维细胞( 3 t 3 ) 和人体静脉肌成纤维细胞( h v s ) ；s a n g j i nl e e 等【4 3 】制备了静电纺p c l 及p c l 与胶原蛋白共混的管状支架，在两种支架上种 植小牛平滑肌细胞( b s m c s ) 并与普通培养板进行对照，结果显示( 图6 ) p c l - ) 咬原 共混管状支架具有较好的生物相容性。 窆 塑 星 acp 不同誓壁厚度的管状支架：a - d 管壁厚度增加 图5p l c l 支架的顺应性图6b s m c s 在支架上的生长情况 t e l e m e c o 等【删通过静电纺丝法制备了p g a 干l a 组织工程支架，并将该支架植入 9 静电纺p w 丝素埘胺复台管状烹架的构建& 翦性能 第一覃序言 小鼠体内进行毒性测试，结果( 图7 ) 表明该支架与组织相容性较好，是一种无毒 无刺激性的良好组织工程血管支架。 ( a )( b ) 【cj 图7p g a - p l a 支架的毒性测试：( a ) p g a - p l a 支架；( b ) 一( c ) p g a - p l a 与组织的相容性 3 本论文的研究目的、内容、创新点及意义 3 1 研究目的 小口径血管重建己成为医学界的难题，近年来组织工程学的建立和发展成为解决 此类难题行之有效的方法，它的基本途径是根据细胞外基质的结构组成，形成具有高 度仿生的支架，种植种子细胞，通过材料的组成与构造引导细胞的生长和功能重建， 开发有效的替代物以用于临床。当前组织工程血管支架研究的重点是采用具有良好生 物性能的天然及合成高聚物，根据细胞外基质蛋白由微、纳米级纤维构成的特点，形 成由微、纳米级纤维组成的支架引导细胞增殖、扩展和分化并最终实现血管的再生， 而静电纺丝技术正是制各微、纳米级纤维的一种重要方法，且该技术可以阻滚轴作为 收集装置并通过改变滚轴的直径来获得所需口径的管状支架。 丝素和明胶均为天然蛋白，具有良好的生物相容性和可降解性。k i m 【4 ”和 i o n a t h a n i “1 制备了丝素纳米纤维膜，m i n i ”j i n t 4 7 1 等人则利用纯丝素纳米纤维培养了 人角化细胞( h u m a nk e r a t i n o c y t e s ) 、成纤维细胞，人骨髓基质细胞( h u m a nb o n e m a f i t o w s n - o m a lc e l l ) 研究其作为伤口包覆、细胞支架材料的可行性。胶原是细胞外基质成份， 明胶是胶原经温和断裂后的产物，是一种水溶性蛋白质。明胶与胶原具有相同的化学 组成，保留了胶原大部分的优电理化性能，与生物维织具有良好亲和性。z h e n g - m i n g h u a n g 进行了明胶的静电纺丝，y _ z 动a n 窑进一步研究了静电纺明胶纤维支架的交联井 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的构建及其性能第一章序言 在该支架上成功培养了人体成纤维细胞【4 8 “9 】。然而，丝素和明胶通过静电纺丝形成 的由纳米纤维组成的支架力学性能较差，在水中易溶解。目前主要采用化学( 甲醇、 乙醇、戊二醛等有机溶剂) 交联的方法，通过改变纤维内部微细结构提高强度，降低 溶解性，但化学处理后支架的尺寸稳定性差，且支架易变脆。聚乳酸( p l a ) 对人体 无害，无积聚，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且其降解产物二氧化碳和 水都能参与人体的新陈代谢，因此被广泛应用于生物医用材料。v a z 4 2 】等采用静电纺 丝法制备了p l a p c l 组织工程血管支架，支架具有良好的力学性能和较高的顺应性， 且能够支持成纤维细胞的生长和增殖，但是由于p l a 、p c l 的结构中含有大量的疏水 性基团，导致支架亲水性差，缺乏细胞识别信号，在一定程度上限制了细胞的生长。 本课题通过静电纺丝法先将丝素与明胶共混，制得丝素一明胶层( 内层) ，然后丝 素一明胶再与p l a ( 外层) 复合，制备p l a 丝素一明胶复合管状支架，丝素明胶层具有 良好的生物相容性可供于培养细胞，p l a 层主要是提高支架的力学性能，这样充分 发挥其各自优点，又互相弥补对方的缺点。不仅可开发一种具有高强度和柔韧性、低 溶失率，尺寸稳定性好并具有良好生物相容性和生物可降解性的组织工程血管支架， 而且为研究组织工程支架提供实验和理论依据。 3 2 研究内容 本文将静电纺丝技术应用到制备组织工程血管支架上，制备p l a 丝素一明胶复合 管状支架，研究内容主要分为下面几个部分： 3 2 1 静电纺p l a 管状支架的结构及其生物力学性能 将p l a 溶解于氯仿、丙酮的混合溶剂中，制得均匀纺丝液，进行静电纺丝，以高 速旋转的滚轴为收集装置，制各p l a 管状支架。首先，研究不同纺丝液质量分数、 滚轴转速对p l a 管状支架形貌结构与纤维直径的影响；其次，研究不同纺丝液质量分 数、滚轴转速、管壁厚度对管状支架孔隙率的影响；最后研究不同纺丝液质量分数、 滚轴转速、管壁厚度及有机醇处理对管状支架的生物力学性能( 拉伸性能及爆破强度) 的影响。并确定静电纺p l a 管状支架的最佳工艺，为制备p l a 丝素一明胶复合管状支 架的力学性能提供实验基础。 3 2 2 静电纺丝素一明胶管状支架的结构及性能 将再生丝素和明胶溶解于同一种溶剂甲酸中，制得均匀纺丝液，进行静电纺丝， 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的构建及其性能第一章序言 制各丝素一明胶管状支架。首先，研究丝素一明胶质量比例、纺丝液质量分数、滚轴转 速对管状支架形貌直径的影响；第二，研究纺丝液质量分数、滚轴转速、管壁厚度对 支架孔隙率的影响；第三，研究了丝素一明胶管状纤维支架及其经有机醇处理后的微 细结构；第四，研究不同纺丝液质量分数及有机醇处理对支架在水中溶失率的影响； 最后，在该支架上种植人脐静脉内皮细胞，研究其生物相容性。并确定静电纺丝素一 明胶管状支架的最佳工艺，为制备p l a 丝素一明胶复合管状支架进行细胞培养实验奠 定基础。 3 2 3 静电纺p l a j 丝素一明胶复合管状支架的结构与性能 采用静电纺丝素一明胶、p l a 管状支架的最佳工艺条件，制备p l a 丝素一明胶复合 管状支架，先在滚轴收集装置上制备丝素一明胶管状支架( 内层) ，再将p l a ( 外层) 喷在制备好的丝素一明胶管状支架上，耳p s j j 得p l a 丝素一明胶复合管状支架。首先，对 复合管状支架的形貌结构、孔隙率及孔径进行表征；其次，对其拉伸性能、爆破强度、 缝合强度等生物力学性能进行测定，并探讨管壁厚度及有机醇处理对其生物力学性能 的影响；最后，对复合管状支架及其经有机醇处理后在水中的溶失率进行测试；为其 成为一种良好的组织工程血管支架提供实验依据。 3 2 4 静电纺p l a 丝素一明胶复合管状支架的生物相容性 通过细胞培养、溶血实验和皮下