（茶学专业论文）茶氨酸和茶氨酸合成酶活性的毛细管电泳检测及酶学研究.pdf

搁姜荼氨酸怒一穆j # 蛋酝蔟氨基酸，它在荟撬麟搂鳝时教会爨占茶# 于物质戆1 2 一2 。选今为止，茶氨酸仅被发现存在于山茶科植物和一种荤体内，是具有生物活性的次生代谢产物。荣氮酸除了在生物体内发挥缀要的生理、生化功能外，对人葶彗动物逐其商缀好豹保健功姥翻药理捧溺，邂j 毙不仅可以 乍为食品帮保键品中的添加荆，而且在隰药行业有潜程的应用前景。在茶氨酸的测定、提取、分离、制铸、合成和实际应用等方面已经取得了一些成聚。1 9 9 3 年a b e l i a nv 。邋过酶发酵法成功遗实现了茶氨酸的工业纯大嫂模生产，但所用的酶对乙胺的亲和力较低丽导致了产物中静乙胺残餐。为了鼠嘏本上解决荼氮酸的生物合成问题，探讨与茶氨酸合成关系密切的酶一一茶氨酸合成酶尤显重要。早在1 9 6 3 年s a s a o k ak 等就发瑷了该酶，著从生物化学角度于# 了较为系统的研究。憾在随后的4 0 多年量茶氨酸合成酶静研究掇j 莛甚少，茏蔟茶氨酸合成酶分子生貔学瓣信虑几乎没有。为了探讨茶氨酸在茶树体内的生物合成的调控机理，指导茶树的分子育瓣，探索茶氨酸生物合成的新途径，构建生产茶氨酸的工程菌，更好地开发茶氨酸在食箍和医药上酌功效，本论文主要在茶畿酸及萁台残关键酶静硷溅秘裙步缝纯等方甏开展了一系列工作。研究了萦籽的培育袋4 牛，从不同缒织中分离、提取茶氨酸合成酶，并初步探讨整理位霹素对荼氮葭台袋慧表达麴诱零馋麓。试验发魏氍涉予为鬣律，萘籍在2 g 条件下培育2 周时生长最好。通过制铸丙酮粉，利用丙酮和硫酸铵沉淀法，从不同缴织部位中提取茶氨酸合成酶。证实了丙醣粉粗酶波中，茶苗根中的茶氨酸合成酶活瞧终蠹蒺静莹露荼褥鳝畸黪7 ，i 莹，器荚簧鑫囊含餐傻为嚣嚣豢豹i 4 。运露承橱酸没泡、避光培养处理茶籽，茶苗表现出最高的茶氨酸台成酶活性，为自然光条件下培肖的荼籽苗中的酶活的4 7 倍，说明避光和水杨酸慰茶氨酸合成酶表达具有诱导作簿。建立了胶柬电动力学亳细管电泳技术定量茶氨酸的新方法，阮国内目前报道的其它方法快速、准确、经济、自动化程魔高。试验以2 ，4 - 二硝基敷苯为衍生化试剂，在5 0 。c 蕊p l l9 。5 露酸缓冲渡孛终嚣2 5 r a i n 君虿驻褥垂羧稳定懿在3 6 0 h m 瑟畜最大强收峰的衍生化产物。研究了影响毛细谢电泳分离效暴的主要霞索，确立了毛缀祷毫泳分离的最佳荣件：以0 0 3 m o l lp h 9 8 凹硼酸钠为电泳缓冲液，内含2 5 的b r i j 3 5鞫i 舔麴雾蔼醇，压力避檬嚣誊露受s ，分离电压为2 8 k v ，分离瀑度势t t 。c ，分离臻的石英毛细管总长度为6 5 c m ，有效长度为6 0 c m ，内径为5 0 儿m 。检测了不同茶样中的茶氨酸含量，测定了茶氨酸定量方法的性能指标：线性范围为0 2 - 5 0 m m o 】i( r = 0 9 9 5 ) ，检测下限为0 0 5 m m o l l ，从而证实了毛细管电泳技术定量茶样中茶氨酸的可行性。以胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸为基础，论文还首次建立了一套茶氨酸合成酶活性检测的新方法。与过去的同位素标记法比较，该方法不仅样品用量少、效率高，而且特别适合多样品的高通量检测。通过优化茶氨酸合成酶最佳反应体系得出：在3 5 下，在l m l 反应液中含有2 5 um o l 谷氨酸、1 0 um o l 乙胺、5um o l2 一巯基乙醇、2 5 “m o lm g c l2 、1 0 0 pm o lt r i s h c l ( d h 7 5 ) 、1 0 um o la t p 和0 4 m l 茶氨酸合成酶提取液，精确反应2 0 m i n 时茶氨酸合成酶活力达最大。考察了酶反应体系中可能影响毛细管电泳分离的各种因素。对茶氨酸合成酶纯化液样品进行活性检测，验证了茶氨酸合成酶毛细管电泳法分析的可靠性。并研究了茶氨酸合成酶初步纯化液的部分酶学性质：稳定p h 范围为7 o 一8 0 以及酶的t 。为15 。运用离子交换层析、凝胶过滤层析尝试了茶氨酸合成酶的进一步纯化，最终纯化倍数是丙酮粉粗酶液的4 2 4 倍，这比s a s a o k ak 报道的纯化结果提高了近3 0 倍。s d s p a g e 电泳图谱可见，含茶氨酸合成酶的蛋白质条带在逐步减少，取得了一定的纯化效果。另外，还筛选了茶氨酸合成酶的抑制剂，并初步探讨了利用亲和层析法纯化茶氨酸合成酶的可行性。为了深入研究茶氨酸合成酶的分子生物学基础，系统分析了自然界中存在的同样可以实现茶氨酸的酶法合成的其它三种酶。来自于假单胞菌的谷氨酰胺合成酶已被证实可以疆谷氨酸秘乙皴为底耪会残萘氮酸：在绸蓥葬内广泛存在豹y 一谷氨基甲酸簸合成酶可以催化谷氨酸和甲胺生成y 一谷氮基甲酰胺，对乙胺也显示很高的活性，在乙胺存在时也能形成茶氨酸；大肠杆菌产生的y 一谷氨醮基转肽酶，能够从谷氨酰胺翻乙技合残茶氨酸。尤其氆褥提匏是褐绒羞孛舞萤豹装氨酸合成途经，其关键酶究竟蹩上述酶的种还是其它新的特异性酶还有待迸一步诚实。以此为錾础丽展开的研究很可能为开辟天然茶氨酸的绿色合成途径奠定理论基础，其同源映射作用也将有助予勰决嚣拨茶学器多年静一个基本霾题。关键词：茶氨酸：定量；茶氨酸合成酶；活性检测；分离缝亿；生物合成途径i ia b s t r a c tt h e a n i n ei san o n p r o t e i na m i n oa c i d i tm a i n l ye x i s t si nt h et h e a c e ap l a n t s ，a c c o u n t i n gf o ra b o u t1 2 - 2 o o ft h ed r yw e i g h to fb u d l e t so ft h et e ac a m e l l i ns i n e n s i si ti sas e c o n d a r ym e t a b o l i t et h a tp r o v i d e san u m b e ro fb i o l o g i c a lf u n c t i o n s b e s i d e si t si m p o r t a n tb i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lr o l e s ，t h e a n i n ei sg o o df o rh e a l t hf r o mt h ep h a r m a c e u t i c a la n dp h y s i o l o g i c a lp o i n t so fv i e w t h e r e f o r e ，t h e a n i n en o to n l yc a l lb eu s e da sa na d d i t i v ei nf o o da n dh e a l t hc a r ep r o d u c t s ，b u ta l s oh a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si np h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y t h e r eh a sb e e ns o m es i g n i f i c a n tp r o g r e s so nt h ed e t e r m i n a t i o n ，s e p a r a t i o n ，e x t r a c t i o n ，a n dp r o d u c t i o no ft h e a n i n e t h e r ew e r ea l s os o m ep r e l i m i n a r yp h a r m a c e u t i c a la p p l i c a t i o n sh o w e v e r , p r o d u c i n gl a r g ea m o u n to ft h e a n i n ef r o mt h en a t u r a le x t r a c to rc h e m i c a lr e a c t i o n sh a sb e e nh i n d e r e db yt h ed i f f i c u l t yi nt h er e c o v e r yp r o c e s sa n dt h el o wc o s t - e f f e c t i v e n e s s n e v e r t h e l e s s ，a b e l i a nv s u c c e e d e di nt h em a s sp r o d u c t i o no ft h e a n i n et h r o u g he n z y m a t i cf e r m e n t a t i o ni n19 9 3 t h e yh a dt os e t t l ew i t ht h ee x c e s s i v er e s i d u a lo fe t h y l a m i d ei nt h ep r o d u c t a se a r l ya si n19 6 3 ，s a s a o k ak e ta 1 d i s c o v e r e dt h a tt h et h e a n i n es y n t h e t a s ew a st h ek e ye n z y m ei nt h et h e a n i n eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y t h e yc o n d u c t e dt h ep r e l i m i n a r ys t u d i e so nt h eb i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h e a n i n eu s i n gt h ep a r t i a l l yp u r i f i e de n z y m e t h e r eh a sb e e nl i t t l ep r o g r e s sr e p o r t e ds i n c et h e nb e c a u s eo ft h ei n s t a b i l i t yo ft h e a n i n es y n t h e t a s ei nv i t r o t h u s ，t h em o l e c u l a rb a s i so ft h e a n i n es y n t h e t a s er e m a i n su n k n o w n t h el a c ko fu n d e r s t a n d i n gs e v e r e l yl i m i t e do u ra b i l i t yt oa d v a n c et h et h e a n i n eb i o s y n t h e s i sa n dg e n e t i ce n g i n e e r i n g f i r s tp a r to ft h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e so ns t u d y i n gt h ec u l t i v a t i n gc o n d i t i o n so ft e as e e d si n c l u d i n gt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a li n d u c t i o nf a c t o r s ，a n dt h et h e a n i n es y n t h e t a s es e p a r a t i o na n de x t r a c t i o np r o c e d u r e sf r o md i f f e r e n tt i s s u e s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o nt oh a v et h eh i g h e s tt h e a n i n es y n t h e t a s ea c t i v i t yi nt e as e e d l i n g sw a st ou s es a n da st h ec a r r i e ra n dt oc u l t i v a t ea t2 0 f o rad u r a t i o no ft w ow e e k s ap r a c t i c a lp u r i f i c a t i o np r o t o c o lw a se s t a b l i s h e dt or e t a i nt h em a j o r i t yo ft h e a n i n es y n t h e t a s ea c t i v i t y t h ec r u d ee x t r a c tf r o ma c e t o n ep o w d e rw a sp r e p a r e db ya c e t o n ea n da m m o n i u ms u l f a t e t h et h e a n i n es y n t h e t a s ea c t i v i t yf r o mr o o t so ft e as e e d l i n g sw a s7 1t i m e so ft h a tf r o mt e as e e d l i n g so rf r e s ht e al e a v e s h o w e v e r , t h ec o n t e n to ft h ep r o t e i ni nr o o t so ft e as e e d l i n g sw a s1 4o ft h a ti nt e as e e d l i n g so rf r e s ht e a1 e a v e s a d d i t i o n a lt e as e e d sw e r ef i r s tt r e a t e du s i n gs a l i c y l i ca c i ds o l u t i o n ，t h e nc u l t i v a t e di nt h ed a r k t h e a n i n es y n t h e t a s ea c t i v i t yi nt h i sc a s ew a s4 7t i m e so ft h a tt e as e e d l i n g sc u l t i v a t i n gi nn a t u r a ll i g h t t h er e s u l t ss h o w e du it h a tb o t hl i g h ta n ds a l i c y l i ca c i dh a di n d u c e de f f e c t so nt h ee x p r e s s i o no ft h e a n i n es y n t h e t a s e t h es e c o n dp a r to ft h et h e s i sp r e s e n t sam e t h o df o rr a p i dm a da c c u r a t ed e t e r m i n a t i o no ft h e a n i n eu s i n gm i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ( m e c c ) t h ed e r i v a t i v er e a c t i o nw a sp e r f o r m e df o r2 5 m i na t5 0 ( 2i nt h eo 5 m o l lb o r i ca c i d n a o hb u f f e r , p h9 5 ，丽m2 , 4 - d i n i t r o f l u o r o b e n z e na st h ed e r i v a t i o nr e a g e n t t h ed e r i v a t i v eh a da l la b s o r p t i o np e a ka t3 6 0 n m t h el i n e a r i t yo ft h i sa s s a ym e t h o dw a s0 2 5 o m m o l l( 产o 9 9 5 ) ，a n dt h em i n i m a ld e t e c t i o nl i m i t ( s n = 2 ) w a so 0 5 m m o l l t h ec a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d ，w h i c hc o n t a i no 0 3 m o l lb o r a xb u f f e ra tp h9 8 ，b r i j 3 5a n di s o p r o p a n 0 1 s a m p l e sw e r ei n j e c t e di n t ot h ec a p i l l a r yu n d e rp r e s s u r ef o r5s e c o n d s ，w i mas e p a r a t i o nv o l m g eo f 2 8 k va n dt h et e m p e r a t u r ea t1 7 c a no p e nt u b u l a rf u s e d - s i l i c ac a p i l l a r yw a su s e dt h r o u g h o u tt h ee x p e r i m e n t sw i t ha ni n t e r n a ld i a m e t e ro f5 0 i - t ma n dal e n g t ho f6 5 c m ( 6 0 c mf r o ma u t o s a m p l e rt od e t e c t o r ) t h et h e a n i n ec o n t e n to fd i f f e r e n tt e as a m p l e sw a sd e t e r m i n e d ，w h i c hc o n f i r m e dt h ef e a s i b i l i t yt od e t e r m i n et h e a n i n eu s i n gc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y t h et h i r dp a r to ft h et h e s i se s t a b l i s h e san o v e lm e t h o dt oa n a l y z et h et h e a n i n es y n t h e t a s ea c t i v i t yb a s e do nd e t e r m i n a t i o no ft h e a n i n eu s i n gm e c c i nc o m p a r i s o nw i t ht h ei s o t o p i cl a b e l i n gm e t h o d ，i tr e q u i r e sf e w e rs a m p l e sa n dh a sh i g h e re f f i c i e n c ya n dt h r o u g h p u t t h ea s s a yw a sp e r f o r m e di n1 0 m ib u f f e rc o n t a i n i n g2 5 i t m o ll g l u t a m a t e ，10 9 m o le t h y l a m i n e ，10 1 x m o la t p , 2 5 p m o lm g c l ，2 5 9 m o l2 - m e r c a p t o e t h a n o la n d10 0 p m o lt r i s - h c l ( p h 7 5 ) ，t r i g g e r e db ya d d i n go 4 m lc r u d ee n z y m ee x t r a c tt ot h em i xa f t e ri n c u b a t e da t3 5 cf o r2 0m i n u t e s t h et h e a n i n es y n t h e t a s ea c t i v i t yw a su pt ot h em a x i m u m t h es t u d i e so nt h ep r o p e r t i e so ft h ei n i t i a lp u r i f i e dt h e a n i n es y n t h e t a s es o l u t i o nd e m o n s t r a t e dt h a tw i t hp hv a l u eb e t w e e n7 0a n d8 0a n dt h et t ao f t h et h e a n i n es y n t h e t a s ew a s l 5 t h el a s tp a r to f t h et h e s i si n t r o d u c e so u rp r e l i m i n a r ys t u d yo np u r i f i c a t i o no f t h e a n i n es y n t h e t a s eu s i n gt h ei o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yf o l l o w e db yag e lf i l t r a t i o n a f t e rt w os t e p so f p u r i f i c a t i o n ，t h ea c t i v i t yo f t h e a n i n es y n t h e t a s ei ns a m p l ew a s4 2 4t i m e so f t h a ti nc r u d ee n z y m e t h a tw a sa b o u t3 0t i m e st h ep u r i t ya c h i e v e db ys a s a o k ake ta 1 t h ei n c r e a s eo ft h e a n i n es y n t h e t a s ep u r i t yw a sv a l i d a t e db ys d s p a g e f u r t h e r m o r e ，w ed e s i g n e da n do p t i m i z e dap r o p e ri n h i b i t o r , a n de x p e r i m e n t e dw i t hp u f f f y i n gt h et h e a n i n es y n t h e t a s eu s i n ga f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t oc i r c u m s t a n t i a t et h ed i f f i c u l t yi no b t a i n i n gt h ep u r et h e a n i n es y n t h e t a s e ，w es h i f t e do u ra t t e n t i o nt ot h r e ek n o w ne n z y m e st h a tc a nc a t a l y z et h es y n t h e s i so ft h e a n i n ei nv i t r o i vg l u t a m i n es y n t h e t a s e ( e c6 3 1 2 ) f r o mp s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n sw a sp r o v e dt ob ea b l et os y n t h e s i z et h e a n i n eu s i n gg l u t a m a t ea c i da n de t h y l a m i n ea ss u b s t r a t e s yg l u t a m y l m e t h y l a m i d es y n t h e t a s e ( e c6 3 4 1 2 ) ，w h i c he x i s t si nm o s tb a c t e r i at oc a t a l y z et h ef o r m a t i o no fg l u t a m i n ef r o mg l u t a m a t ea n dm e t h y l a m i n e ，a l s os h o w sh i g ha c t i v i t yt oe t h y l a m i n ei nv i t r ot op r o d u c et h e a n i n e y - g l u t a m y l m n i d et r a n s f e r a s e ( e c2 3 ，2 2 ) f r o mec o l iw a ss h o w nt ou s eg l u t a m i n ea n de t h y l a m i n ea ss u b s t r a t e st os y n t h e s i z et h e a n i n e i ti sw o r t hm e n t i o n i n gt h a tt h es y n t h e s i sp a t h w a yo ft h e a n i n ei nx e r o c o m u sb a d i u sh a st h ep o t e n t i a lt ob ea ni d e a lm o d e lf o ri d e n t i f y i n gt h ei nv i v of u n c t i o n a le n z y m er e s p o n s i b l ef o rt h ef i n a ls t e po ft h e a n i n ep r o d u c t i o n i tm a ya l s ob eu s e dt oc l a r i f yt h ep o t e n t i a ls t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lr e l a t i o n so ft h e a n i n es y n t h e t a s ea n dt h et h r e ew e l l - k n o w ne n z y m e sm e n t i o n e da b o v e t h er e s u l t sf r o mt h i ss i m p l em o d e lo r g a n i s ms h a l lp r o v i d eu s e f u li n s i g h t sa n dg u i d a n c ef o rt h ei n v e s t i g a t i o no ft h e a n i n es y n t h e s i sp a t h w a y , e s p e c i a l l yt h et h e a n i n es y n t h e t a s ei nt h et e ac a m e l l i ns i n e n s i s k e yw o r d s ：t h e a n i n e ；d e t e r m i n a t i o n ；t h e a n i n es y n t h e t a s e ；a c t i v i t ya s s a y ；p u r i f i c a t i o nb i o s y n t h e s i sp a t h w a yv独创性声明本人声羁所呈酶学位论文是本人在警拜指导下述行麓研究工 乍及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的阏志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：叁老bj签字日期：d 上年年月肛日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。o、学位论文作者签名： 谷氨酸内酰胺茶氨酸脱水乙胺路线2 ：l 一谷氨酸毗咯烷酮酸茶氨酸路线3 ：y 一苄基谷氨酸盐+ 氯化三苯甲烷 反应混合物a反应混合物a+乙胺反应混合物b反应混合物b十乙酸反应混合物c过滤、浓缩、干燥、重结晶反应混合物c 茶氨酸缺点：反应复杂，副产物多，提取困难，收率低，安全性差，能耗大，污染大。第1 章前言1 1 5 3 利用茶树愈伤组织培养生产茶氨酸自2 0 世纪9 0 年代以来，有不少资料报道了利用茶树愈伤组织培养法生产茶氨酸( 见表卜1 ) “7 ”。茶树愈伤组织培养法是以嫩茶叶作为外植体材料，用特殊培养基诱导产生愈伤组织，优化培养条件如光照、温度、培养基，添加适当的生长因子，选择合适的前体物质可得到较好的生产效果。般认为当培养基中乙胺的浓度为2 5 m o l l 时，茶叶愈伤组织的茶氨酸生物合成为最大值。“，茶愈伤组织( 干质量) 中茶氨酸的含量达2 0 0 m g g 以上，占干重的2 0 左右。f u r u y at 等在改良m s 培养基中，加入2 0 m m 的底物( 初级胺，如2 一氰乙胺、延胡索酸、盐酸苯胺、盐酸苄胺、盐酸苯乙胺等) 、温度控制在2 5 。c 、黑暗中振荡培养4 6 周，可获得较高的茶氨酸产量。钟俊辉等“2 1 也对不同的培养条件下茶愈伤组织生长及其茶氨酸累积情况进行了研究。结果表明，激素i a a 和6 一b a 结合作用时，存在着相互效应，其中以2 m g l 的i a a和4 m g l 的6 一b a 对茶氨酸积累最有利；不同碳源对愈伤组织生长和茶氨酸积累的影响相近；增加糖浓度有利于次生代谢物的累积，茶氨酸组织的最适培养温度和茶氨酸累积温度都是2 5 。c ；暗培养更利于茶氨酸的累积；茶氨酸的累积曲线与愈伤组织生长密切相关。表1 1 茶树细胞培养声缝茶氨酸条件t a b l e1 - 1t h ec o n d i t i o n so f p r o d u c et h e a n i n eb yt e ac e l lc u l t u r e普遍认为醅s 培养基为茶氨酸积累豹最适培莽基，努秀霾逶蚕t a a 、6 q g a 或i b a 等，同时，添加盐酸乙胺、谷氨酸等前体可以明显促避茶氨酸的合成，暗培养利于茶氯酸的生成。但是，f = 予产薰低，产赫分离菇纯过程笈杂及生产工艺的控髑滚度大等陵索l彳安徽农业大学博士学位论文了该方法的二 ：业化。据报道，日本三菱重工业公司己能应用细胞培养法大量合成茶氨酸，解决了茶氨酸在自然条件下含量较少，不能大量提取的难题，但目前未见工业化产品问世。1 1 5 4 微生物酶促合成茶氨酸1 9 9 3 年日本报道了应用于实际生产的酶促合成茶氨酸的反应。目前应用于生产合成茶氨酸的酶不是从茶树中提取到的茶氨酸合成酶，而是细菌中的谷氨酰胺合成酶提取物，这是因为茶树中提取的茶氨酸合成酶容易失活。1 9 9 8 年，日本太阳株式会社研究成功了从一种硝基还原假单胞细菌( p s e u d o m o n a sn it r o r e d u c e n 5 ) 获得谷氨酰胺酶，并由此获得一种可大规模生成茶氨酸的低成本人工合成技术5 ”。利用的是细菌中的谷氨酰胺合成酶提取物在特殊条件下( 高乙胺浓度和特定的p h 值) 进行的非特异反应。具体方法是先将一种硝基还原假单胞z 细菌i f 0 1 2 6 9 4 ( p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s ) 培养物悬浮在0 g n a c i 溶液中，然后与4 5 k 一角叉菜胶混合，使细菌固定成直径3 m m 的颗粒，填充于四根1 7 4 0 c m 的柱型反应器中，以乙胺和谷氨酰胺为底物，在硼酸缓冲液( p h 9 5 ) 中，3 0 。c 条件下，底物以0 3 个床体积每小时通过反应器。该方法制备的反应器活性可持续几个星期以上，预计生产半寿期可达1 2 0 次反应。第5 1 次反应，茶氨酸的产量仍可达到4 0 0 0 01 1m o l h 。粗产物用离子交换柱层析就可分离出茶氨酸，得率可达所消耗谷氨酸的9 5 左右。而此法严格而言为半生物合成，并因底物试剂乙胺和谷氨酰胺的消耗及反应周期较长提高了成本，同时该酶在通常情况下对氨的亲和力比乙胺大得多，同时还存在底物乙胺的大量使用和部分残留所至的食品安全及转化效率等问题，因此，开辟茶氨酸生物合成的新途径势在必行。此后日本人对谷氨酰胺合成酶的性质进行了一些研究。115 5 从茶叶中或其富集液中提取茶氨酸特殊试荆沉淀法提取茶氨酸是采用某些有机或无机试剂与相应氮基酸形成不溶性衍生物酶一稀分离方法。荼氨酸与碱式酸酸锅反藏生成淡紫色柱欹铜盐，和角此往质可将茶氨酸分离。采用传统法提敬茶氨酸时，豳茶叶中存在的游离氨萋酸为水溶性的，常选j = l 热水浸提。毙用醋酸镪沉淀去除茶汤中的蛋囱质、多酚类和部分色素，然后通入s 除去过剩的钳，再用氯仿萃取去除咖啡碱。茶汤中茶氦酸经碱式碳酸铜作用后经过滤除去其它缀分。茶氨羧铜盐经疆硫酸溶解、加入h 。s 和适量b a ( o h ) ：抽滤去滤渣、浓缩、精制后可祷天然茶氨酸纯晶。但是此法收率较低，引入杂质重金属离子p b ”、c u ”，用第1 章前言硫化氢除p b ”、c u ”，硫化氢制气比较麻烦，后又加入b a ( o h ) ：沉淀硫酸根离子，工序较多。由于茶氨酸铜盐在稀硫酸中溶解度较低，为使其溶解而加入大量稀硫酸，这样会生成大量硫酸钡沉淀，进而造成茶氨酸损失。离子交换法提取茶氨酸是氨基酸工业中应用最为广泛的提取方法之一。茶氨酸作为两性物质，当选择适当的p h 值，用离子交换树脂可以分离提取。1 9 9 8 年陈瑛等“6 报道了用离子交换法提取茶氨酸，他们选用国产7 3 2 p h 离子交换树脂，从茶愈伤组织浸提液中提取茶氨酸。通过静态、动态实验，对洗脱液的p h 、离子强度、样液浓度和流速等因素进行了考察，比较了在不同条件下，树脂对茶氨酸的吸附隋况。茶氨酸的得率为7 0 。由于茶叶中茶氨酸的含量有限，单纯的从茶叶中提取成本较高，无实际生产价值。如果从提取茶多酚后的残留液中用离子交换树脂提取茶氨酸，却是一项很有经济价值的工艺技术。2 0 0 4 年林智等。7 垮艮道了从茶多酚工业废液中提取纯化茶氨酸的方法。通过采用絮凝、吸附、阳离子树脂交换、重结晶工艺来分离纯化茶氨酸，最终茶氨酸纯度可达到9 0 ，得率为0 8 。这对具有一定规模的茶多酚生产和茶叶加工厂家来说，将为茶叶的综合利用与开发提供新的方向。1 1 6 茶氨酸在动物及人体内的吸收、代谢荼羝酸是一释特殊的氨萋酸，同萁稳静氨萋羧一襻在人体小赫雨被教浚。k i t a o k as 等5 ”研究表明，茶氨酸在肠邋内的吸收可能与谷氨酸熬用一个由n a 偶联的协同运转蛋白，且茶氨酸煞亲鞠力毙昝氮酸低? 倍。u n n ot 簿渤3 发现，茶氨酸在侮内髂代谢部位可能是肾脏，人体服用茶氨酸后，在尿液中可检测到茶氨酸、谷氨酸、乙胺3种物质，而且这些物质在尿液中的含量与服用蘩成正窿，这说明茶氨酸在人体内经过酶促水解为谷氨酸和乙胺。t e r a s h i m at 等咖1 则以鼠为对象研究了茶氨酸在体内的代谢动力学变化情况，他们发现，荼氨酸经口灌霄l h 后，隈的血清、脑、肝中茶氨酸的浓度明鼹增热，但此后髓着时阈的延长，血清和孵中的茶氮酸浓度逐澎降低，硝脑中的茶氨酸浓度则保持增长趋势，一直到灌胃5 h 后浓度才达到最商值。经过2 4 h 后，疰盘薅、弦、麟等缀织中岽戆捡测型茶筑酸。1 1 7 荼氨酸的安全性筠稳定性霜本子1 9 6 4 年批礁萘氨酸作为食晶添鸯西燕，1 9 8 5 年荧莺食晶稻药物管理餍( f d a )也认可了茶氨酸，并确认其为一般公认的安全物质( g r a s ) ，在使用过程中不作限制用鳘的规定。其安全性实验表明，荼氨酸的大鼠急性毒健在5 9 k g 以二，在连续服用9安徽农韭大学搏士学链论交2 8 天( 每天2 9 k g ) 茶氨酸的照急性实验中，大鼠未见任何毒性反应；在致突变实验中也没有发现浆氨酸的任何诱变作用；细菌恢复突变实验也证明未导致基因变辫。因此可以说，茶熬酸是一蕈申十分安全的，无毒的食品“。茶氨酸的性质较稳定。将茶氨酸溶液煮沸5 m i n ，残将茶氨酸溶予p h3 o 的溶液中共在2 5 下糖放1 2 令月，茶氨酸含爨蒸本不变。因此农通常的食晶加二e 、杀菌过程中，茶氨黢的性质不会发生变化”。 ，2 茶氨酸合成魏煞聚突撅述茶氨酸合成酶( t h e a n i n es y n t h e t a s e ) 又称l 一谷氨酸：乙胺连接酶( l - g l u t a m a t ee t h y l a m i n e l i g a s e ) ，国际酶学编号为一e c 6 3 1 6 。茶氨酸合成酶是茶树所特有的酶，具有高度专一性，它在茶氨酸的生物合成中起着重要的作用。有关茶氨酸合成酶的研究，国内、国际报道甚少，s a s a o k ak 等最早发现了该酶，并较系统地研究了它的性质”3 卜”，证实该酶不仅存在于茶树根部，茶树新稍中也存在；此后，竹尾忠一、小西茂毅等人也对茶氨酸合成酶进行了一些研究，用s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤和d e a e纤维素柱层析法初步纯化了茶根和茶芽叶中的茶氨酸合成酶，并研究了它们的活性、蛋白质含量及比活等“。但由于该酶在体外容易失活、酶活测定方法的复杂及当时分离纯化手段的限制，最后因为样品无茶氨酸合成酶活性而停止纯化程序。随着现代分离技术、生物技术手段的日益提高，深入开展茶氨酸合成酶的研究工作，将对开发茶氨酸应用价值具有重要的指导意义。1 3 茶氨酸及其合成关键酶的研究意义中国是茶树的原产地和起源中心，是茶叶生产大国。而茶叶一直是我国主要出口创汇的农产品之一。茶学虽是一门较成熟的传统学科，但是面对当今世界，传统的茶叶技术已显得十分乏力，尤其生物工程技术在茶业上的应用更是滞后，致使茶叶产品质量在国际市场上竞争力日落，所以，利用现代生物化学手段，研究茶学的一些基础问题，提高我国茶业市场的竞争力，发展民族特色产业，尤其显得更加迫切。茶氨酸不仅具有重要的生理、生化和药理、保健作用，而且是决定茶叶品质的重要因素之一，同时它又具有良好的安全性、稳定性，因而应用前景广阔。经过数十年的不断探索，人们在茶氨酸的测定、分离、提取、制备和实际应用等方面取得了一定成果，国外学者在茶氨酸的药用功能及作用途径等方面的研究也越来越深入，国内也有少量相关报道“6 “。尤其茶氨酸的制备与合成，人们曾尝试过从茶树中直接分离精制、化学合成法及细胞组织培养法等生产技术，但都存在收率低、成本高、操作繁第1 牵前言杂、反应条件苛刻等问题，阻碍了茶氨酸的研究与开发。尽管目前日本已通过酶法转化法箴功毯开到了工韭诧大蕊摸生产利造茶筑酸兹竞弼，毽是提寒疯貔与酶豹亲饕力，降低成本仍怒有待解浃的问题。现在隧潜生物技术的发展，如何利用它获取犬麓的浆氨酸? 尽早填补茶树体以外生物直接合成法生产大蠛茶氨酸的空白，因此，对荣氨黢生旗合成浆荚键酶一茶氨骏合箴酶避纾深入斡弼究，其有重大熬遴论襁实琢纛义。本课题对茶氨酸及茶氨酸合成酶所展开的研究，一方筒可以指导调控茶氨酸在茶搪钵肉熬生物合成，键进篆榭= 蔓三理、代谢匏磺究；另一方嚣为茶挺基瓣工程育霉申撬拱了瑗论依据和戚瘸基础；还为汗辟茶氨酸生物台成的新途径，枣每建产茶氨酸工程藏，开发茶氨酸在暇疗上的功效蕤定基础。相信随着研究的不断深入，茶氨酸在医药以及食熬领域必将其有更为广闼的开发应用前聚。 4 课题主要磺究内容及来源本课题的主溪研究内容为，茶籽的培育及茶树不同组织部位茶氨酸合成酶的分离掇敬及活牲捡测；毛缎警电澈技拳定量萘餐敬；建立荼氨酸台藏酶滔力检测方法；建立茶氨酸台成酶的初步纯亿体系；茶氨酸生物合成斡代谢机理的思考与展望。本课题的来源是国家自然科学基金( 3 0 2 7 0 8 5 3 ) 、安徽省教育厅自然科学基金( 2 0 0 2 k j 0 8 5 ) 、辩技部9 7 3 戆期硒究专项( 2 0 0 4 c c a 0 6 4 0 0 ) 及安徽镀自然科学纂金( 0 5 0 4 1 0 3 0 3 ) 资助课题。第2 章茶氨酸合成酶的分离提取2 1 引言茶氨酸在茶树各个组织中( 除果实外) 含量都十分突出，但含量差异也很大。从百分含量上看，幼嫩芽叶含量较高，一般可达茶叶干重的1 一2 ；老叶、根部、茎部也有少量分布；而果皮、子叶中含量最少( 表2 - 1 ，表2 2 ) 。茶氨酸在各类茶之间的含量也有较大差异，并因各类茶的原料、加工