（生理学专业论文）碱性成纤维细胞生长因子对myostatin基因表达的影响及机制探讨.pdf

摘要 碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf l b m b l a s tg f o w t h 缸t o f ，b f g f ，f g f - 2 ) ，属f g f 家族，是一 种多功能生长因子，在许多器官系统的发育过程中发挥重要作用。b f g f 是骨骼肌发育与重建的重 要调节因子，能激活e r k i 2 信号途径而刺激骨骼肌成肌细胞的增殖，通过下调骨骼肌细胞m r f s 和m e f 2 的表达而抑制骨骼肌细胞的分化过程m y o s t a t i n 是一种肌肉组织生长的负调控因子，抑制 骨骼肌细胞的增殖。为了探讨这两种反向作用的细胞生长因子之间的互作关系，本文从体内与体外 实验分别讨论了b f g f 对m y m t a t i n 基因表达的影响，并且初步探讨了其调节机制。全文分为五个部 分 一、本文首次克隆到中国小尾寒羊i 8 k d a - b f g f 基因的全编码序列( g e n b a n k 登陆号 d q 0 9 1 1 8 2 ) ，从分子特征与分子进化的角度进行了分析结果发现：小尾寒羊1 8 k d a - b f g f 基因编 码1 5 5 个氨基酸，蛋白质一级结构的特征与已报道的其他物种该分子基本相同；该分子具有高度的 保守性，核苷酸序列与其他已报道的1 4 个物种的相似性均在6 7 以上，氨基酸序列的相似性均不 低于7 4 ，同源性最低为水栖动物虹鳟。 二、构建真核表达载体p c m v - n c o - b f g f ，转染c 2 c 1 2 细胞以及注射小鼠后腿肌肉，实现外源 性b f g f 基因在细胞和骨骼肌内表达，实时荧光定量p c r 和w a s t e mb l o t 检测细胞和骨骼肌内源性 m y o s t a t i n 基因的表达水平。结果发现：外源性b f g f 在细胞内或骨骼肌中表达后，内源性m y o s t a t i n 基因的表达量出现了显著性下降表明b f g f 可下调m y o s t a t i n 基因的表达。 三，将小尾寒羊b f g f 基因克隆进原核表达载体p e t - 2 8 a ，构建成原核表达载体p e t - 2 8 a - b f g f ， 转化大肠杆菌b l 2 1 在i p t g 的诱导下，实现了目标蛋白在大肠杆菌中的成功表达为了获得具有 生物学活性的重组蛋白，对诱导表达条件进行了筛选。结果表明：在3 0 、o 5 m mi p t g 以及诱导 时间为5 h r 的条件下，成功获得了具有较高生物学活性的可溶性融合蛋白，产量为每升培养物1 7 2 0 m g 四、将本实验所获得的重组羊b f g f 添加到细胞培养液中，或用3 种信号通路抑制剂预处理细 胞，以探讨b f g f 对c 2 c 1 2 细胞的促生长作用及其作用机制。结果发现：浓度为2 0 6 0 n g m l 的b f g f 可显著刺激c 2 c 1 2 细胞的增殖，抑制剂p d 9 8 0 5 9 显著性抑制了细胞的增殖，而s p 6 0 0 1 2 5 和s b 2 0 3 5 8 0 均未造成明显的影响。提示，b f g f 可能通过e r k - m a p k 信号途径来促进骨骼肌细胞生长。 五、本部分旨在初步探索b f g f 与m y o s t a t i n 之间互作关系的调控机制。在p d 9 8 0 5 9 和戚b f g f 处理细胞后，实时荧光定量p c r 检测细胞内源性m y o s t a t i n 的转录水平，w c s t e mb l o t 检钡i 胞内e r k l 2 的磷酸化程度。结果显示，b f g f 抑制m y o s t a t i n 基因的表达呈现一定的剂量依赖性关系，p d 9 8 0 5 9 削减了b f g f 对m y o s t a t i n 基因表达的抑制作用，提示，e r k l 2 参与了这两种生长因子之间的调控 机制。 关键词；碱性成纤维细胞生长因子，分子进化，m y o s t a t i n ，e r k i ，2 ，小尾寒羊 a b s t r a c t b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( b f o f , f g f - 2 ) ，am e m b e ro ff i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rf a m i l y , i sa p l e i o t r o p i cg r o w t hf a c t o rp r o p o s e dt oh a v e a l li m p o r t a n tf u n c t i o ni nt h ed e v e l o p m e n ta n d f u n c t i o no fn n n l c l o n so r g a ns y s t e m s d u r i n gd e v e l o p m e n ta n dr e g e n e r a t i o no fs k e l e t a l m u s c l e , b f g f , a sa l li m p o r t a n tr e g u l a t o r , c a l li m p r o v et h ep r o l i f e r a t i o no fm y o b l a s tb y a c t i v a t i n ge r k l 2s i g n a lp a t h w a ya n di n h i b i tm y o b l a s td i f f e r e n t i a t i o nb yd o w n - r e g u l a t i n g e x p r e s s i o no f m u s c l er e g u l a t o r yf a c t o r sa n dm y o e y t ee n h a n c e rb i n d i n gf a c t o r2 a san e g a t i v e r e g u l a t o ro fs k e l e t a lm u s c l em y o s t a t i nc a l li n h i b i tg r o w t ho fs k e l e t a lm u s c l ec e l l s i no r d e rt o i n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no ft h et w of a c t o r sw i t ho p p o s i t er o l e st h ee f f e c t so fb f g fo n e x p r e s s i o no fm y o s t a t i ng e n ei nv i v oa n di nv i t r ow e r ed e t e r m i n e da n dt h er e g u l a t o r y m e c h a n i s m sd i s c u s s e dp r e l i m i n a r i l y t 1 1 i st h e s i si sd i v i d e di n t of o u rp a r t s p a r tlt h ec o m p l e t ec o d i n gs e q u e n c eo f1 8 k d a - b f g ff r o mc h i n e s es h o r t - t a i l e dh a r t s h e e pw a sf i r s t l yc l o n e d ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ri sd q 0 9 1 1 8 2 ) a n di t sm o l e c u l a r c h a r a c t e r sa n de v o l u t i o nw e r ea n a l y z e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ：t h eg e n ee n c o d e s1 5 5 a m i n oa c i d s t h ep r i m a r ys t r u c t u r eo f t h ed e d u c e d p r o t e i ns h a r e sc o m l n o nh a l l m a r k sw i t i lt h e p u b l i s h e ds e q u e n c e so f t h ec o u n t e r p a r tg e n ef r o mo t h e rs p e c i e s ；t h eg e n es e q u e n c e si sh i g h l y c o n s e r v a t i o ni nc o m p a r i s o n 、i t l lo t h e r1 8 k d a - b f g fg e n es e q u e n c e si ng e n b a n ks h a r i n ga s i m i l a r i t yo v e r6 7 i nn u c l e o t i d e ss e q u e n c ea n do v e r7 4 i na m i n oa c i ds e q u e n c e so ft h e o t h e r1 8 k d a - b f g f sw i t ht h eb o t t o m m o s to f t h a to f r a i n b o wt r o u t p a r t2 t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp c m v - n c o - b f g fw a sc o n s t r u c t e da n dw a sl r a n s f e c t e di n t o c 2 c 1 2m y o b l a s mo ri l ! j e c t e di n t oh i n d l i m bs k e l e t a lm u s c l eo fm o u 辩r e a l t i m ep c ra n d w e s t e r nb l o t t i n gw e r eu s e dt od e t e c tt r a n s c r i p t i o n a la n dt r a n s l a t i o n a ll e v e l so fe n d o g e n o u s m y o s t a t i ng e n e t h er e s u l t ss h o w e dt h a te x o g e n o u sb f g fw a sh i g h l ye x p r e s s e di nc 2 c 1 2 m y o b l a s t sa n dm o u s es k e l e t a lm u s c l e ，a n do nt h ec o n t r a r yt h ee x p r e s s i o n a lc o n t e n t so f e n d o g e n o u sm y o s t a t i ng e n ew a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y , w h i c hi n d i c a t e dt h a tb f g fc a n d o w n - r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no f m y o s t a t i ng e n e p a r t3 t h ee x p r e s s i o n a lv e c t o rp e t - 2 8 a - b f g fw a sc o n s t r u c t e db ys u b c l o n i n gt h e 18 k d a b f g fo fc h i n e s es h o r t - t a i l e dh a ns h e e pi n t op e t - 2 8 aa n dw a su s e dt ot r a n s f o 咖 b l 2 1c e l l s i no r d e rt oo b t a i nr e c o m b i n a n tp r o t e i n 、i t hb i o l o g i c a la c t i v i t y , i n d u c ec o n d i t i o n s w e r es c r e e n e d r e s u l t ss h o w e dt h a tu n d e rt h ec o n d i t i o n so f 3 0 0 5 m mi ”ga n di n d u c ef o r 5 h r , s o l u b l ef u s i o np r o t e i nw i t hh i g hb i o l o g i c a la c t i v i t yw a sh a r v e s t e da n dt h ey i e l dw a s 1 7 - 2 0 m gp e rl i t e ro f c u l t u r e p a r t4 n 壕r e c o m b i n a n tp r o t e i no rt h r e ei n h i b i t o r so fs i g n a lp a t h w a yw c r ea d d e di n t oc e l t m e d i u mt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so f b f g fo np r o l i f e r a t i o no f c 2 c 1 2m y o b l a s t sa sw e l l 私i t s m e c h a n i s m s r e s u l t ss h o w e dt h a ta d d i n gb f g fa lc o n c e n t r a t i o no f2 0 - - 6 0 a g m lc o u l d s t i m u l a t es i g n i f i c a n t l yt h ep r o l i f e r a t i o no fm y o b l a s t s , a n do nt h ec o n t r a r yp d 9 8 0 5 9b l o c k e d d i s t i n c t l yt h ep r o l i f e r a t i o ni n d u c e db yb f g f , w h i l es p 6 0 0 1 2 5a n ds b 2 0 3 5 8 0d i dn o tb r i n g a b o u td e t e c t a b l ee f f e c t0 1 1c e l l sg r o w t h , w h i c hi n d i c a t e dt h a tb f g fs t i m u l a t e sg r o w t ho f s k e l e t a lm u s c l et h r o u g he r k l 2 m a p ks i g n a lp a t h w a y p a r t5 o b j e c t i v eo f t h i sp a r ti st oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nb f g fa n dm y o s t a t i n c e l l sw e l ep r e t r e a t e da n d o r 仃e m e dw i t hp d 9 8 0 5 9a n d o rb f g f , r e a l - t i m ep c rw a su s e dt o d e t e c tm r n ao fe n d o g e n o u sm y o s t a t i ng e n ea n dw e s t e r nb l o t t i n gw a sa p p l i e dt od e t e r m i n e da c t i v i t i e s o f e r k i t 2 r e s u l t si n d i c a t e dt h a te n d o g e n o u sm y o s t a t i ng e n ee x p i e s s i o nc o n t e n t sw e r ei n h i b i t e db yb f g f o nd o s e - d e p e n d e n tm a n n e r , a n dp d 9 8 0 5 9i m p a i r e dt h ei n h i b i t o r ye f f e c ti n d u c e db yb f g f , w h i c hh i n t e d t h a te r k i 2p l a yar o l ei nt h ep r o c e s so f r e g u l a t i o n k e yw o r d s ：b a s i cf i b m b l a s tg r o w t hf a c t o r , m o l e c u l a re v o l u t i o n , m y o s t a t i n , e r k i 2 ，e x p r e s s i o n r e g u l a t i o n , c h i n e s es h o r t - t m l e dh a r ts h e e p 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 啾躲：v 节肛 帆印年翻，拍 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一躲扒协八 导师签名 时间：伽0 年bf 黔 砖梅1 知7 匀6 t 噎洙 第一部分文献综述 碱性成纤维细胞生长因子的研究进展 。 早在2 0 世纪3 0 年代，就有人发现在动物体组织提取液中存在着能显著促进成纤维细胞 增殖的物质，该物质含量极少而难以获得，因而，随后的几十年中，对该物质的研究未获得 较大的进展。直至1 9 7 4 年，g o s p o d a r o w i c z 等【l j 人通过比较牛体内不同组织间该物质的含量， 发现在牛的脑垂体中含量最高，并且首次从牛的脑垂体中分离纯化到该物质，检测到其等电 点为9 6 ，而且能显著促进b a l b c 小鼠3 t 3 成纤维细胞的增殖，因而，便将该物质命名为 碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ，f g f - 2 ) 1 9 8 6 年，a b r a h a m 等1 2 1 人首次获得b f g f 基因，从而为该细胞生长因子的功能与应用研究拉开了序幕 1成纤维细胞生长因子家族概述 作为成纤维细胞生长因子( f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ，f g f ) 超家族中的一员，b f g f 是该 超家族中最为重要的生长因子。目前已发现f g f 超家族至少包含2 3 个成员，分别含有1 5 5 2 6 8 个氨基酸残基，它们的核心区段都含有一个约1 2 0 个氨基酸残基的高度保守序列p j ，同 源率为3 0 6 0 ，该区为f g f 家族一个共同的模序，可与肝素结合1 4 , s l 。家族原型是f g f 1 ( a c i df i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r , a f g f ) 和f g f - 2 ( b f g f ) 尽管二者有极为相似的生物学活性， 如促血管形成、诱导胚胎发育、促进神经生长的功能，但后者生物学活性约为前者的l o 倍。 作为成纤维细胞生长因子，一般认为它们都具有对成纤维细胞的促生长作用，其实不然，现 已发现f g f - 7 是不具有该功能的。2 3 个家族成员分别由2 3 个不同的基因所编码，其中绝大 部分具有n 端信号肽序列，它们可以通过e r g o l g i 途径分泌到胞外l 。叫；一小部分f g f 没 有信号肽，如f g f - i i 一1 4 ，它们就只能存在于细胞内1 1 i i l ；还有一部分f g f ，如f g f - 1 , 2 ，9 ，1 6 ，2 0 ， 它们也没有信号肽序列，但它们可以分泌到胞外 i l - 1 4 1 ，这其中的分泌机制目前还不清楚。 2 b f g f 分子特征与进化分析 2 1 分子特征 最初从牛垂体中分离得到的b f g f 为1 4 6 个氨基酸，分子量约为1 6 4 k d a 1 5 1 ，然而人胎 盘b f g f 为1 5 7 个氨基酸，分子量为1 7 5 k d a ，不仅如此，后来从牛和人体内发现更小分 子量形式的b f g f ，它们源自该肽链n 末端氨基酸残基数的减少1 1 7 1 。目前，已发现具有b f g f 生物学活性的最小分子形式为减少了1 5 个氨基酸的肽链，也是从牛垂体中分离得到的【l q 。 这些小分子b f g f ，可能是在分离纯化过程中氨基酸的丢失所致1 1 s 1 人b f g f 为单拷贝基因，位于4 号染色体上，全长大于4 0 k b ，含两个1 6 k b 的内含子， 5 ，和3 端都有对基因转录起调控作用的非编码区l ”捌该基因的转录产物有四种，分别是 1 2 k b 、2 2 k b ，3 7 k b 和7 o k b ，体内主要表达的是后二者b f g f 基因的转录主要受5 l r r r 序列的调控，但其转录产物长度的不同主要是产物中3 - u t r 的长短所决定的。人b f g f m r n a 是一个最为复杂的翻译调节系统 2 t - 2 4 1 ，其5 引导区包含5 个起始密码，一个为a u g ， 起始翻译生成一个含1 5 5 个氨基酸分子量大小为1 8 k d a 的蛋白质。在a u g 上游，依次存在 着4 个c u g ，它们的起始翻译产物的大小分别为2 2 2 2 5 ，2 4 以及3 4 1 d 3 a ，这4 种以c u g 起始翻译所获得的蛋白质被命名为高分子量b f g f ( h m w - b f g f ) 1 2 。2 7 1 这5 种大小不同的 b f g f ，除了3 4 k d a - b f g f 之外，其余4 种的翻译起始均受到定位于m r n a5 端非翻译区的 内部核糖体进入位点( i r e s ) 的驱动，允许发生非典型的不同于c a p 机制的翻译方式| 2 v 3 0 对于小鼠，这种选择性翻译起始相对较为保守，但c u g 起始翻译仍然存在，它们的产物为 2 l 与2 2 k d a 另外还发现一个3 0 k d a 的分子形式，尽管目前尚未对该分子进行特征分析， 但可以肯定的是，这种独特的分子形式可能来源于一个不同的翻译起始位点唧i 。b f g f 受到 不同组织特异性因子的调控，因而在不同组织表达不同大小的分子形式p “。这些不同大小 的分子在细胞内具有不同的定位与功能，以a u g 起始所产生的1 8 k d a - b f g f 主要存在于细 胞质中，通过自分泌或旁分泌的方式分泌到胞外，参与膜受体的识别。而以c u g 起始所产 生的4 种h m w - b f g f 则主要定位于细胞核中，通过内分泌( i n u a c f i n e ) 的方式与核内物质 发生互作关系田j 有人在生殖细胞核内发现h m w - b f g f ，但在支持细胞中并未发现，表明 这些高分子形式的b f g f 可能参与调节生殖细胞的增殖与分化【3 1 3 4 1 现已明确，四种高分子量的分子区别于1 8 k d a 的唯一结构特征是在1 8 k d a 分子结构上 的n 断延伸最大的分子中其一级结构的延伸部分包含9 个g l y - a f g 重复序列，其中至 少有6 个重复序列的a r g 被甲基化彤, 3 6 1 ，这种甲基化的a r g 的精确数量与功能特性目前均不 十分清楚，但这些被修饰的残基可能参与保护高分子量的b f g f 不被水解以及核转运或滞 留。 晶体1 8 k d a - b f g f 蛋白质分子的空间构像为金字塔形结构，其中包含1 2 个反向平行的 b 折叠片。分子中几个特殊的区域对分子的功能较为重要，残基1 3 3 0 以及1 0 6 1 0 9 可能 为受体结合位点p 7 3 s 1 ，这两个结构域的临近序列也能与肝素结合，甚至更高的亲和力，因此， b f g f 与肝素结合并不局限于这两个结构域。与肝素结合后b f g f 三级结构发生显著变化， 从而不易变性与被降解。分子中两个反向r g d 序列，p d g r 和e d g r ，与b f g f 的促有丝 分裂活性有关p ”。b f g f 分子中含有4 个c y s ，分别是c y s 2 5 ，6 9 ，8 7 ，9 2 ，后两个较为保守，存 在于所有的f g f 超家族成员中，如果将前两个c y s 替换，对b f g f 的生物学活性不会造成 影响，但若将后两个替换则使得其功能丧失，提示后两个c y s 可能形成分子内二硫键从而稳 定分子的活性构像”删“，然而t h o m p s o n 等 4 2 1 人研究证实，b f g f 分子内并未形成二硫键， 2 由此我们可以推测，后两个c y s 必定以某种特定的作用方式来维持b f g f 分子正确的空间结 构b f g f 分子内有两个潜在的磷酸化位点s e t 6 4 和t y r l l 2 ( 人) s e r l l 2 ( 小尾寒羊) ，它 们可被p k 磷酸化 2 2 分子进化分析 b f g f 是一个高度保守的基因，早在两栖动物非洲爪蟾中就已存在，而且与人有较高的 同源性。奶牛与人只有一个核苷酸( 氨基酸) 之差，小鼠、大鼠与人的同源率达9 8 以上 1 譬竺竺鳖尘登：譬。 i t h mt a i ll l - 1 1s a j t o q a e o c t l e s h e e p d o g i m p t t n m f l l e 取l 置辟。矗k 何 t f t t g w m o n t m l e d o c t c i 啪 f f a p a s l e s er n * e b e n e y _ i h h _ n 勾p 证- 斡 z 知f 4 区l l f _ h n ，口辅二鼻旧供 图1 1 5 个物种( 包括人) 1 8 k d a - b f g f 分子进化树 f i g 1 t h ep h y l o g e n i t i ct r e eo f 1 5o r g a n i s m sb a s e do ot h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f1 8 k d a - b f g f s h o r t t a i lh a ns h e e p ( d q o g l i 救) 、c a t t l e ( n m l 7 4 0 5 6 ) 、s h e e p ( n m 0 0 1 0 0 9 7 6 9 ) ，c h i m p a n z e e ( a y 6 6 5 2 5 9 ) 、 h u m a n ( n m 0 0 2 0 0 6 ) 、r h e s u sm o n k e y ( x m 0 0 1 0 9 9 2 甜) ，d o g ( x m 5 3 3 2 9 8 ) ，m o u s e ( n m 0 0 8 0 0 6 ) ， r o t ( n m 0 1 9 3 0 5 ) 、f 町s h o r t - t a i l e d o p o s s u m ( n m 0 0 1 0 3 3 9 7 6 ) 、c h i c k e n ( n m 2 0 5 4 3 3 ) 、j a p a n e s e f i r e b e l l y n e w t ( a b 0 6 4 6 6 4 ) ，s i l u r a n at r o p i c a l i s n m 0 0 1 0 1 7 3 3 3 ) 、z e b r a f i s h ( n m 2 1 2 8 2 3 ) ，r a i n b o wt r o u t ( a y 8 7 3 7 5 ) 目前已在g e n b a n k 中注册了1 5 个物种( 包括人以及我们所报道的小尾寒羊( d q 0 9 1 1 8 2 ) ) 的1 8 k d a - b f g f 基因全编码序列，将它们的d n a 和氨基酸序列分别进行比对，发现其d n a 相 似性均在6 0 以上，蛋白质一级结构同源性均在7 0 以上，由此可见，b f g f 在氨基酸组成 上高度保守，这与它参与促有丝分裂的重要功能是紧密相关的。 从已报道的1 5 种1 8 k d a - b f g f 蛋白氨基酸序列分析，3 个灵长类( 人、猩猩、猴) 的同源 性高为1 0 0 ，而与4 个大型哺乳动物( 小尾寒羊、狗、牛、羊) 的同源性也高达9 8 ，与鼠 3 类、鸡的同源性逐渐下降到9 3 ，与两栖动物( 日本红腹蝾螈、爪蟾) 的同源性分别为8 6 和8 2 ，与水栖动物( 斑马鱼、虹鳟) 的亲缘关系更远，其同源性为7 4 从同源性比较 可以看出，尽管随着物种的进化程度升高，其同源性逐渐下降，但总的来看b f g f 的保守性 是较高的如此高的保守性，或许可以用作物种问进化分析的参考分子 3 b f g f 在动物体内的分布 b f g f 在动物体内分布极为广泛，尤其是神经组织中含量丰富。现已证实所有的器官、 实体组织、肿瘤和体外培养的细胞中都能检测到b f g f t v a s l 血液中一般检测不到b f g f ， 但已有大量的报道认为，在病理状态下( 如癌症、组织损伤等) 的血液中能检测到血液中的 b f g f 一般和a 2 一巨球蛋白或截短的f g f r i 结合m ”具有促进细胞分裂增殖的生物学活 性可能是其分布广泛的原因，另外，在体外培养的细胞具有自分泌b f g f 的功能，此时b f g f 的表达可能是使细胞在培养条件下生存的适应性反应 4b f g f 的释放与转位 5 种不同分子量形式的b f g f 在胞内合成后，1 8 - k d ab f g f 主要释放到胞外，而另4 种 h m w - b f g f 在胞内发生相应的转位与定位。b f g fm r n a 缺乏信号肽序列，不能经过经典 的途径发生转位与释放。己经有大量的研究结果表明，b f g f 可能采用自分泌或旁分泌的方 式释放到胞外，到目前为止，b f g f 精确的释放机制还没有阐明，除了因为细胞死亡或损伤 而将b f g f 释放之外，但该机制明显不是该细胞因子释放的主要途径，因为细胞死亡或损伤 所能释放的b f g f 的量极为低下，与细胞外基质中浓度不能吻合，因此，b f g f 可能存在一 种新的释放机制。通过对f g f - i 的研究发现，f g f 1 的释放可能与热失活蛋白及分子内= 硫键有关1 4 s m l ，而b f g f 与f g f o l 的分子结构极为相似，因此，f g f l 的释放机制可能对b f g f 释放机制的探讨有所借鉴。 h m w - b f g f 主要定位在细胞核研究发现，h m w - b f g f 的氨基末端存在核定位序列， 该序列可以将h m w - b f g f 引入胞核，而1 8 k d a - b f g f 分子内却存在一个抑制该分子向核转 运的结构，一旦该分子的n 末端延伸成h m w - b f g f ，该抑制序列即失去作用。 b f g f 可以通过e r g o l g i 途径分泌到胞外或向核内转运，因其没有信号肽序列而目前还 没有阐明其精确的机制，但w e s c h e1 5 0 l 等人的研究发现，在b f g f 向胞质或核转位的过程中， h s p 9 0 的抑制因子可以完全阻断这种转位过程，因此推测，h s p 9 0 在b f g f 通过胞内体膜时 所发生的转位是不可或缺的 5f g f 受体 4 分泌到胞外的b f g f 要传递信号到靶细胞，必须通过结合并激活细胞表面特异性受体。 目前已经发现b f g f 的主要细胞膜受体有4 种，f g f r i g ) 、f g f r 2 ( b e k ) 、f g f r 3 和f g f r 4 ， 它们为一组1 如激酶受体i ”“l 。4 种f g f p s 为4 个不同基因的产物，它们具有相同的结构， 都包含一个胞外配体结合区、一个单跨膜区和一个保守的胞内区胞内区分为t y r 激酶区和 一个c 末端尾部，t y r 激酶区被一个带有激酶活性的1 4 肽一分为二胞外配体结合区含有3 个i g 样环，l o o pi 、i i 和。l o o pi 、之间有一个由4 8 个酸性氨基酸组成的酸盒。l o o p i i 和l o o p l l i 联合起来主效结合配体，该区域主要由l o o p m 的c 端指令结合的特异性，l o o p i c 端的m r n a 的选择性剪接产生几种形式的f g f r s ，它们带有唯一的配体结合特异性。 f g f r l - 3 的配体结合特异性位于i o o p l l ic 端的半区内，f g f r 4 有一个外显子编码l o o p l ic 端半区，f g f r i - 3 则有三个选择性的可剪接外显子( i a m b 、c ) 编码该区域，m a 表 达产生分泌型受体，而m b 、c 编码膜锚定型受体对于f g f r i ，有一个包含i i i a 的分泌 型受体和包含i i i b 、m c 的膜锚定型受体i ，”，分泌型f g f r i 可能参与竞争结合f g f ，从而调 节f g f 所诱导的反应，f g f r 2 和f g f r 3 为仅包含b 、i l k 的受体i ”。外显子的选择性 表达可调节配体的结合特异性，外显子的偏爱使用可能缘于阻遏物的出现，该机制已从 f g f r 2 基因由m b 或i i i c 外显子剪接所产生而得到证明。l o o p 虽没有可选择性剪接形式， 但也可参与结合特异性 6 0 1 ，相比较而言，l o o pi 却仅出现于某些受体，可影响受体的亲和性 而不影响特异性【6 l l 。对f g f i 一3 的亲和性，f g f r i 一3 差异不大，而f g f r 4 却存在不同的结 合能力。 已发现第五种f g f r ，在结构上不同于其他f g f r ，是一个完整的膜蛋白，包含一个含 有1 6 个c y s 的重复序列的胞外结构域1 6 2 1 该受体亚型的配体特异性尚不太清楚，尽管能结 合f g f - 1 ，2 ，3 以及4 同时该受体不具备固定的信号转导特性，其功能目前也不得而知 m a r c e l l e 等 6 3 1 在禽胚胎发现一种新的受体f g e k ，并推测可能参与骨髂肌的早期分化另一 种f g f r 同工型受体是e 选择蛋白配体e s l - i ，该受体除n 端7 0 个氨基酸外，与c y s 富集 受体的同源性高达9 4 ，其岩藻糖基化对结合e 选择蛋白是必要的 6 4 j 目前对该同工型受 体研究不多见，因此，其具体的功能与作用机制仍不明了 除了以上4 种主要的高亲和性f g f r 外，细胞表面与细胞外基质中还存在一类b f g f 的 低亲和性受体，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖( h s p g s ) l “”，胞外b f g f 牢固的结合h s p g s ， 不仅可以限制b f g f 的扩散，还可以稳定b f g f 构像，防止b f g f 发生变性与被降解。另外， h s p g s 还可增强b f g f 与受体阃的相互作用 6 8 , 6 9 1 ，促进b f g f - f g f r 复合物的形成，使复合 物更加稳定1 7 q 。研究发现，h s p g s 对于b f g f 与f g f r s 的结合是必须的，没有h s p g s 的参 与，b f g f 将不能与f g f r s 发生有效的结合，而且，h s p g s 的这种促进作用发生的必备条 件是h s p g s 必须存在于细胞表面1 7 “目前的证据表明，多糖与b f g f 以及f g f r s 的结合是 选择性的，在与b f g f 和f g f r s 发生结合的h s p g s 不仅必须具有合适的结构，而且还应具 5 有相应的结合位点。j a s t r e b o v a 等唧1 人发现，f g f l 、b f g f 在与f g f r i c 、f g f r 2 c 和f g f r 3 e 发生结合时，对参与的寡糖没有选择性，但b f g f 对糖的要求比f g f l 相对较高，而f g f i 和b f g f 与f g f r 4 的结合却对糖存在不同的要求 1 f一 i 一 - _ jb 一 j 蕊 i 图2 f g f r 结构不意图 f i g 1 s 自r n c t u r s lm o d do f f i b r o b l u tg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r s h s p g s 对于b f g f 的功能发挥着极为重要的作用l a r r a i n 等人研究发现，s y n d e e a n - i ( 一种跨膜h s p g ) 的表达量下降会削减b f g f 的信号，而促进生肌细胞分化过程，s y n d e c a n l 在肌肉细胞分化阶段表达下调，从而导致生肌细胞进入分化阶段1 7 3 1 ，s y n d e c a n l 的表达通 过b f g f 作用机制来抑制生肌细胞的分化1 7 4 1 对于4 种高亲和性受体来说，在2 3 种f g f s 中。只有f g f 1 才能激活所有的f g f r s ， 包括f g f r i 3 的b 和c 两种剪接变体受体以及f g f r 4 ，而b f g f 却只能激活除f g f r 2 b 和f g f r 3 b 之外的其他受体l 嘲。在7 种细胞表面f g f r s ( f g f r l b l c 、f g f r 2 b 陀c 、f g f r 3 b 3 c 、 f g f r 4 ) 中，b f g f 对f g f r l c 、f g f r 3 c 和f g f r 4 具有最高的特异性【7 5 l 。 6b f g f 作用机制 胞外可溶的b f g f 在低亲和性受体h s p g s 的作用下，与细胞表面高亲和性受体f g f r s 结合成稳定的三元复合物，f g f r 发生二聚化并被激活，从而激活下游的信号分子发生相应 的信号事件。 6 目前已有大量的研究结果表明，4 种高亲和性受体选择性的表达于各种细胞表面，不同 的细胞以及同一细胞不同的生长与分化状态却表达不同的f g f r s ，f g f r 的分布有组织特异 性。大致来说，f g f r l 主要是在中胚层起源的组织中表达，f g f r 2 在内胚层起源的组织中 表达，f g f r 3 在神经发育和神经组织中表达，f g f r 4 是在小鼠发育时的内胚层高表达，同 时还分布于肌肉、肝、胆、肺和肾等组织中v a i ln e c k 等 7 6 1 入报道，在新生和成年大鼠的 平滑肌细胞膜上，f g f r i ，f g f r 2 和f g f r 4 均有表达，而f g f r 3 仅表达在新生大鼠的平 滑肌细胞表面；h s u 等【7 ”发现在小鼠嗅上皮细胞有f g f r l b 、f g f r i c 和f g f r 2 b 表达，其 他受体未发生表达，固有膜细胞中表达了除f g f r 4 外其他6 种f g f r ；人胎盘小胶质细胞 表面f g f r i , - 4 均有表达 t s l ；b e n - h a r o u s h 等 7 9 1 对青年人和胎儿的卵泡进行了较为详细的研 究，结果详见表l 。 一 s u m m a r y o f 砸m w r 吣k i r 墙f o r 砰o f a m i t s m