（材料学专业论文）二氧化硅表面环氧改性及其吸附天然胶乳中蛋白质的研究.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者签名： 王犀日期：矽f d 年r 月日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和 汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名： 五翠 日期：w io 年上月日 导师签名：才才红琵 日期：z o ，年b - 月z z 日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交 “c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。回童迨塞 提交后滞后：口半年：口一年：口二年发布。 - _ _ _ 一i t i - 论文作者签名：壬】军 日期：pj d 年j 月名日 导师签名：刃吁多芬琵 日期：多口，口年f 月多占日 摘要 本文利用碱性条件下环氧基能与蛋白质上的氨基反应的特性，用带有环氧基的硅烷 偶联剂k h 5 6 0 对s i 0 2 粒子进行表面改性，并用其处理天然胶乳，使天然胶乳中的蛋白质 吸附在改性s i 0 2 粒子表面，在天然胶乳离心制备浓缩胶乳的过程中，通过离心作用，将 改性的s i 0 2 粒子及其表面吸附的蛋白质分离出去，从而达到降低天然胶乳中蛋白质含量 的目的；并讨论了改性s i 0 2 粒子用量，改性s i 0 2 粒子的处理时间，鲜胶乳的氨含量和 胶乳体系p h 值对蛋白质分离效果的影响。 结果表明，以甲苯为反应溶剂，用硅烷偶联剂k h 5 6 0 对s i 0 2 粒子进行表面改性，在 k h 5 6 0 质量分数为5 1 ，温度1 1 0 ，反应时间8 h 左右时，改性s i 0 2 粒子表面亲油化度 为7 3 2 ，改性效果最好。红外光谱研究表明，k h 5 6 0 是以化学键的形式结合在s i 0 2 粒 子的表面，并在9 0 8 2 3 c f f l 附近处出现环氧基的特征吸收峰。 改性后的s i 0 2 粒子能有效地吸附并分离天然胶乳中的蛋白质，实验结果表明，当改 性s i 0 2 粒子用量为1 ，处理时间为6 h ，氨含量为0 3 ，p h 值为8 9 时，天然胶乳中的 氮含量由0 4 3 8 7 下降到0 2 2 9 3 ，约降低了4 8 。处理胶乳后改性s i 0 2 粒子的红外谱 图表明，胶乳中的蛋白质通过化学键结合在s i 0 2 粒子的表面，并在1 5 7 7 c m 1 和1 3 5 0 c m 1 出现c n 键的特征吸收峰。 处理后胶乳的胶体性质、胶乳贮存性质及硫化胶膜物机性能研究表明，处理后胶乳 的胶体性质、机械稳定性、热稳定性及粘度都和对照胶乳相差不大，而硫化胶膜的定伸 应力和老化性能则有所降低。 关键词：天然胶乳，k h 5 6 0 ，s i 0 2 表面改性，氮含量，吸附分离 a b s t r a c t an e wa p p r o a c ht oa d s o r ba n ds e p a r a t et h ep r o t e i no fn a t u r a lr u b b e rl a t e xw a s i n v e s t i g a t e db yu s i n gt h e r e a c t i o nb e t w e e nt h es u r f a c ee p o x ym o d i f i e ds i 0 2a n dt h e a m i n o g r o u po fp r o t e i ni nt h i sp a p e r i ti s k n o w nt h a tt h ee p o x yg r o u pc o u l dr e a c tw i t h a m i n o - g r o u pu n d e rb a s i cc o n d i t i o n , s oas u r f a c ee p o x y m o d i f i e ds i 0 2w a sp r e p a r e da n dw a s u s e dt ot r e a tn r l a f t e rt h er e a c t i o nb e t w e e nt h ee p o x yg r o u pa n dt h ea m i n o g r o u p ，t h e p r o t e i no fn r lw a sa t t a c h e dt ot h es u r f a c eo fs i 0 2 w 1 1 i l et h en r l w a sc e n t r i f u g e dt o p r o d u c ec o n c e n t r a t e dn r l ，t h es i 0 2a n dt h ep r o t e i na t t a c h e dt ot h es u r f a c eo fs i 0 2w e r e s e p a r a t e df r o mn r l t h er e s u l t ss h o w e d 也矾u s i n gt o l u e n e 勰as o l v e n t ，w h i l et h em a s sf r a c t i o no fk h 5 6 0 w a si n5 1 ，m o d i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ew a s1 1 0 ，t h er e a c t i o nt i m ew a sa b o u t8h o u r s ，t h e l i p o p h i l i cd e g r e eo fm o d i f i e ds i 0 2p a r t i c l ew a s7 3 2 f t i rs p e c t r u mi n d i c a t e dt h a tk h 5 6 0 w a sc o m b i n e dt ot h es u r f a c eo fs i 0 2p a r t i c l eb yc h e m i c a lb o n d ，a n dt h ee p o x yg r o u pk e p tn o c h a n g e t h em o d i f i e ds i 0 2p a r t i c l ec o u l de f f e c t l ya d s o r ba n ds e p a r a t et h ep r o t e i d eo fn a t u a l r u b b e rl a t e x n 圮r e s u l ts h o w e dt h a tt h en i t r o g e nc o n t e n t si nn a t u r a lr u b b e rl a t e xh a dc o m e d o w nf r o m0 4 38 7 t o0 2 2 9 3 ，a b o u t4 8 _ r e d u c a t i o n , w h e nt h ea m o u n to fm o d i f i e ds i 0 2 p a r t i c l ew a s1 ，t r e a t m e n tt i m ew a s6h o u r s ，a m m o n i ac o n t e n tw a s0 3 ，p hv a l u ew a s8 9 a tt h es a n l et i m e ，t h ef t i rs p e c t r u mo fm o d i f i e ds i 0 2p a r t i c l ea f t e rt r e a t i n gn a t u r a lr u b b e r l a t e xa p p e a r e dn e wc h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a ki n15 7 7 c m 吐a n d13 5 0 c m 1 , i n d i c a t e dt h e p r o t e i ni nn a t u r a lr u b b e rl a t e xa t t a c h e dt o t h es u r f a c eo fm o d i f i e ds i 0 2p a r t i c l et h r o u g h c h e r n i c a lb o n d n l ec o l l o i d a lp r o p e r t i e s 、t h es t o r a g ep r o p e r t i e so ft r e a t e dc o n c e n t r a t i o nn a t u r a lr u b b e r l a t e xa n dt h em e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fv u l c a n i z e df i l m ss h o w e dt h a tt h ec o l l o i d a lp r o p e r t i e s 、 t h em e c h a n i c a ls t a b i l i t y 、t h et h e r m o s t a b i l i t ya n dv i s c o s i t yh a dl i t t l ed i f f e r e n c ec o m p a r i n g 、析t l l c o n t r a s t i n gn r l ，b u tt h em o d u l u sa n da g i n gp r o p e r t yo fv u l c a n i z e df i l m sw e r ea l i t t l el o w e r t h a nt h eo n t r a s t i n gn r l k e y w o r d s ：n a t u r er u b b e rl a t e x ，k h 5 6 0 ，s i 0 2s u r f a c em o d i f i c a t i o n ，n i t r o g e nc o n t e n t ， a d s o r p t i o na n ds e p a r a t i o n 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1 前言1 1 1 蛋白质吸附分离的研究进展1 1 1 1 蛋白质的分子结构l 1 1 2 蛋白质吸附的理论分析2 1 1 3 蛋白质与表面活性剂的相互作用3 1 1 3 1 蛋白质一表面活性剂的界面吸附4 1 1 3 2 表面活性剂一蛋白质复合物结构的研究5 1 1 3 3 蛋白质吸附表面活性剂的测定方法6 1 1 4 蛋白质的分离6 1 1 4 1 根据蛋白质溶解度不同进行分离6 1 1 4 2 利用有机溶剂进行分离7 1 1 4 3 根据蛋白质带电性质进行分离7 1 1 4 4 根据配体特异性进行分离8 1 1 4 5 用磁性高分子纳米颗粒进行分离8 1 1 4 6 用壳聚糖衍生物进行改性分离8 1 1 4 7 用二氧化硅做载体的改性分离9 1 2 低蛋白天然胶乳的研究进展9 1 2 1 低蛋白天然胶乳研究的意义9 1 2 2 国内外低蛋白天然胶乳的制备方法1 2 1 2 2 1 酶处理法1 2 1 2 2 2 表面氯化处理法1 2 1 2 2 3 多次离心洗涤法1 3 1 2 2 4 沥滤法1 3 1 2 2 5 辐射法1 4 1 2 2 6 吸附置换法1 5 1 2 2 7 综合法1 5 1 3 本课题研究的目的意义及其创新性1 5 1 3 1 本课题研究的目的和意义1 5 1 3 2 本课题研究的主要内容及创新之处1 6 2 材料与方法1 7 2 1 主要原材料和药品1 7 2 2 仪器设备1 7 2 3 技术路线1 8 2 4 实验方法1 9 2 4 1s i 0 2 粒子的表面改性1 9 i l i 2 4 2 改性s i 0 2 粒子对天然胶乳中蛋白质的吸附分离1 9 2 4 3 对照浓缩胶乳( n r l ) 的制备1 9 2 4 4 硫化胶膜的制备1 9 2 5 分析表征2 0 2 5 1 傅里叶红外光谱分析( f t i r ) 2 0 2 5 2 改性后s i 0 2 粒子亲油化度的测定2 0 2 5 3 胶乳胶膜氮含量的测定2 1 2 5 4 去蛋白后胶乳胶体性质的测试2 l 2 5 5 胶乳硫化胶膜物理机械性能的测试2 2 2 5 6 热重分析( t g ) 2 3 3 结果与讨论2 4 3 1si0 2 粒子表面改性工艺的研究2 4 3 1 1k h 5 6 0 的用量对改性s i 0 2 粒子表面亲油化度的影响2 5 3 1 2 改性温度对改性s i 0 2 粒子表面亲油化度的影响2 6 3 1 3 改性时间对改性s i 0 2 粒子表面亲油化度的影响2 7 3 1 4 改性s i 0 2 粒子的红外光谱表征2 7 3 1 5 小结2 8 3 2 改性s i0 2 粒子吸附分离天然胶乳中蛋白质的研究2 8 3 2 1 改性s i 0 2 粒子的用量对天然胶乳氮含量的影响2 9 3 2 2 处理时间对胶乳氮含量的影响3 0 3 2 3 鲜胶乳氨含量对处理胶乳氮含量的影响3 1 3 2 4 鲜胶乳p h 值对处理胶乳氮含量的影响3 l 3 2 5 处理胶乳前后改性s i 啦粒子的红外谱图3 2 3 2 6 小结3 3 3 3 处理后浓缩胶乳的胶体性质及硫化胶膜的物机性能3 4 3 3 1 处理后浓缩胶乳的胶体性质3 4 3 3 2 处理后浓缩胶乳的贮存性质3 4 3 3 3 硫化胶膜的物机性能3 5 3 3 4 硫化胶膜的溶胀度和交联度3 5 3 4 热重分析3 6 4 结论3 9 参考文献4 0 i v 1 刖吾 1 1 蛋白质吸附分离的研究进展 蛋白质是具有生物活性的高聚物分子，是生命现象的体现者，结构复杂【l 】。目前，蛋 白质的吸附和分离已经成为非常重要活跃的研究领域，然而由于生物自身特性和反应过 程机理十分复杂，反应较难控制，反应液杂质含量多，且目标产物又比较低。这给蛋白 质的分离纯化带来极大不便。因此研究蛋白质在界面上的吸附对于了解蛋白质在界面上 的吸附及分离提取蛋白质具有重要意义。 1 1 1 蛋白质的分子结构 蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸之间是由肽键相连，两分子氨基酸形成二肽，三分 子氨基酸连接称为三肽，以此类推，由多个氨基酸借肽键相连形成多肽。肽键和酰胺键 一样，由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用从而表现出较高的稳定性。 肽键的结构实际上是一个共振杂化体。氧原子的离域形成了包括肽键的o 、c 和酰胺n 在内的一n 嚣轨道系统，从而使得肽键的c - n 键具有双键的性质却不能自由旋转。肽 键的c ，0 ，n ，h 和相邻的两个q 碳原子处在同一个平面，被叫做肽平面【2 1 。肽链主链上 的q 碳原子连接的两个键c 刈键和c 一键能够自由旋转，其旋转角度通常用二面角巾 和1 l ，来表示，如图1 1 所示。 l ￥ r o l 鬟 i 图1 1 肽链结构图 e 戮 0 f i g1 1 t h es t r u c t u r eo fp e p t i d ec h a i n 蛋白质一般有四级结构。多肽链中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构，也是 蛋白质最基本的结构，而肽键是蛋白质一级结构的主要化学键。蛋白质的二级结构，是 指多肽链主链骨架在各个局部由于折叠、盘曲而形成的空间结构，其主要形式是q 一螺 旋和b 一折叠。蛋白质的三级结构，是指在二级结构基础上，多肽链进一步折叠、盘曲， 主链、侧链都包括在内所形成的空间结构，即多肽链的整体构象。蛋白质的四级结构， 是指由两条以上具有三级结构的多肽链，通过非共价键聚合而成的特定空间结构。在具 有四级结构的蛋白质分子中，每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。 1 1 2 蛋白质吸附的理论分析 大部分蛋白质与材料表面的相互作用会导致吸附。在液一固界面上的物理吸附主要 是由于离子或极性相互作用、氢键、疏水作用、范德华力等造成的。因此蛋白质复杂的 表面决定了它与吸附表面存在多种形式的相互作用。 研究表明，蛋白质在吸附过程中的相互作用主要包括氢键、静电和疏水作用等p j 。 这3 种相互作用的本质都与静电作用有关。氢键的形成是因为电负性原子与氢形成的基 团中，氢原子周围分布的电子少，正电荷氢与另一电负性强的原子之间产生静电吸引， 而形成氢键。而疏水相互作用又叫做非极性相互作用，多发生在非极性基团之间。蛋白 质分子同时有极性和非极性的基团，当蛋白质在水溶液时，极性基团之间以及极性基团 与水分子之间易发生静电吸引，从而排开非极性水基团，因此疏水相互作用不是疏水基 团之间有吸引力，而是非极性基团避开水而被迫紧靠【4 】。这些相互作用与小分子的吸附 没有差别。而蛋白质吸附的独特性在于吸附的是大分子，并且吸附过程中它会发生各种 物理和化学的变化。 e l o r b e t t 3 】认为，初始的吸附现象是瞬间的，并且会伴随吸附层的结构重整及再组织 化。这种结构重整除了会降低系统的吉布斯自由能外，还会使吸附层上的蛋白质有变性 或分子展开的效应，使原本被包覆在内部的疏水性氨基显露出来。n o r d e 5 j 等对不带电的 聚甲醛和牛血清蛋白进行研究，表明蛋白质浓度升高时吸附量也相应升高，当b s a 浓度 达n o 6 9 l 时得到最大吸附值( 3 m g i i l 2 ) ，之后吸附量不再与蛋白质浓度有关。a l | e r r l 6 j 等研究发现，蛋白质在等电点时有最大的吸附量，且在等电点附近呈对称分布。原因有 两点，蛋白质在等电点时具有最小溶解度，此时所需的吸附能量最低；静电排斥力 在等电点时最小。 由肽链结构可知，无论多长的肽链，其一端一定有一个游离的氨基( n h 3 + ) ，而另一 端有一个游离的羧基( c o o h ) 。根据蛋白质种类不同，组成肽链的氨基酸系列会有所不同。 如碱性氨基酸( 如赖氨酸) 有两个n h 2 ，而酸性氨基酸( 如谷氨酸) 有两个羧基，形成肽链 只用一个氨基和羧基，在肽链表面保持一个自由氨基或羧基，这使蛋白质表面带正电和 负电。蛋白质是两性电解质，所处不同的p h 值溶液，表面净电荷或正或负。蛋白质的吸 附性是有其三维空间结构和表面酸性氨基酸及碱性氨基酸基团的密度决定的。它表面含 有带负电的酸性氨基酸基团和带正电的碱性氨基酸基团，所以研究认为蛋白质在材料表 面的吸附过程，主要是通过蛋白的表面电荷与吸附基体表面的相反电荷发生静电吸引作 用而建立离子键【7 l 。因此控制肽链的侧链氨基酸基团表面上的自由氨基n h 3 和羧基c o o - 成为控制蛋白质在材料表面吸附行为的主要因素1 8 1 。 2 b r a s h 和l y m a n 等 1 2 j 认为，血浆蛋白质在高分子材料表面的吸附，主要取决于其在 血浆中的浓度，与材料的性质和蛋白质的种类关系不大。v r o m a n 和a d a m s 等【l3 j 则认为血 液中各种蛋白质在高分子材料表面的吸附量，虽然与蛋白质在血液中的浓度有关联，但 更取决于蛋白质的种类和材料表面的性质。b r a s h 、l y m a n 和b a le r 1 4 j 等通过研究蛋白 质吸附层组成对抗凝血性的影响，表明吸附白蛋白的高分子材料，对血小板的吸附量最 少，并且表现出很好的抗凝血性；而吸附纤维蛋白原和y 一球蛋白的则恰恰相反。 研究高分子材料在一种蛋白质溶液中的吸附作用，虽然有利于阐明蛋白质在材料表 面吸附的规律以及不同蛋白质吸附层对抗凝血性的影响，但却无法了解在吸附过程中各 种蛋白质之间的相互影响和竞争，并且与高分子材料在血液中对血浆蛋白质吸附的实际 情况相差很多。因此，b r a s h 、k i m 、l e e 、f a i b 、c o o p e r 及k o c h w a 等用放射性同位素 标记的方法研究了高分子材料在白蛋白、y 一球蛋白、纤维蛋白原等混合蛋白质溶液中 的竞争吸附作用。结果表明，在竞争性吸附作用中，各种蛋白质的吸附量最后趋于平稳， 而且比相同的材料在单一蛋白质溶液中的吸附量要低。材料表面吸附的一种蛋白质可以 被溶液中的另一种蛋白质所交换，且交换程度与高分子材料的种类有关，亲水凝胶表面 吸附的蛋白质易发生交换作用，而疏水性高分子材料的则基本上不会发生。 9 0 年代，邱永兴等【l5 j 用放射碘同位素标记技术研究了三种血浆蛋白质( 白蛋白、免 疫球蛋白或纤维蛋白原) 在聚苯乙烯一g - ( 十八烷聚氧乙烯) 接枝共聚物表面的吸附动力 学、等温吸附和竞争吸附。结果表明吸附能力最大的是纤维蛋白原，免疫球蛋白次之， 白蛋白最小。胡勇等【1 6 j 用椭圆偏振术研究了牛血清白蛋白( b s a ) 及人纤维蛋白原( f g n ) 在亲水硅片表面上的吸附行为。结果表明，f g n 在聚氨酯表面上的吸附速率和饱和吸附 量都比该蛋白质在亲水硅片表面上的吸附要低，说明亲水硅片的血液相容性比聚氨酯差 得多。 肖才德等【1 7 】用表面等离激元( s p r ) 传感器，测量了几种材料表面对纤维蛋白原的吸 附特性。实验表明，材料表面对纤维蛋白原的吸附与材料的血液相容性密切相关。接着 王东安等【l8 j 利用衰减全反射傅立叶变换红外光谱( a t r - f t - ir ) ，形成了对材料表面蛋白 质吸附行为的定量分析方法。还采用这种方法对牛血清白蛋白( b s a ) 在聚醚氨酯( p e u ) 涂 覆改性材料表面的静态吸附进行了定量表征。计剑掣1 9 l 利用1 2 5l 放射标记方式研究了纤 维蛋白原和白蛋白在聚甲基丙烯酸甲酯接枝十八烷基聚氧乙烯( p m m a - g s p e o ) 表面上的 静态吸附行为。研究认为疏水性的界面能够提高白蛋白的吸附量，并且聚氧乙烯( p e o ) 链可以发挥阻抗作用。 1 1 3 蛋白质与表面活性剂的相互作用 第一篇综述表面活性剂与蛋白质的相互作用的文章是在1 9 6 9 年，这篇论文全面总结 了这一领域的早期工作，为研究表面活性剂与蛋白质相互作用奠定了基础。 3 蛋白质与表面活性剂的相互作用，主要分为电性和疏水性相互作用两部分，这使得 它们之间的相互作用比较复杂。周筠梅【2 0 】等用疏水柱在f p l c 仪上测定了部分蛋白的表面 疏水性。结果表明，蛋白质的疏水性与材料表面性质密切相关，而与蛋白质的分子量和 疏水残基数目并不是直接相关。j o n e s l 2 1 】等研究认为，从动力学和热力学的角度分析表 明，表面活性剂和蛋白质的相互作用主要体现在3 个方面，即表面活性剂一蛋白质复合物 结构的研究及蛋白质结构的变化、表面活性剂一蛋白质混合溶液的相行为、表面活性剂一 蛋白质混合溶液的界面吸附。李学刚等【2 2 1 利用表面张力法研究t s d s 和肌酸激酶的相互 作用。在蛋白质溶液中加入带相反电荷的表面活性剂，使电荷中和，此时复合体的净电 量减少到零，再加入了一些疏水基，使复合体的水溶性下降，沉淀析出。结果表明，随着 表面活性剂量的增加，表面活性剂吸附量达1 4 9s d s g 蛋白质，复合体带净电荷也相应增 加，水溶性增加，沉淀又再次溶解。 l e v i t z 圆通过研究具有长极性链非表面活性剂烷基苯酚聚乙烯已二醇的表面作用， 表明聚乙烯链( p o e ) 比离子型表面活性剂的相互排斥力要弱，吸附后的形态像伸展的皇 冠状一样。p a l a n i y a r 等 2 4 1 对磷脂和肺部的一种主要亲水蛋白质( s p a ) 的相互作用进行 了研究，发现了一种“花束”状吸附结构，并用电镜观测其微观结构。表明吸附过程中加 二价离子，蛋白质和磷脂层的结构会发生改变。r u s o 等【2 5 】对不同表面活性剂一蛋白质比率 下全氟表面活性剂与溶菌酶的相互作用进行了研究。实验表明，酶的构型基本保持不变， 只有二级结构稍微发生变化。这是因为c f 键的刚性，阻碍了氟原子的疏水相互作用，因 此造成主要相互作用是静电作用。g o r o k h o v a 等 2 6 1 利用l o n g m u i r - - b l o d g e t t 单层技术研 究了四种表面活性助沉降剂( 它们的疏水基团相同) 固定化脂肪酶。发现复合物的一a ( a 为分子面积) 曲线趋势与纯的表面活性剂有很大的差别，这证明几种表面活性剂与 脂肪酶存在相互作用。表面电势能可以用来表征单层分子电偶级的方位，表面电势能越 大，偶极相互作用力越显著。 1 1 3 1 蛋白质一表面活性剂的界面吸附 蛋白质与表面活性剂的相互作用能显著改变界面吸附层的性质，从而对乳状液及泡 沫等分散体系的稳定性产生重要影响。d i c k i n s i o n 2 7 2 s 】提出蛋白质一表面活性剂混合体 系界面吸附的两种机理，( 1 ) 增溶机理。分散在材料表面的蛋白质与水溶性的表面活性 剂形成蛋白质一表面活性剂复合物，使蛋白质分子以复合物的形式进入水相。此时，它们 有强烈的相互作用。( 2 ) 置换机理。由于表面活性剂与表面的相面上分散的蛋白质被表 面活性剂置换下来。这时表面活性剂必须强烈地吸附于表面。一般来说离子型表面活性 剂与蛋白质的混合体系是增溶机理，而非离子型表面活性剂与蛋白质的混合体系主要是 置换机理。 l e a v e r 等【2 9 】利用磺化聚苯乙烯乳胶膜作为表面，测定了t w e e n2 0 对p 一酪蛋白的 4 置换量及置换过程中吸附层的水化厚度。结果表明，随着t w e e n2 0 质量分数的增加， 蛋白质被置换下来，而吸附层的水化厚度则降低，t w e e n2 0 的加入降低了以蛋白质为乳 化剂的乳液的稳定性。 g u n n i n g t 3 0 】通过研究气液界面上p 一酪蛋白和卢一乳球蛋白被非离子型表面活性 剂t w e e n2 0 、t w e e n6 0 和离子型表面活性剂s d s ，c t a b 、十二酞溶血卵磷脂置换的过程。 结果表明，非离子型表面活性剂与蛋白质的置换行为和离子型表面活性剂与蛋白质的置 换行为又稍微不同。离子型表面活性剂与蛋白质的置换主要是表面活性剂微区的成核并 伴随少数微区的生长，而非离子型表面活性剂与蛋白质的置换既包括微区的成核又包括 微区的生长。 1 1 3 2 表面活性剂一蛋白质复合物结构的研究 早期研究认为蛋白质一表面活性剂复合物的结构存在3 种结构模型【3 1 1 ，项链模型、 棒状模型和柔软的螺旋状模型，如图1 2 所示。 l 童) 项链摸磺 tb ) 棒状模黧 lc 螺旋状横璎 图1 2 聚合物一表面活性剂复合物结构图 f i g1 2t h es t r u c t u r eo fp o l y m e r s u r f a c t a n tc o m p o s i t e s 随着应用n m r 、光散射、荧光和电子自旋共振等技术，也加深认识了复合物的结构和 结合过程。n i c h o l a s 等【3 2 】利用芘为探针，测定了含与不含b s a 的s d s 溶液的荧光发射光 谱，从不同条件下第三峰与第一峰强度的比值随s d s 浓度的变化，推断出复合物的结构符 合“项链 状模型。同时由芘的基激缔合物衰减曲线求得聚集体的聚集数，进一步证明 了“项链”状模型的存在。他还采用h 1 n m r 技术测定了亲水基a 一碳氘代s d s ( 1 ，卜2 h 2 s d s ) 和尾基碳氘代s d s ( c 1 2 2 h 1 2 0 s 0 3 - n a ) 两种表面活性剂与蛋白质形成的复合物。实验表明， 表面活性剂头基的移动性减弱而尾基移动性却不变。这说明复合物形成后将表面活性剂 的头基包裹了起来。 m a r i l e n a 等吲系统地研究了球形蛋白分别与阴离子型、阳离子型和非离子型表面 活性剂所形成的复合物的结构。实验结果表明，与复合物是项链状结构的结论相吻合。 1 1 3 3 蛋白质吸附表面活性剂的测定方法 研究表面活性剂与蛋白质相互作用的1 个重要方面，就是测定蛋白质与表面活性剂 的结合量。一般来说，测定蛋白质吸附表面活性剂的方法是渗透平衡法 。但该法不 仅复杂、耗时，而且不精确。李学刚等【3 4 l 提出了采用阴、阳离子表面活性剂互滴定和表 面张力两种方法测定蛋白质和表面活性剂的结合量，结果颇为相近，这说明此2 法在测定 蛋白质对表面活性剂吸附方面是可行的。 荧光技术作为研究蛋白质结构变化的一种传统的研究聚集体的方法。其原理是通过 使激发波长与入射波长保持固定的波长间距，同步扫描激发和发射单色器，可以得到同 步荧光光谱。根据发射光谱中波长的改变可判断出蛋白质构象的变化。同步荧光光谱技 术已广泛应用在蛋白质与药物相互作用的研究中。将这种技术应用在蛋白质与表面活性 剂相互作用的研究中将会发挥非常重要的作用。 界面剪切流变测定法也可以作为研究蛋白质和低分子量表面活性剂之间的相互作 用的一种方法。n m r 弛豫技术通过测定亲水基q 一碳氘代表面活性剂的旋转弛豫速率来表 征蛋白质一表面活性剂复合物的微观结构。聚集体越大，横向弛豫速率的值越大，纵向 弛豫速率与相互作用有关。 冷冻蚀刻电镜( c r y o t e m ) 可以用在纳米层次上直接观察蛋白质分子、蛋白质一表面 活性剂聚集体以及它们在稀溶液中的形貌变化，是一种比n m r 更定量的技术。 1 1 4 蛋白质的分离 根据蛋白质的分子大的特点，可以用凝胶过滤法、超滤法、盐析法、离心法及透析 法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。如顾有方等【3 5 】 就是根据蛋白质的这种特性将血液中免疫球蛋白提取出来的。 1 1 4 1 根据蛋白质溶解度不同进行分离 6 蛋白质的溶解度受溶液体系的p h 、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素 的影响。在同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度。盐析法是根据不同蛋白质 在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度不同而达到彼此分离的方法。中性盐对蛋白质的 溶解度有显著影响，一般是在低盐浓度下，随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度也不断 增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度在不同程度下降并先后析出， 这种现象称盐析。将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子( 如硫酸铵的s 0 4 和) 有很强的水化力，可以夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水 ，于是蛋白质胶粒凝结 并沉淀析出。蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种 蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液体系的p h 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀， 但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。胡卫新等【3 6 1 在室温下，利用盐析和等电点沉 淀工艺分离除去了提取液中的大豆蛋白质。 1 1 4 2 利用有机溶剂进行分离 有机溶剂能显著降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，使溶解 度降低。有机溶剂与水作用能够破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质能在一定浓度的有机溶 剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，然而由于有机溶剂的加入易引起蛋白质 的变性失活，尤其是乙醇和水混合释放热量，操作应该在低温下进行，且在加入有机溶 剂时要搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法析出的沉淀一般来说比盐析法容易过滤或者 离心沉降。分离出来的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。 操作时的体系p h 值应控制在待沉淀蛋白质等电点附近。有机溶剂在中性盐存在时可增 加蛋白质的溶解度，减少变性及提高分离的效果。实验证明，在有机溶剂沉淀时添加中 性盐的浓度应在0 0 5 m o l 左右，太多不仅耗费有机溶剂，而且会导致沉淀不好。沉淀的条 件旦确定，就必须严格控制，所以操作条件比盐析法严格。 很多有机溶剂，比如碳链较长的醇，它能溶于水，但有限量。其量大到一定程度后 则分为两相，一相是水为主，一相是有机溶剂为主。有很多蛋白质在两相中均能溶解， 形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。正因为如此， 要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽然一直有人在用但很不普遍。 1 1 4 3 根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同的p h 体系中带电性质和电荷数量不同，可以分为电泳法，离子交换 层析法。根绝蛋白质分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同，可以将蛋白质分 开。等电聚焦电泳是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极 到负极而逐渐增加的p h 梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点 的p h 位置就会停止。这种方法可用来分析和制备各种蛋白质。离子交换剂有阳离子交 换剂和阴离子交换剂，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换 7 剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变p h 或离子强度的办法将吸附 的蛋白质洗脱下来。翁瑜等【3 7 】利用双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法，可以看 出双向凝胶电泳的效果更好。 1 1 4 4 根据配体特异性进行分离 根据某些蛋白质与另一种称为配体( l i g a n d ) 的分子能特异而非共价地结合这种特 性，可以将蛋白质分离出来。其中亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，经 常只需经过一步处理就可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来， 而且纯度非常高。蛋白质是以复杂的混合物形式存在组织或细胞中，今还没有单独或一 套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往都是采取几种 方法联合使用。仝向荣等【3 8 】通过离子交换、凝胶过滤、亲和层析及反向高效液相色谱操 作，提取了棒纹牛蛭体内抗凝血蛋白。 1 1 4 5 用磁性高分子纳米颗粒进行分离 利用磁性高分子纳米颗粒在其表面进行改性引入具有生化活性的功能基团，结合各 种功能分子，在蛋白质分离领域得到了一定的应用。 利用磁性高分子纳米颗粒分离蛋白质的原理主要分为静电吸附分离【3 9 棚】和亲和分 离【4 2 】。静电吸附分离是指利用磁性高分子表面的电性，吸附带有相反电荷的生物分子， 经过清洗、解离和磁场分离，实现样品中蛋白质的选择性分离。亲和分离是指在磁性高 分子纳米颗粒上固定与目标蛋白具有特异性结合作用的亲和配基，通过亲和吸附、清洗、 解吸与磁场分离等操作，从原液中直接分离出目标蛋白。对于静电吸附原理，b u c a k p 9 】 等采用磷脂包裹的磁性纳米颗粒的表面负电性选择性的分离出了带正电荷的蛋白质。 l i a o 4 2 1 等人制备出一种离子交换效率高，吸附解离速度快的核壳型( f e 3 0 4 p 从) 磁性 纳米吸附介质。利用该磁性纳米吸附介质，c h e n 4 0 , 4 1 】等人成功分离出水相中的菠萝蛋白 酶。t a t o n 4 3 】研究小组成员基于亲和技术实现了目标蛋白的选择性分离，他们利用水溶 性磁性纳米颗粒表面的羧基，共价交联i d a 进而固定c u 2 + ，最终实现组氨酸标记蛋白的 捕获。其实验原理与x u 脚 4 5 】研究小组的类似，区别只是将原来的无机磁核首先包被了 p a a ，这样磁性纳米颗粒的磁响应特性增强，同时壳材料的保护也能够使该颗粒在生理 环境中稳定存在。s h a m i m 删等人利用n 一异丙基丙烯酰胺包裹磁性纳米颗粒的热敏性， 通过改变温度控制吸附或者解离，并成功的应用于牛血清白蛋白的分离。李静、丁焕平 等【4 7 】运用磁性纳米微粒( m a g n e t i cn a n o n m e t e rp a r i t c l e ，m n p ) 经过表面修饰，连接n h 2 集团作为分离器( n n p _ 州h 2 ) ，很容易地从生物样品中分离蛋白质。 1 1 4 6 用壳聚糖衍生物进行改性分离 壳聚糖为天然碱性多糖，生物相容性好，且易于衍生化，有良好的吸附性能，可直 8 接或经修饰后作为各种层析和蛋白质分离纯化的载体。壳聚糖 c h i t o s a n ，( 1 ，4 ) 一2 一氨 基一2 一脱氧一b d 一葡聚糖 是甲壳素 c h i t i n ，( 1 ，4 ) - 2 - 乙酰氨基- 2 - 脱氧一b - d - 葡聚糖 脱去n 一乙酰基的产物。不同脱乙酰度壳聚糖分子中，存在不同含量的2 一n 一乙酰氨基葡 萄糖和2 一氨基葡萄糖两种结构单元。甲壳素不溶于普通溶剂，可直接用于亲和层析。 壳聚糖可溶于某些酸性介质，经交联或修饰后能用作色谱填料。1 9 9 7 年刘满英掣4 8 】综 述了壳聚糖衍生物在蛋白质分离方面的应用。1 9 9 9 年z e n g 等综述了吸附膜的制各及 大孔甲壳素和壳聚糖膜在蛋白质分离中的应用。 王虹等【4 9 巧l 】研究了戊二醛交联壳聚糖吸附剂的性能，讨论了交联剂链长对壳聚糖树 脂吸附性能的影响。用反向悬浮法制备戊二醛交联壳聚糖树脂球形吸附剂，并用n a b h 4 氢化还原，以提高其化学稳定性。该树脂对尿毒症毒物具有一定吸附作用，吸附平衡时 间符合临床要求，对3 种小分子尿毒症毒物的吸附能力依肌酐、尿酸、尿素次序递增， 对促皮质素( a c t h ) 吸附量达1 3 m g g , 具有潜在临床应用价值。李湛勇等【5 2 5 5 】研究了 戊二醛交联壳聚糖树脂的制备及其血液相容性。该树脂对人血清白蛋白吸附量较低，用 乙醇胺封闭处理，可改善其血液相容性。 1 1 4 7 用二氧化硅做载体的改性分离 二氧化硅作为生物惰性材料，且具有良好的生物相容性，同时二氧化硅表面具有丰 富的硅羟基，有利于通过与其他化合物进行化学修饰反应实现表面功能化，可以键合不 同的官能团来满足不同的实际应用的要求。 文九巴【5 6 j 等利用固定金属离子亲和技术在不同表面形貌的硅基片上交联金属离子 螯合物次氨基三乙酸( n t a ) ，蛋白质分子通过其末端的组氨酸标记( h i s - t a g ) 与金属 离子螯合，定向结合在硅基片表面构成蛋白质芯片，考察了不同表面形貌的硅基片对蛋 白质的吸附行为。结果表明，硅基片的表面形貌对蛋白质的吸附行为有很大影响。硅基 片经碱蚀刻获得的绒面氧化后因其较大的比表面积、特殊的空间结构及较小的固液接触 角0 ，对蛋白质具有较强的吸附能力，螯合的蛋白质种类多、丰度大。 s i 0 2 粒子表面与偶联剂的连接主要有两种形式，一种是化学作用，s i 0 2 表面的硅羟 基易被极性的官能团，如氨基( n h 3 ) 、羧基( 弋o o h ) 、乙氧基( 珈r ) 等基团发生氢键、 酯化、极性相吸等较强的化学结合；另一种方式是物理吸附，偶联剂在范德华力作用下 被s i 0 2 表面吸附。通过利用二氧化硅表面具有丰富的硅羟基进行改性，键合不同的官能 团来满足应用的要求。这种方法不仅简便，工艺简单，有非常广阔的应用前景。 1 2 低蛋白天然胶乳的研究进展 1 2 1 低蛋白天然胶乳研究的意义 天然胶乳( n r l ) 是橡胶树乳管细胞中进行橡胶生物合成的高聚物水基型胶体体系， 9 具有优异的综合性能，如具有易胶凝、成膜性好、湿凝胶强度高、易于硫化，所得制品 弹性大、强度高、蠕变小【5 7 】等特点，特别是能形成超薄的膜，且不