（人体解剖与组织胚胎学专业论文）神经胶质细胞的干细胞抗原表型研究.pdf

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2 a 祖细胞表达 a 2 8 5 ，1 型星形胶质细胞表达g f a p 。 2 通过机械震荡和差速贴壁方法，有效分离了纯化的小胶质细胞，它们具有典 型的形态特征，并表达其细胞特异性分子o x 4 2 。 3 分离的o - 2 a 祖细胞经p d g f 作用，增殖而不出现分化，从而o - 2 a 祖细胞得 到纯化。 4 o - 2 a 祖细胞以无血清培养液培养，迅速分化为成熟的少突胶质细胞；在含高 达1 5 。2 0 f c s 的培液中生长，分化为2 型星形胶质细胞，特异性抗原表达为 a 2 8 5 + g f a p + 。 5 免疫荧光标记染色显示：分化成熟的2 型星形胶质细胞表达n e s t i n ，s s e a 一1 及 n g 2 ，小胶质细胞表达n e s t i n ，s s e a 一1 及n g 2 ，1 型星形胶质细胞不表达干细胞抗原 的某些抗 神经胶质细胞的干细胞抗原表 t h es t e mc e l la n t i g e np h e n o t y p eo fg l i a lc e l l s a b s t r a c t o b j e c t i v et oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fn e u r a ls t e mc e l lm a r k e ro np o s t n a t a lr a t c o r t e x - d e r i v e da s t r o c y t e sa n dm i e r o g l i a s t op r o v i d eb i o l o g i c a le v i d e n c ef o rf u r t h e r i n v e s t i g a t i n gt h ea p p l i c a t i o no fs i g n i f i c a n eo f t h e s eg l i a lc e l l s m e t h o d s ( 1 ) p u r i f i e dg l i a lc e l l sw e r ei s o l a t e df r o mn e w b o r nr a tc o r t e xa c c o r d i n g t ot h e i rd i f f e r e n c ei na d h e s i v ep o t e n t i a l i m m u n o c y t o c h e m i s t r yl a b e l i n gf o rc e l l - s p e c i f i c a n t i g e n sh a db e e nd o n et oc h a r a c t e r i z eg l i a lc e l l s ( 2 ) o - 2 ap r o g e n i t o rc e l l s ，f r e s h l y i s o l a t e da n d p l a t e d i n1 2 w e l l p l a t e s a n d o r p l l - - p r e c o a t e dc o v e r s l i p s ，w e r e s u b s t a n t i a l l yp u r i f i e di nd m e m + f 一1 2m e d i as u p p l e m e n t e dw i t h2 b 2 7 ，1 n 2a n d l o n g m lp d g f t h e nt h e s ep r o g e n i t o rc e l l s w e r ei n d u c e dt od i f f e r e n t i a t ei n t o t 2 a ( t y p e - 2a s t r o c y t e s ) i nm e d i u mc o n s i s t i n go f2 0 f c s p h e n o t y p e so fg l i a lc e l l s w e r ei d e n t i f i e db yi m m u n o f l o r e s c e n c el a b e l i n g ( 3 ) b yi m m u n o f l o r e s c e n c el a b e l i n g ，t h e e x p r e s s i o no fn e s t i n ，s t a g es p e c i f i ce m b r y o n i ca n t i g e n ( s s e a 一1 ) a n dn g 2p r o t e o g l y c a n w h i c hs e r v e da ss t e mc e l lm a r k e r sw e r ee x a m i n e di na s t r o c y t e sa n dm i e r o g l i a s r e s u l t s ( 1 ) w es h o wh e r et h a te f f e c t i v ei s o l a t i o no fo - 2 ap r o g e n i t o r sa n d t1a ( t y p e 一1a s t r o c y t e s ) f r o mr a tc e r e b r a lc o r t e xw a sa c h i e v e db ym e c h a n i c a ls h a k i n g a n dd i f f e r e n t i a lp l a t i n g o p cs h o w e dt y p i c a lb i p o l a rm o r p h o l o g ya n db i p o t e n t i a l i t yo f o l i g o d e n d r o c y t ea n dt 2 ad i f f e r e n t i a t i o n f u r t h e r , e a c ht y p eo fg l i a lc e l l ss h o wt h e i r s p e c i f i cm a r k e r sa m o n gw h i c ha 2 8 5w e r ee x p r e s s e di no - 2 ap r o g e n i t o rc e l l sw h i l e g f a pw e r ee x p r e s s e di nt 1 a ( 2 ) w ea l s os h o wh e r et h a te f f e c t i v ei s o l a t i o no fm i c r o g l i af r o mn e o n a t a lr a t c e r e b r a lc o r t e xw a sa c h i e v e db ym e c h a n i c a ls h a k i n ga n dd i f f e r e n t i a lp l a t i n g t h e y s h o w e dt y p i c a lm o r p h o l o g ya n dw e r eo x 4 2 + ( 3 ) o - 2 ap r o g e n i t o rc e l l sw h i c hw e r ef l e s h l yi s o l a t e do rc u l t u r e di np d g ff o r7 d a y ss h o wa p p a r e n tp r o l i f e r a t i o ni n s t e a do fd i f f e r e n t i a t i o n ，t h u so - 2 ap r o g e n i t o rc e l l s m 神经胶质细胞的干细胞抗原表型研究 w i n gp d g f t r e a t m e n t s e r u m - f l e em e d i u mc a l lq u i c k l yd i f f e r e n t i a t ei n t o d i f f e r e n t i a t ei n t oa 2 8 5 + g f a p + t 2 ai nm e d i u m c o n s i s t i n go f 2 0 f c s ( 5 ) l m m u n o - f l o r e s c e n c el a b e l i n gr e v e a l e dt h a tm a t u r et 2 as h o w e di m m u n o - r e a c t i v i t yf o rn e s t i n ，s s e a 一1a n dn g 2 a sw e l la sm i c r o g l i aw h i l en os p e c i f i cs t e m m a r k e r sp o s i t i v ei nt i a c o n c l u s i o n so u rs t u d yr e v e a l st h a ts p e c i f i cm a r k e r so fn e u r a ls t e mc e l l ss u c ha s n e s t i n ，s s e a 一1a n dn g 2a r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h ep u r i f i e dg l i a lc e l l s b o t h t 2 aa n dm i c r o g l i aa r ep o s i t i v ef o rn e s t i n ，s s e a 一1a n dn g 2 ，i m p l i c a t i n gt h a tt h e ym a y s h a r es o m ec h a r a c t e r i s t i c so fs t e mc e l la n t i g e n s o u rf i n d i n g ss u g g e s tt h a tt 2 aa n d m i c r o g l i am a ys h a r es o m ei d e n t i t i e so ft h en e u r a ls t e mc e l l sw h i c hi n d i c a t e st h a tt h e s e c e l l sc o u l db eu s e da so n ep o t e n t i a lc e l l u l a rs o u r c ef o rc l i n i c a li n v e s t i g a t i o n so fc e n t r a l n e r v o u s s y s t e md i s e a s e s k e yw o r d sg l i a lc e l l ；a s t r o c y t e ；m i c r o g l i a ；n e s t i n ；s s e a - 1 ；n g 2 ；r a t i v w r i t t e nb yy es h u g a o s u p e r v i s e db yp r o f x i ac h u n f i n 刖昌 第一部分：星形胶质细胞的干细胞抗原表达“ 讨论 参考文献 第二部分：小胶质细胞的干细胞抗原表达 结论 材料和方法 结果 讨论 1 2 1 4 1 7 1 7 2 0 2 2 2 3 2 6 2 7 3 8 - 3 9 参考文献 综述：干细胞标记物的研究进展 缩略词表 发表和待发表论文 神经胶质细胞的干细胞抗原表 刖声 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化为 多种功能细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序，干细胞可分为胚胎干细胞 ( e m b r y o m cs t e mc e l l ，e s c s ) 和成体干细胞( a d u l ts t e mc e i l s ，a s c s ) 。已确认存在的成 体干细胞主要有间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 、造血干细胞 ( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c s ) 及神经干细胞( n e u r a ls t e mc e l l s ，n s c s ) 等。n s c s 是 继造血干细胞之后研究比较全面的另一重要系统干细胞，具有低免疫原性，能在 体外大量增殖，移植后可在宿主体内长期存活并分化整合进中枢神经系统结构中， 从而在解剖学和功能上修复神经系统。目前，干细胞移植治疗中枢神经系统疾病是 神经科学领域研究的最大热点之一，目的是替代、修复受损神经组织以恢复其生理 功能，为多种中枢神经系统疾病的临床治疗开创有利条件。然而，无论是胚胎干细 胞还是成体干细胞，他们的数量是相当有限的，无法满足中枢神经系统疾病治疗 的基础研究和临床应用研究，这就需要深入研究探寻获得干细胞的新途径。 神经胶质细胞( 亦称胶质细胞，百i a lc e i l s ) 是神经系统内除神经元外的另一大类 细胞，占中枢神经系统细胞总数的9 0 以上。中枢神经系统的胶质细胞主要是大胶 质细胞( 星形胶质细胞、少突胶质细胞) 和小胶质细胞。以往认为，中枢神经系统信 息的整合与传递由神经元网络完成，胶质细胞只是被动的辅助成分。但随着研究 的深入，发现胶质细胞还具有可兴奋性、积极参与神经元的信息传递、调节突触 形成和突触可塑性等作用【l 一，因此大脑活动是胶质细胞和神经元合作的结果。中 枢神经系统疾病，尤其是神经系统退行性疾病及中枢神经系统损伤，发生显著反 应或被激活的胶质细胞主要是星形胶质细胞和小胶质细胞。2 0 世纪早期的研究就 已提出，发育期的放射状胶质细胞可能是胶质细胞的祖细胞或神经元祖细胞，随 着实验技术的改进和新技术的应用，越来越多的证据表明：至少有部分数量和类 型的胶质细胞在体内外显示出n s c s 的特征，在适当条件下能分化成神经组织的不 同细胞【3 - 6 1 。 传统观点认为神经元和胶质细胞来源于各自的祖细胞，一旦发育成熟，就不 再有新的神经元产生。然而越来越多的研究发现颠覆了这一观点，人们逐渐意识 到可能有多种多潜能神经干细胞参与了成体神经发生。众所周知，侧脑室的室管 前言神经胶质细胞的干细胞抗原表型研究 下区( s u b v e n t r i c u l a rz o n e ，s v z ) 和海马齿状回的颗粒下区( s u b g r a n u l a rz o n e ，s g z ) 是大多数成年哺乳类动物中枢神经系统的发生区，中枢神经干细胞主要集中分布 在以上两个区域【刀，在成年脑的皮层和皮质下区也发现有多潜能的神经细胞。令人 惊奇的是，对以上区域新生神经元的原代祖细胞( 干细胞) 鉴定发现，这些细胞 具有星形胶质细胞的生物学标记特点，提示星形胶质谱系成员可能具有神经元祖 细胞特性【8 】。 r a f t 等根据星形胶质细胞的发生和抗原表达的不同，将其分为1 型星形胶质 细胞( t y p e1a s t r o c y t e ，t 1 a ) 和2 型星形胶质细胞( t y p e2a s t r o c y t e ，t 2 a ) 两型【9 】，从而 形成了星形胶质细胞发生分化的“双谱系学说( t l a 谱系和o - 2 a 谱系) 。两型星形 胶质细胞分别由两种不同抗原表达的祖细胞发育分化而来：t 1 a 起源于抗原表型 为r a n - 2 + 、a 2 8 5 一的t i a 前体细胞；t 2 a 和少突胶质细胞( o l i g o d e n d r o c y t e ，o l ) 起源于抗原表型为r a n - 2 一、a 2 8 5 + 的双潜能细胞o _ 2 a 祖细胞 ( o l i g o d e n d r o c y t e - t y p e2a s t r o c y t ep r o g e n i t o rc e h s ) 。研究表明，来源于不同谱系的 t i a 和t 2 a 在发生时间、细胞形态及功能等方面均有不同之处【1 0 - 1 2 。现已证实， o - 2 a 祖细胞是中枢神经系统中广泛分布的胶质谱系前体细胞，其数量占胶质细胞 总数的5 - 8 。o - 2 a 祖细胞起源于前脑的室带( v e n t r i c u l a rz o n e ，v z ) 、室下带 ( s u b v e n t r i c u l a rz o n e ，s v z ) 和脊髓的腹侧部，并随着神经系统的发育，逐渐迁移 到中枢神经系统的不同部位【1 3 1 。在出生后的中枢神经系统内，o - 2 a 祖细胞可能是 数量最多的、具有增殖能力的细胞。 2 0 世纪初，人们对小胶质细胞进行了较为详细的观察，由此开始了对这一重 要中枢神经系统的免疫细胞开始了深入研究，一系列研究结果表明小胶质细胞作 为中枢神经系统的一种组织巨噬细胞，在成熟大脑稳定状态、组织发生过程、损 伤、疾病、修复等病理状态具有不同的形态和功能，并具有不同的免疫活性【1 4 1 。 就小胶质细胞的来源问题，有较大的争议，一部分学者认为小胶质细胞来源于外 周血液系统，为血液中单核细胞游走入脑组织的结果，然而更多的证据支持小胶 质细胞是脑组织本身的构成部分，即在脑发育过程中，中胚层的一些多能干细胞 在胚胎晚期或出生前后迁移至脑内，转化成为脑组织中“土著”的小胶质细胞的细胞 类型。清除细胞凋亡的残骸是小胶质细胞的重要功能之一，在脑发育的过程中及 在脑成熟阶段经常伴随着大量细胞的新生和凋亡，小胶质细胞通过吞噬作用保持 2 着脑细胞数量的相对平衡，使凋亡的细胞及时清除【1 5 6 1 。对环境刺激非常敏感是 小胶质细胞最显著的特点之一，在许多微环境因子发生变化时，小胶质细胞可迅 速做出反应，形态上表现为从带有分支的静息状态转化为体积较大、胞体变圆并 具有变形和吞噬作用的激活状态【1 7 1 。 骨髓细胞不仅可以产生小胶质细胞， 造血干细胞是小胶质细胞的前体细胞f 2 l 】， 还可以产生神经外胚层细胞【1 8 - 2 0 。虽然 但是，f i t 3 + 的骨髓祖细胞似乎是小胶质 细胞更直接的前体细胞【2 2 1 。在损伤的大脑中，小胶质细胞表达造血干细胞的标志 物c d 3 4 1 2 3 1 。因此，如果小胶质细胞来源于造血干细胞，并且骨髓细胞可以产生大 胶质细胞和神经元，那么小胶质细胞也能和其前体细胞一样可以产生神经元和大 胶质细胞，虽然对c d 3 4 + 的干细胞是否可以产生神经外胚层的细胞尚存争论【硼。 为了支持这些观点，很多种抗原被用于检测小胶质细胞和神经外胚层的细胞。 比如：不少外源性的凝集素不仅可以识别小胶质细胞瞵1 ，还可以识别少突胶质细 胞前体细胞。神经节苷脂g d 3 是少突胶质细胞谱系的细胞，而抗g d 3 抗体也可以 标记小胶质细剧冽。c d 4 5 作为一种白细胞分化抗原，在少突胶质细胞和小胶质 细胞中均有表达【2 7 1 。3 c b 2 抗原是被公认为神经外胚层的细胞放射状胶质细胞的标 记物，在损伤的脊髓中它在c d 6 8 + 的小胶质细胞中也表达【2 8 1 。小胶质细胞和神经 外胚层的细胞中存在诸多的共同抗原，说明小胶质细胞不只是有免疫调节和吞噬 作用。 本研究主要研究新生大鼠皮质来源的星形胶质细胞及小胶质细胞的干细胞抗 原表型，以进一步探讨他们是否具有神经干细胞的生物学特性，为深入研究探寻 获得干细胞的新途径提供实验依据。 参考文献 1 m i c h a ls l e z a k ，p f r i e g e rf n e wr o l e sf o ra s t r o c y t e s ：r e g u l a t i o no fc n s s y n a p t o g e n e s i s t r e n d sn e u r o s c i ，2 0 0 3 ，2 6 ：5 31 - 5 3 5 2 f i e l d sr d ，s t e v e n s - g r a h a mb n e wi n s i g h t si n t on e u r o n - g l i ac o r m m u n i c a t i o n s c i e n c e ，2 0 0 2 ，2 9 8 ：5 5 6 - 5 6 2 3 g o l d m a ns g l i aa sn e u r a lp r o g e n i t o rc e l l s t r e n d sn e u r o s c i ，2 0 0 3 ，2 6 ：5 9 0 _ 5 9 6 4 w a n gd d ，b o r d e ya t h ea s t r o c y t eo d y s s e y p r o gn e u r o b i o l ，2 0 0 8 ，8 6 ：3 4 2 - 3 6 7 3 c e l it i s s u er e s ，2 0 0 8 ，3 3 1 ：1 7 9 - 1 9 1 9 r a f tm c ，m i l l e rr h ，n o b l em ag l i a lp r o g e n i to rc e l lt h a td e v e l o p si nv i t r oi n t oa l l a s t r o c y t eo ra no l i g o d e n d r o c y t ed e p e n d i n go nt h ec u l t u r em e d i u m jn a t u r e ，1 9 8 3 ， 3 0 3 ( 5 9 16 ) ：3 9 0 3 9 6 1 0 n a g yj i , r a s hj e c o n n e x i n sa n dg a pj u n c t i o n so fa s t r o c y t e sa n do l i g o d e n d r o c y t e s i nc n s b r a i nr e sr e v ，2 0 0 0 ，3 2 ：2 9 4 4 1 1 s o n gh j ，s t e v e n sc f g a g ef h a s t r o g l i ai n d u c en e u r o g e n e s i sf r o ma d u l tn e u r a l s t e mc e l l s n a t u r e ，2 0 0 2 ，41 7 ：3 州 1 2 d o n gy ，b e n v e n i s t ee n ，i m m u n ef u n c t i o no f a s t r o c y t e s g l i a ，2 0 0 1 ，3 6 ：1 8 9 - 1 9 0 13 o n ok ，y a s u iyr u t i s h a u s e ru ，e ta 1 f o c a lv e n t r i c u l a ro r i g i na n dm i g r a t i o no f o l i g o d e n d r o c y t ep r e c u r s o r si n t oc h i c ko p t i cn e r v e n e u r o n ，1 9 9 7 ，1 9 ：2 8 3 - 2 9 2 1 4 n i c h o l a s r s ，w i n gm g ，c o m p s t o na n o n a c t i v a t e dm i c r o g l i ap r o m o t e o l i g o d e n d r o c y t ep r e c u r s o rs u r v i v a la n dm a t u r a t i o nt h r o u g ht h et r a n s c r i p t i o nf a c t o r n f - k a p p ab e u rjn e u r o s c i ，2 0 0 1 ，1 3 ：9 5 9 _ - 9 6 7 1 5 s t o l z i n ga ，w e n g n e ra ，g r u n et d e g r a d a t i o no fo x i d i z e de x t r ac e l l u l a rp r o t e i n s b ym i c r o g l i a a r c hb i o c h e mb i o p h y s ，2 0 0 2 ，4 0 0 ：1 7 1 - 1 7 9 1 6 1 0 s r e b r oz ，d z i o b e kk n e u r o p r o t e c t i o n ：t h er o l eo f n e u r o g l i a f o l i am e dc r a c o v ， 2 0 0 1 ，4 2 ：11 3 1 2 1 1 7 c a c c ie ，a j m o n e - c a tm a ，a n e l l it ，e ta 1 i nv i t r on e u r o n a la n dg l i a ld i f f e r e n t i a t i o n f r o me m b r y o n i co ra d u l tn e u r a lp r e c u r s o rc e l l sa le d i f f e r e n t l ya f f e c t e db yc h r o n i co r a c u t ea c t i v a t i o no fm i c r o g l i a g l i a ，2 0 0 8 ，5 6 ：4l2 _ 4 2 5 18 b r a z e l t o nt r ，r o s s if m ，k e s h e tg i ，e ta 1 f r o mm a r r o wt ob r a i n ：e x p r e s s i o no f n e u r o n a lp h e n o t y p e si na d u l tm i c e s c i e n c e ，2 0 0 0 ，2 9 0 ：1 7 7 5 - 1 7 7 9 1 9 m e z e ye ，c h a n d r o s sk j ，h a r t ag ，e ta 1 t u r n i n gb l o o di n t ob r a i n ：c e l l sb e a r i n g n e u r o n a la n t i g e n s g e n e r a t e d i nv i v of r o mb o n em a r r o w s c i e n c e ，2 0 0 0 ，2 9 0 ： 1 7 7 9 - 1 7 8 2 4 神经 2 0 2 1 v i t r ys ，b e r t r a n dj y ，c u m a n oa ，e ta 1 p r i m o r d i a lh e m a t o p o i e t i cs t e mc e h s g e n e r a t em i c r o g l i a b u tn o t m y e l i n - f o r m i n g c e l l si nan e u r a le n v i r o n m e n t j n e u r o s c i ，2 0 0 3 ，2 3 ：1 0 7 2 4 - 1 0 7 3 1 2 2 s e r v e t - d e l p r a tc ，a m a u ds ，j u r d i cp ，e ta 1 f i t 31m a c r o p h a g ep r e c u r s o r sc o m m i t s e q u e n t i a l l yt oo s t e o c l a s t s ，d e n d r i t i cc e l l sa n dm i c r o g l i a b m ci m m u n o l ，2 0 0 2 ，3 ： 1 5 _ 2 3 2 3 l a d e b yr ，w i r e n f e l d tm ，d a l m a ui e ta 1 p r o l i f e r a t i n gr e s i d e n tm i c r o g l i ae x p r e s s t h es t e mc e l la n t i g e nc d 3 4i nr e s p o n s et oa c u t en e u r a li n j u r y g l i a ，2 0 0 5 ，5 0 ： 1 2 1 - 1 3 1 2 4 s i g u r j o n s s o no e ，p e r r e a u l tm c ，e g e l a n dt ，e ta 1 a d u l th u m a nh e m a t o p o i e t i cs t e m c e l l sp r o d u c en e u r o n se f f i c i e n t l yi nt h er e g e n e r a t i n gc h i c k e ne m b r y os p i n a lc o r d p r o cn a t la c a ds c iu s a ，2 0 0 5 ，1 0 2 ：5 2 2 7 _ 5 2 3 2 2 5 n i e h a u sa ，t r o t t e rj l e c t i n - b i n d i n gp r o p e r t i e so fo l i g o d e n d r o c y t el i n e a g ec e l l sa i d i nd e f i n i n gf u n c t i o n a l l yi m p o r t a n ts u r f a c ep r o t e i n s g l i a ，1 9 9 7 ，2 0 ：1 7 3 - 1 8 3 2 6 a m a tj a ，i s h i g u r oh ，n a k a m u r ak ，e ta 1 p h e n o t y p i cd i v e r s i t ya n dk i n e t i c so f p r o l i f e r a t i n gm i c r o g l i aa n da s t r o c y t e sf o l l o w i n gc o r t i c a ls t a bw o u n d s g l i a ，1 9 9 6 ， 1 6 ：3 6 8 3 8 2 2 7 n a k a h a r aj ，s e i w ac ，t a n - t a k e u c h ik ，e ta 1 i n v o l v e m e n to fc d 4 5i nc e n t r a l n e r v o u ss y s t e mm y e l i n a t i o n n e u r o s c il e t t ，2 0 0 5 ，3 7 9 ：11 6 - 1 2 1 2 8 w ud ，m i y a m o t oo ，s h i b u y as ，e ta 1 c o - e x p r e s s i o no fr a d i a lg l i a lm a r k e ri n m a c r o p h a g e s m i c r o g l i ai nr a ts p i n a lc o r dc o n t u s i o ni n j u r ym o d e l b r a i nr e s ，2 0 0 5 ， 1 0 5 1 ：1 8 3 - 1 8 8 5 在上述胶质细胞中的表达情况，以观察其在抗原表达上是否具有神经干细胞的特 征。 材料和方法 一、实验动物 新生( p 0 - p 3 ) s d 大鼠，由苏州大学实验动物中心提供。 二、主要试剂 1 细胞培养试剂 d m e m 、f 一1 2 培养基、胎牛血清、b 2 7 和n 2 添加剂购自g i b c o 公司。多聚赖 氨酸( p o l y - l 4 y s i n e ，p l l ，s i g m a 公司) ，血小板源性生长因子( p l a t e l e td e r i v e d g r o w t hf a c t o r ，p d g f ，p e p r o t e c h 公司) 。 2 抗体及荧光试剂 小鼠抗a 2 8 5 单抗( 1 ：2 0 0 ，r & d 公司) ，小鼠抗n e s t i n 单抗( 1 ：l o o ) 、兔抗n g 2 多抗( 1 ：2 0 0 ) 2 乏兔抗髓鞘碱性蛋1 兰t ( m y e l i nb a s i cp r o t e i n ，m b p ) 多抗( 1 ：2 0 0 ) 购于 c h e m i c o n 公司，小鼠抗s s e a 一1 单抗( 1 ：1 5 0 ) 购于a b c a m 公司，小鼠抗胶质原纤 维酸性蛋( g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) 单抗( 1 ：4 0 0 ) 、h o e c h s t3 3 3 4 2 、f i t c 6 神经胶质细胞的干细胞抗原表型研究 第一部分 标记的羊抗小鼠i g m ( 1 ：1 0 0 ) 、t r i t c 标记的羊抗小鼠i g g ( 1 ：1 0 0 ) 、f i t c 标记 的羊抗兔i g g 抗体( 1 - 1 0 0 ) 、t r i t c 标记的羊抗兔i g g 抗体( 1 ：1 0 0 ) ，购自s i g m a 公司。 三、主要仪器 c 0 2 培养箱( h e r a c u s 公司) ，恒温气浴振荡器( 华利达公司) ，倒置相差显微 镜( l e i c a 公司) ，激光共聚焦显微镜( t c s p 2 ，l e i c a 公司) 。 四、胶质细胞的分离纯化 1 混合胶质细胞原代培养 主要参照张晔等1 6 的培养方法并加以改进。 ( 1 ) 取材新生( p 0 - p 3 ) s d 大鼠，心脏放血，取出脑组织，切除脑干和小脑， 在解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管等结缔组织。 ( 2 ) 机械分散将大脑皮质剪成l m m 3 的组织块，以吸管吹打成单细胞悬液， 1 0 0 0r p m 离心5m i n ，用完全培养液( d m e m f 一1 2 、2 0 f c s 、2m m o l l 谷氨酰 胺) 重悬细胞，7 4j a m 筛网过滤，进行细胞计数。 ( 3 ) 细胞计数细胞悬液io 4 台盼蓝- - 1 ：9 均匀混合，用血球计数板显微镜 下计数活细胞。 ( 4 ) 接种与培养以3 1 0 5 c m 2 的密度接种于培养g ( c o m i n g 公司) 中，c 0 2 培养 箱中孵育3 0m i n ，以去除成纤维细胞。吸出细胞悬液，再接种于包被p l l ( o 1 m g m 1 ) 的培养瓶中。最初3 天静置细胞，以后每3 天换液一次。培养7 - 1 0 天时可见细胞分两层：下层为t 1 a ，上层有o - 2 a 祖细胞、小胶质细胞及t 1 a 集 落。 2 胶质细胞的分离和培养 ( 1 ) 利用胶质细胞具有不同贴壁能力的特点，可分离和纯化o - 2 a 祖细胞和 t 1 a 。将培养7 - 1 0 d 的混合胶质细胞置于3 7 c 气浴恒温振荡器中，1 8 0r p m 预振荡 2 h ，去除上层的小胶质细胞，而底层的t 1 a 和上层的o - 2 a 祖细胞不脱落。弃去 上清液，d - h a n k s 液洗3 次，加入完全培养液，再过夜震荡1 8 h ，以分离上层的 7 神经胶质细胞的干细胞抗原表型研究 ：将振荡1 8 h 后的脱落细胞1 0 0 0 r p m 离心5m i n ，用完全 培养液重悬后接种于未包被p l l 的培养瓶中，差速贴壁3 0m i n ，去除混杂的小胶 质细胞。收集未贴壁的o - 2 a 祖细胞接种于包被p l l 的盖玻片上，培液为 d m e m f - 1 2 、2 b 2 7 、l n 2 、1 0 n g m lp d g f 。 ( 3 ) t 2 a 培养：纯化的o - 2 a 祖细胞在含2 0 f c s 的培液中生长5 d ，分化为 t 2 a ，进行纯化。 ( 4 ) o l 培养：纯化的o - 2 a 祖细胞在d m e m + 1 n 2 的无血清培养液中生长 5 d ，向o l 分化。 ( 5 ) t 1 a 的纯化培养：取上述震荡分离后的底层细胞，0 1 2 5 胰酶消化，以 2 x 1 0 4 c m 2 密度接种培养瓶中，在d m e m + 1 0 f c s 中培养。待细胞汇合时再次传 代。传代3 次后，进行实验。 五、培养细胞的观察与记录 倒置相差显微镜下观察各阶段的细胞形态并拍照。 六、胶质细胞的鉴定 应用免疫荧光双重标记方法，检测胶质细胞的特异性抗原标记。以鼠抗a 2 8 5 单抗分别与鼠抗g f a p 单抗及兔抗m b p 多抗检测o - 2 a 祖细胞、t 1 a 、t 2 a 和o l 。 1 将o - 2 a 祖细胞、t 1 a 和t 2 a 分别接种于预先涂有p l l 的盖玻片上，待细 胞生长贴附后，将盖玻片取出，0 0 1 m o l lp b s ( p h 7 4 ) 洗3 次，每次5 m i n ，4 多 聚甲醛固定3 0m i r a 2 p b s 洗3 次，1 0 正常山羊血清封闭3 0m i n ，消除非特异染色。 3 弃去血清，加入一抗，4 。c 孵育过夜。 4 p b s 洗3 次，加入相应的f i t c 或t r i t c 标记二抗，室温下避光反应6 0m i n 。 5 p b s 洗3 次，加第二种一抗，4 孵育过夜。 6 p b