（食品科学专业论文）枯草芽孢杆菌细胞结构致死性动力损伤形式的试验研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 动力杀菌是一种新兴的食品常温杀菌技术，本课题以枯草芽孢杆菌为研究对象，研究了低动力 强度下细胞微观结构的致死性损伤形式。 利用高压纳米破碎机对枯草芽孢杆菌细胞进行了一系列较低动力强度的杀菌试验，结果表明： 枯草芽孢杆菌细胞微观结构损伤致死现象在低强度动力作用下普遍存在，较高的微观损伤致死率可 以在相对较低的动力条件下实现，压力不是导致细胞死亡的直接动力原因。 利用扫描和透射电镜对动力损伤后的枯草芽孢杆菌细胞结构进行了观察研究，分析了致死性微 观损伤形式。致死性微观损伤形式主要有：胞内物质完全散失、细胞壁变薄或局部明显破损、胞内 气室、细胞变形和细胞质壁分离。 分析了造成致死性微观损伤形式的动力原因，主要包括：剪切、摩擦、膨爆、拉伸和空穴振荡。 剪切形成的转矩使细胞折断；摩擦导致细胞壁变薄、破损；膨爆导致细胞破裂、胞内物质溢出，不 完全膨爆还可引起细胞变形；拉伸导致细胞变形、断裂；空穴振荡导致细胞破裂。 关键词：动力杀菌细胞结构损伤生命活性常温杀菌 ：里兰、业尘：翟圭兰竺鲨吝翌茎 a b s t r a c t d y n a m i cp a s t e u r i z a t i o ni s an e wn o n - t h e r m a lp r o c e s sf o rf o o dp r e s e r v a t i o n t h i sa r t i c l es t u d i e dt h e d e a d l yd y n a m i cd a m a g e s o nc e l l sm i c r o s t r u c t u r eo nl o w e rd y n a m i ca c t i o n s p a s t e u r i z a t i o nt e s t so fb a c i l l u ss u b t i l i sb yh i 曲p r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o nw e r es t u d i e do nl o w e r d y n a m i c sa c t i o n s t h er e s u l t s s h o w ：d e a t ho fb a c i l l u ss u b t i l i s c a u s e db yd a m a g e so ni t sm i c r o s t r u c t u r e o c c u r si nl o w e rd y n a m i ca c t i o n sc o m m o n l y h i 曲d e a t hr a t ec a u s e db ym i c r o s t r u c t u r ed a m a g e sc a nb e a c h i e v e do nl o w e rd y n a m i ca c t i o n s p r e s s u r ei sn o tt h ed i r e c td y n a m i ca c t i o nt h a tr e s u l ti nc e l ld e a t h c e l lm i c r o s t r u c t u r ew a ss t u d i e db ye l e c t r o n i cm i c r o s c o p eo b s e r v a t i o nu l t e rb a c i h u ss u b t i l i sw a s d a m a g e db yd y n a m i ca c t i o n s d e a d l yd a m a g e so i lm i c r o s t r u c t u r e & r ea n a l y z e d t h ed a m a g e si n c l u d e ： p r o t o p l a s ti - u no f f , c e l lw a l lt h i r m e do rp a r t l yb r o k e n ，g a sr o o mi nc e l l ，c e l lt r a n s f o r m e da n ds e p a r a t i o n b e t w e e nc y t o p l a s ma n dc e l lw a l l d y n a m i ca c t i o n st h a tr e s u l t e di nd e a d l yd a m a g e so nc e l l sm i c r o s t r u c t u r ew c r ea n a l y z e d t h ea c t i o n s m a i n l yi n c l u d ec u t ，f r i c t i o n , c e l le x p l o d e s ，s t r e t c ha n ds h a k e c u tr e s u l ti nc e l lb e n t f r i c t i o nr e s u l ti nc e l l w a l lt h i n n e da n dw o r no u t s t r e t c hr e s u ri nc e l lt r a n s f o r m e da n db r o k e n e x p l o d er e s u l ti nc e l lb u r s t e da n d p r o t o p l a s t l a i no f f k e yw o r d s ：d y n a m i cp a s t e u r i z a t i o n ，c e l ls t r u c t u r e ，d a m a g e ，l i f ea c t i v i t y , n o n t h e r m a lp a s t e u r i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：t 彳 j 趴 凌 时间：气汤户年多角7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：_ 丁一 j 导师签名：弓k 弼疑 互破 时间：伽乒年 6r 7 h 时间：声旧严年f 月7 日 ! 星堡些尘茎至鳘釜墼耋，。， ，! 鎏 第一章序论 1 1 食品及液体食品杀菌技术的发展 为了保证食品的安全性及贮藏性，需要对食品进行杀菌处理。热杀菌一直是食品加工最重要的方 法，几乎伴随着食品工业的整个发展过程。但是，加热处理在发挥致死细菌、钝化酶类等作用的同 时，也使一些热敏感的营养素和风味物质受到破坏，降低了食品的营养价值，并使产品天然色泽变 化，改变食品原有的风味。长期以来人们直探索新的工艺和方法，以减少食品在杀菌过程中的营 养损失。近些年来兴起的冷杀菌技术开始受到人们的广泛关注。 冷杀菌技术是近年来研究利用较多的种杀菌技术，由于杀菌过程中食品温度并不升高或升高 很低，既有利于保持食品中功能成分的生理活性，又有利于保持色、香、味及营养成分。所以在食品 加工，特别是功能食品加工中采用冷杀菌技术是非常必要的。冷杀菌技术主要包括超高压杀菌、高压 脉冲电场杀菌、磁力杀菌、感应电子杀菌、辐照杀菌、脉冲强光杀菌、微波杀菌、超声波灭菌、紫 外线杀菌、臭氧杀菌、抗生酶杀菌等，在食品加工中有广阔的应用前景。这些新兴的食品杀菌技术 与传统杀菌技术相比，减少了对食品营养素和风味物质的破坏，同时保证了食品的安全性。冷杀菌 技术是很有前途的食品加工储藏技术，有其优越性，同时也存在不足。目前在杀菌机理、适用条件 和主要影响因素、杀菌设各、杀菌能力等方面仍存在诸多问题，这些都影响了冷杀菌的实际应用。 国外于八十年代出现了高静( 水) 压杀菌的技术。所谓食品高静( 水) 压杀菌，是使用4 0 0 m p a 以上( 4 0 0 一1 0 0 0 m p a ) 的压力，在常温下或鞍低温度下对包装食品进行处理，从两达到灭菌和改变食 品某些理化特性的一种的杀菌方式。高静水压的作用，可导致食品中的酶、蛋白质和淀粉等生物高 分子物质失活、变性，同时，还可破坏微生物细胞内部结构，从而使细菌丧失繁殖能力。超高静( 水) 压杀菌技术实现了真正意义上的冷杀菌。然而，由于细菌个体的三维尺寸很小，即使在外界压力很 高时分解到细菌个体上的破坏力也变得很小；另外，虽然细菌结构绝对强度不高，但由于其在某 力向存在对称性，而静( 水) 压对细菌旅加的是一各向同性的外力，从而加大了破坏其生命结构的 难度，因此，仅靠静( 水) 压杀灭细菌所需压力很高( 4 0 0 1 0 0 0 m p a ) ，对装备结构要求高。另外， 高静( 水) 压杀菌一般只能对软包装食品进行批式处理，加工能力小，在实际应用中受到了诸多限 制。于是，一种新的动力冷杀菌方法一超高压均质杀菌( u l t r ah i g h - p r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o n p a s t e u r i z a t i o n 。u h h p ) 越来越受到研究人员的重视。 超高压均质杀菌处理是液体食品在超高压均质机内受到挤压、剪切、压力释放等强烈的动力作 用，使料液中细菌的细胞结构发生破坏和改变，从而失去或钝化其生物活性，达到杀菌目的。相对 于高静( 水) 压处理来说。这里的“超高压”还属于低压，相对于常规的均质来说，是超高压。这种 技术对于加工生、鲜果汁饮料等产品是很理想的杀菌方法。超高压均质杀菌技术是一种连续常温超 高压动力杀菌，作为低温物理作用杀菌。它能够避免常规杀菌处理造成的对食品品质的劣化，从营 养、风味、色泽等方面最大限度地保全食品的自然特性，更有效地利用食品原料中的有效成分，所 以超高压均质杀菌比热杀菌具有显著的优点，尤其是在崇尚天然低加工食品和食品营养性的今天， 中国农业大学硕士学位论文序论 这种技术的研究和发展更具有现实意义。除杀灭杂菌外，超高压及动力的联合作用还可对食品中构 成风味或口味物质的分子的排列结构产生影响，改变其原有的传统特性，赋了；食品以新的食用特点， 与无菌包装方法配合，将生产出新型食品。在实际应用中，u h h p 处理不仅仅是增加了动力杀菌的作 用，最重要的是使食品加工生产的连续性成为可能。超高压均质杀菌的研究将使传统食品加工发生 革命性的变化，带动- 丁业化食品加工技术上升到一个新的层次。 1 2 动力杀菌的研究现状 1 2 1 动力杀蔼机理的研究 超高压均质杀菌是项近= 十年发展起来的高新技术，它是通过使细胞破碎来破坏微生物细胞 的结构，从而达到杀菌的日的。从7 0 年代初开始，就有入尝试着用工厂里的均质机用于细菌细胞的 破碎。人们进行了大量研究，提出许多物理过程来解释高压均质机中细施破碎的机理，这些机理包括： 剪切、碰撞、压力梯度、空穴等。已经有过许多关于这方面的报道，如液体内部的和溷门平面之间 的剪切、碰撞撞击环、压力降的速率和太小、速率变化和湍流、空穴作用以及速率梯度。 压力释放 许多磷究者认为，细胞进入阀门间隙时瞬间的压力释放是其破碎的重要原因。b r o o k m a n ”通过 在均质机内安装一压力传感器，并将阀杆末端和一测微计相连详细研究了酵母破碎过程中的压力变 化、阀门移动、流体速率和蛋自质释放等情况。他认为，压力梯度而非压力是细胞破碎的原因。 d c e d w a r d s 等”也报道了由于迅速的压力变化而引起的细胞破碎现象。为了便于研究，通常将均质 机内的流体分为两部分：处是阀门区域，在该区域流体加速进入和通过位于阀和阀座之间的间隙， 另。处是碰撞区，在此区域悬浮液撞击到碰撞环上成为辐射状的喷射物。细胞破碎既发生在阀门区， 也发生在碰撞区。每个区域对于破碎的重要性取决于阀门的设计 3 1 和所要破碎的微生物m 。许多学者 对于阀门区的压力和阀门间隙之间的关系进行了研究。在阀门区，总共的压力损失取决于输入损失( 流 体加速进入闯隙) 、摩擦损失( 流体通过间隙) 、膨胀损失( 流体离开间隙) 。m o l l e ：5 j 研究了阀门区内平 流层和湍流层的压力分布情况。对于流体为气体的情况，n a k a y a r n a ( 。6 i 昶k a w a g u c 嫩帆分别给出了平流 层和湍流层中压力变化和间隙之间的关系式。对于流体为悬浮液的情况，p m p p s + + 9 j ”在研究了高压均 质阀的结构后，对k a w a g u c h i t t l 的公式进行修正推导出了一个经验公式，来描述阀门区压力变化和阀 门问隙关系。b r o o k m a n p 发现，对于细胞破碎均质机，阀门阃隙会由2 0 m p a 的2 0 um 增加到1i o m p a 下的1 8 0 姗。e n g l c u i 认为该结果违反了动量平衡- 是不可信的。近来的项研究表明，均质阀间隙 会由2 0 m p a 的2 0 m 下降到7 0 m p a 的8 耐“i 。 在闽门区最大的压力梯度发生在流体高速进八阀门间隙时的一个小区域内，小区域的长度与阀 门间隙成比例。在这个小区域内，压力迅速转化成动能，绝大部分的压力降都发生在这里，因而阀 门区的压力降近似等于流体加速后获得的动能。根据这一原理，a n d r e wr k l e n i n g 和a n t o n r j ，m i d d e l b e r g 1 3 1 给出了一个简单的表达式来计算均质机中的压力梯度。他们还分别研究了压力和压 力梯度与酵母破碎率之问的关系，发现，压力梯度比压力能够更好的描述诸如阀座的形状、阀门间 2 中国农业大学硕士学位论文 序论 隙等备种操作参数和设计参数对阀门区细胞破碎的影响。s h a m l o u ，s i d d i q i 和h o o k e r ”1 研究了酵母的 破碎机理，认为破碎率是压力梯度的函数，并且推导出来被破碎的最大细胞真径与通过阀门时的压 力降之间的关系。 为了计算均质过程中细胞的受力情况，需要更详细地了解均质阀内压力和速率之间的关系。由 于速率和压力在很小的空间内发生很大的变化，所以不可能详细地测量到高压均质阀内的压力和速 率情况。运用计算流体力学，实际的压力和速率作用可以通过计算获得。c h a t t e r j e e 和w h i t e t ”1 曾经 做过类似的流体模型的数学研究，但是没有运用到均质阀中。 高压均质机内的细胞破碎往往要经历多次循环才能完成。由于每次循环后阀门间隙内都会留有 细胞悬浮液，因此可以认为在多次循环破碎过程中细胞会经历一系列不同的压力梯度。并且每经过 一次操作，细胞壁的强度都会减弱。这些情况都有待进一步的研究。目前对于压力梯度的研究多集 中在阀门区，重要的细胞破碎还发生在碰撞区，对于该区域内压力变化情况也有待研究。另外，用 压力梯度来预测细胞的破碎率也是以后要做的工作。 剪切 在高压均质机内，有两处地方会发生剪切作用，一处是细胞悬浮液通过狭窄的阀门间隙时闽门 壁的剪切，另一处是辐射状流体撞击碰撞环时的碰撞剪切。 h e t h e i n g t o n 等人“给出了细胞破碎与高压阀座和碰撞环的参数之间的关系，他们认为剪切是细 胞破碎的主要机理。r l a n d e r ，w m a n g e r 等“”用多聚糖分子作为模型代替细胞，让多聚糖分子在不 同的剪切速率下通过毛细管，以确定单纯的剪切作用破碎的影响。结果证明，破碎率随着剪切速率 的增大而增大。r a m 和k a d i m “”也研究了毛细管剪切对聚合物破碎的影响，得到了类似的结果。同时， 用高压均质机对多聚糖分子进行破碎，获得了和毛细管剪切相类似的多聚糖分散性曲线，表明剪切 作用是高压均质破碎的主要机理之一。 r ，l a n d e r 等人“”的试验还表明，多聚糖分子的破碎效率随着压力的增大而增大。这说明，增犬 压力相应的减小了阀门间隙，从而增强了在阀门间隙处和碰撞环处的剪切能力。虽然b r o o k m a n 的试 验表明阀门间隙随着压力的增大而增大“1 ，从而在某种程度上否定了剪切对于破碎的作用，但是许多 研究人员并不支持b r o o k i a i l 的这一结果”。 当然，剪切可能受到细胞壁强度的影响，当细胞壁比较坚硬时，剪切的作用可能会减小。 碰撞 离开阀门间隙细胞悬浮液呈辐射状高速撞击碰撞环。早期，人们没有认识到高压均质机的碰撞 环对于细胞破碎的重要性“。4 ”1 。事实上，随着近十几年来人们对破碎机理的更多的研究表明，碰撞 也是导致细胞破碎的重要原因。e n g l e r 和r o b i n s o n ” 报道了让细胞悬浮液高速撞击碰撞环从而有效 地破碎c a n d i d au t i l i s 的情况。 细胞悬浮液撞击碰撞环时，其碰撞压p s 和最大壁剪切力tm 与阀门间隙的宽度h 和阀门口到碰 撞环的距离x 有关：p s 或tm o c l x ：h 2 。 为了评价碰撞对于细胞破碎的影响，k e s h a v a r z m o o r e 等“3 1 设计了不同的碰撞环孔径和碰撞距离 来试验细胞的破碎效率。结果表明，碰撞环孔径越小，破碎率越高，随着碰撞距离的增大，破碎率 中国农业大学硕十学位论文序论 迅速降低。 碰撞环对于细胞破碎的重要性可以通过对比带有碰撞环的平面阀门单元和除去碰撞环的刀形阎 门单元的破碎效果来证实。虽然刀形阀门有很高的破碎效率，但由于除去了碰撞环，而仅获得了不 到5 0 的破碎率( 一次操作) 。m o o r e 的试验表明，对于刀形阀门，不含碰撞环时得到的破碎率仅有 含有碰撞环时的2 0 【”j 。 阀门间隙和操作压力对于碰撞破碎效果的影响有待于将来的研究。 空穴效应 高压均质过程中是否产生了空穴效应，如果产生的话它是否对细胞破碎起了重要作用等这些l 琏l 题引起了众多研究人员的兴趣。 b o t h a 2 4 证实空穴会导致自由基的氧化作用，因而，许多学者把自由基的氧化作为高压均质过程 中空穴是否存在的证据。通常都是通过k i 释放的i 的形式来检测自由基氧化。因为在高压均质过 程中，k j 不会被剪切、碰撞和压力变化所分解，它只能由自由基氧化所分解。许多学者均通过这种 方式检测到了高压均质过程中的空穴效应口泌】。r l a n d e r , w m a n g e r 1 1 等证实空穴发生在碰撞区。在 这个区域内，离开阁门间隙的高速喷射流体加速进入碰撞区刨造了空穴所需要的真空条件。但是 b r o o k m a n 【l 】却没有检测到空穴发生，这可能是由于他采用的技术不够灵敏。k l e i n i g 等人鲫也没有检 测到空穴现象，这是由于他们研究的是阀门区的破碎，而空穴发生在碰撞区。 湍流作用 许多研究人员认为，均质阀中央的湍流作用引起的流体机械应力是微生物细胞壁破碎的主要原 因。在湍流场中，存在着大量的大小不，自由运动的漩涡。由于这些漩涡的作用，细胞将经历不 同形式和强度的运动 2 9 , 2 9 1 。当细胞尺寸小于最小漩涡的尺寸时，漩涡部分地带动细胞移动，在细胞 上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞发生破碎。当微粒直径大于最小漩涡的尺 寸时，漩涡完全携带着细胞运动，细胞表面不同部位的压力起伏引起细胞振动，从而发生破碎。细 胞尺寸与最小漩涡的尺寸比例可以用下式来表达 3 0 , 3 1 , 3 2 】： = ( v3 e ) 。 高压均质机内细胞破碎的机理有许多矛盾的报导。s a v e 等嘲认为空穴及空穴塌陷导致的冲击波 压力脉冲是细胞破碎的主要原因，而k e s h a v a r a jm o o r e 等认为碰撞和冲击是细胞破碎的主要原 因，d o u l a h 2 8 1 则认为湍流是细胞破碎的主要原因，瞬问的压力释放除了使液温上升以外并不起到破 醉的作用，r l a n d e r ，w m a n g e r 等人“”认为既然在通过阀门座和碰撞环时都发生了压力释放，则一个 综合的机理是比较可信的。正因为如此很可能是所有这些有关的机理如压力梯度、流体剪切、碰 撞和空穴效应等都在细胞破碎中起了一定的作用，在不同的破碎区域内，在不同的操作条件下引起 破碎的主要原因存在着差异。 1 2 2 超高压均质杀菌对于微生物影响的研究 r o s a i b al a r t c i o t t i 等人圳研究了在1 5 0 2 0 0 m p a 范围内连续高压均质处理对于病源和腐败微生 物存活的影响，发现改变均质压力可以使l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s 、y e r i s n i ae n t e r o c o l i t i c a 、b a c i l l u s 4 巾围农业人学硕十学位论文 序论 i i i s u b t i t i s 和酵母y a r r o w i al i p o m d 瞬间大量减少，并且使细胞产生不可逆的损伤。经高压杀菌后的橙 汁保存六个月后仍然无菌”。 高压均质对于微生物的影响随着细菌的种类结构、大小形状和生长状况的不同而不同。细菌结 构对于微生物的高压处理有重要的影响。细菌结构随着菌种、菌龄和营养状况的不同而变化很人， 这种差别以革兰氏阳性菌和革兰阴性菌之间最为明显。通常认为革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰阴性 菌的细胞壁更为坚固，这是因为厚的肽聚糖层占了革兰阳性菌细胞壁干重的9 0 而革兰阴性菌细胞 壁仪含有1 0 的肽聚糖，不过革兰阴性菌细胞壁外层另外覆盖有一层薄的脂多糖层，有助于它们的化 学和免疫学行为。所以，一般认为高压均质对于革兰氏阴性菌有更强的影响。细菌的形状和大小对 于高压均质处理也有较明显的影响。l t l t zp o p p e r 和d i e t r i c hk n o t t “1 选择ec o l i 作为革兰氏阴性菌 的代表，量 a c t i s 和最s u b t i l i s 作为革兰阳性菌的代表，用1 0 0 0 b a r 压力的处理后发现ec o i i 和 丑s u b t i i s 大约减少到原来数目的0 1 ，而置i a c t i s 仅减少到原来数目的1 0 。虽然工i a c t i s 和矗s u b t i l l s 都是革兰阳性菌，但小球形的墨l a c t i s 比长棒状的丑s u b t i l i s 对机械作用有更强的 抵抗力。破碎的难易还与细菌的生长状态有关，有试验表明，革兰氏阴性菌a l c a j i g e n e se u t r o p h u s 髓着生长速率的增加而越容易破碎 r q 。另外，培养状况如培养基的成分也会影响破碎率。 杜军，张绍英【3 8 l 等研究了高压均质作用对于微生物细胞形态结构韵破坏情况和生命活性的影响， 探讨了高压均质的杀菌效果和作用机理。 高压处理。”和其它机械作用“”并不能直接抑制休眠的芽孢，但是可以诱导它们萌发，而萌发后 的芽孢对抑制处理的抵抗力大大降低。 1 2 3 高压均质杀菌对于产品影响的研究 均质前的迅速升压和由高速流体引起的摩擦使产品温度在每1 0 0 b a r 压力下上升2 , - - 2 5 c 1 4 ”：那 么在个1 5 0 0 b m 的均质过程中，产品的温度会由2 0 上升的大约5 5 c 。l u t z p o p p e r 等 4 2 1 得到的试 验结果是每1 0 0 b a r 上升1 ，l i 8 c ，考虑到试验中的轻微热损失，该结果符合k r a m e r 和b o m b e r g 【4 3 】 的结果。从热力学方程计算出的结果要略高于试验结果，即在类似于水的介质中每l o o b a r 上升2 5 。因此高压均质过程中引起的温度上升有可能略微超过5 0 ，这对于某些菌来说可能会有比较明 显的热抑制作用，如e s c h e r i c b i ac o l i 。 在高于8 0 m p a 的均质压力下处理液态食品，除可减少细菌的数量外，还能导致蛋白质等大分子 物质的物性变化。1 9 9 9 年，g u e r z o n i 等人 4 4 1 探讨了羊奶干酪的制作过程中，l q - p h 处理原料对产品 微生物和理化指标的影响。试验表明，经过u h p h 处理后的干酪制成品具有较好的滑腻感和延展性， 并在滋味、质地、颜色、后味等方面都要优于未处理的干酪。 1 2 4 关于超高压均质与其它手段相结合进行杀菌的研究。 大规模机械破碎细胞需要消耗大量的能量，因而，改进破碎工艺以大量降低破碎所需要的能量 是很有意义的。用酶法、化学法或热预处理可以减弱细胞壁的结构，影响膜的保护功能，再行高压 均质处理就可以节省能量，减少处理时间。 5 中国农业大学硕士学位论文序论 均质前加入溶解酶可以减弱细胞壁的硬度，从而使细菌更易受到随后的高压均质作用。目前用 的比较多的是溶菌酶，它可以有效作用于革兰阳性和阴性菌鲍细胞壁。一些脂肪溶解酶也能减弱保 护革兰阴性菌的外部脂多糖层“。 细菌的培养条件有可能影响它对酶的抵抗力，h o f f m a n n 等1 发现，高的培养温度可以降低对 6 ：。o j 对酶的抵抗力，但是p o p p e r “却得出了与之相反的试验结果。关于在酶项处理过程中溶菌酶 浓度的影响，p o p p e r 和k n o r r “的试验表明，增加酶浓度，原始菌数会降低，但是酶和高压均质协 同作用的影响没有被发现。 加酶预处理的主要作用不是要增加细胞破碎，而是要使细胞更易受到随后的机械破碎的影响。 1 2 5 有关高压均质杀菌商业化应用研究 近1 0 年来，少数国家已经在研究开发连续常温超高压动力杀菌技术，美国a t h e n s 大学f o o d s c i e n c e t e c h n o l o g y 研究所对该项研究领域的研究已取得阶段性成果。其连续高压处理装置采用液 压为动力，通过液力增压转换产生超高压，实现了对液态物料的常温超高压动力杀菌。目前已建成 3 t h 连续常温超高压动力杀菌装置，为超高压杀菌技术的商业化应用提供了技术支持。经过超高压处 理过的橙汁，货架寿命可以达到六个月 3 7 1 品尝实验表明，经过u i - i h p 处理过的橙汁、葡萄汁、苹 果汁的滋味与未经任何处理的原汁滋味相差无几。热敏性的芒果汁和桃汁经u h h p 处理后在冷藏下 贮存一年，滋味与鲜汁相比无任何损失。由于近年来无菌包装技术的目臻完善。超高压杀菌技术的 工业化应用将具有非常广泛的市场前景。 一些大公司也在探索利用高压均质技术进行常温杀菌。1 9 9 3 年，美国c o c a - c o l a 公司申请了高 压均质、压力释放对橙汁进行杀菌方法的专利。改公司利用高压均质机处理鲜果汁，有效降低了细 菌活力，达到和巴氏杀菌同样的货架保存效果。实验发现。鲜橙汁在1 0 3 。4 2 m p a 的压力下均质，微 生物活力降低9 9 ，没有必要再进行热力杀菌。并且在3 4 4 4 0 c 或更低的温度下保藏4 0 天，还保 持口味纯正。而未经超高压均质处理过的果汁在同样的保藏条件下的货架寿命是l o 天。如果提高均 质压力，会带来更显著的保藏效果【4 。u n i l e v e r 公司也在致力于这方面的研究。他们提供了一种管式 高压杀菌装置，其杀菌原理为：在一细管中通入稳定流动的流体，保持管进出口的压力差为1 0 0 m p a 或更高，产品在流经细管中的温度升高可以控制在5 c 以下。为了维持至少1 0 0 m p a 的压力差，需要 考虑细管进出口直径和长度以及处理物料的粘度和工作时的流量等因素的平衡。将该装置用于处理 酿酒酵母取得了很好的试验效果”。严格意义来讲，因为流体在管路中流速并不高，这种处理物料 的方式还是属于一种连续保持高静压力杀菌，但是在管路的出i s i 处仍存在压力释放的效果。我国廊 坊市通用机械有限公司研制的超高压均质机已经成功将颜料、机油等均质到纳米级，并已经做到对 细菌细胞的破碎。 6 中国农业大学硕士学位论文序论 1 3 研究目的与意义 微生物细胞组织结构是其生命活动的基础，外力作用对其组织结构的损伤破坏都会影响其生命 活性，动力杀菌正是基于对微生物细胞结构的破坏而实现灭活目的。以动力作用破坏微生物细胞结 构是食品工业中实现非热力杀菌的有效途径，这种纯动力的杀菌方式晟大程度的保全了食品物料的 天然特性，在保证安全性的同时肓效避免了风味物质和营养素的热损伤。 目前对于利用高压纳米破碎机进行动力杀菌的研究均集中在细胞破碎方面，现有的文献般都 是在探讨破碎枫理，破碎杀菌的效果及影响因素，如何改进细胞破碎的动力设备等方面。但是，大 规模的细胞破碎需要较强的动力作用，对于设备和能源提出了较高的要求，因此如果能在较弱的动 力作用下实现杀菌的目的无疑就具有现实的经济意义。本文试图通过研究较低强度动力作用下微生 物细胞损伤致死现象，来探索较低强度下动力作用的杀菌机理，从而改进杀菌设备，降低动力和能 源要求，以此促进冷杀菌的商业化应用。 1 4 论文的研究内容 在我们先前的研究中发现，当降低动力强度时，存在细菌非破碎死亡现象”，显然，以非破碎 的方式杀灭细菌所需要的动力作用强度和能量消耗要远低于破碎杀菌。 咀非破碎形式死亡的菌体虽然整体形态保持完整，但其内部的或局部的组织结构则已受到破坏。 对于这种内在或局部结构受损但整体形态仍相对完整的细菌损伤形式我们称之为微观损伤，由于微 观损伤而导致的细菌死亡称之为微观致死。 基于细胞破碎为表征的动力作用形式已研究得拢较清楚，但这些作用形式未必运用于微观损伤 致死。由于微观损伤致死现象为低强度动力作用的产物，因此本论文拟通过对微观损伤致死现象的 研究来探讨低强度动力作用的杀菌机理。具体研究内容包含以下几个方面： ( 1 ) 基于前期研究中发现的实验现象，考证微观损伤致死现象的存在，确立微观损伤致死的动 力作用条件。 ( 2 ) 研究不同动力作用条件下枯草芽孢杆菌的损伤形式，分析致死性的微观损伤。 ( 3 ) 探索动力作用形式与微观损伤形式的联系，分析产生致死性微观损伤的宏观动力作用条件。 耋星銎些奎兰堡圭兰篓鎏圣：! ，：，! 。，童耋耋堡堡皇丝垩垫窒堡垒螫垒竺兰竺童鎏 第二章枯草芽孢杆菌微观动力损伤致死的试验考证 2 1 引言 在前期的研究中，我们进行了以细胞破碎为表征的动力杀菌试验”“。用高压纳米破碎机处理酵 母菌悬液，在1 2 0 1 归a 压力下，一次处理可使酵母菌全部失活，但在光学显微镜下观察处理后的酵母 菌形态发现，仍有部分酵母菌整体细胞结构保持完整，这说明破碎率与致死率存在差异。由此推断， 在以动力作用处理微生物细胞过程中存在非破碎死亡即微观动力损伤致死现象，细胞局部组织结构 的损伤或内伤同样可以导致其活性丧失。 虽然前期试验中已经观察到了一些微观致死菌，但对此现象没有展开深入研究。本部分试验旨 在进步考证微观损伤致死现象的存在，证实在一定的动力作用形式下能否获得有效的微观致死效 果，并探索获得较高微观损伤致死率的临界动力条件。 2 2 试验方案 破坏微生物细胞组织结构的动力作用通常靠高压均质( 破碎) 机产生，当液体物料通过高压均 质阀时，料液中的微生物细胞受到包括压力释放、摩擦、碰撞、剪切、空穴振荡等各种形式的动力 破坏。在这些动力作用下，微生物细胞生存不可缺少的基本结构受到很大破坏，细胞由完整个体崩 解、碎裂为大小不的碎片，或使细胞的外部结构和内部组织产生微观损伤，从而导致其活性下降 甚至丧失。 此次试验选用的n c j j - - 0 0 7 5 1 5 0 型纳米高压均质机上配备了两级高能激光熔钻微孔均质阀， 孔径分别为1 2 岫和2 0 脚，最高处理压力为1 5 0 m p a 。这种设备对枯草芽孢杆菌细胞的破坏作用主要 在以下方面反映： 在高压作用下，含有细胞的料液高速通过均质阀薄片，料液中的细胞承受的压力在瞬间发生 由高压到常压的转换，这种高压瞬间释放引起细胞膨爆。 枯草芽孢杆菌悬液高速通过均质阀微孔时，细菌体与粗糙的孔壁发生剧烈摩擦，引起细胞表 观结构受损。 流体通过喇叭状的均质阀时，在垂真其流速的方向存在有很大的速率梯度，对枯草杆菌细胞 产生强烈的剪切和拉伸作用。 细胞浆在高压作用下发生气液相转换产生的空穴振荡作用。 根据微孔阔的尺寸和结构，在保证动力强度的前提下选择了均质阀的4 种配置形式，以期产生 不同的作用效果。同时动力作用还取决于压力、处理次数以及均质阀孔径等参数条件。因此，本次 试验计划如下： 1 在每种阀门组合下设置一系列较低压力对菌悬液进行处理，考察均质阀配置形式和压力对非 破碎死亡率的影响。 2 选择2 0 m p a 压力，在每种阁门组合形式下进行不同次数的处理，考察不同处理次数下的非破 8 中困农业大学硕士学位论文枯草芽孢杆菌微观动力损伤致死的试验考证 碎死亡率。 3 选择内壁光滑的大孔均质阀，进行与上述压力条件和处理次数相平行的杀菌试验+ 考察均质 阀孔径和粗糙度对非破碎死亡率的影响。 2 3 材料与方法 ( 1 ) 试验材料 枯草芽孢杆菌1 1 8 4 9 ，中科院微生物所。牛肉膏蛋白胨培养基 ( 2 ) 试验设备 0 0 0 5 1 5 0 型纳米超高压均质机，廊坊通用机械有限公司制造 ( 3 ) 试验方法 1 ) 细菌培养：菌种经斜面活化2 4 h 后接种至液体培养基中3 0 。c 振荡培养1 5 h 至其对数期。 2 ) 杀菌设备的清洗与消毒：先用9 5 酒精对物料处理部分进行循环消毒，再用无菌水清洗，然 后对振荡头部分进行高压灭菌。 3 ) 活菌计数：用平板计数法测定液体培养基中的枯草芽孢杆菌菌数。 4 ) 完整菌体计数：取o o l m l 液体培养基，滴加在载玻片上i c m 2 的面积内，均匀涂片，染色， 待风下后光学显微镜下镜检计数，选取3 0 个视野取其平均值。 5 1 料液的杀菌处理： a 将均质阀按照所要采用的配置形式装配好。 b 通过控制面板选择欲采用的压力。 c 将培养好的菌悬液以无菌操作的方式加入进料杯，运行机器，设定压力与转速，使均质阀内 实际压力达到所需值。待运行一段时问后，在出料口以无菌操作的方式接收处理后的菌悬液。 b 循环清洗机器。 6 ) 致死率的测定：平板计数法测定处理后菌悬液的残存活菌数，计算致死率。 致死率= 塑塑需未茅堕塑圳。 7 ) 破碎率的测定：光镜下镜检计数处理后菌悬液中的残存完整菌数，计算破碎率。 破醉= 塑篱笋川。 8 ) 微观致死率的测定：由致死率和破碎率计算微观死亡率 微观损伤致死率= 致死率一破碎率 ( 4 ) 试验步骤 细菌培养一杀菌设备清洗消毒一活菌计数一料液杀菌处理一残存活菌计数一残存完整菌体计数 一设备清洗 试验重复三次，测其平均值，得到不同动力条件下的致死率、破碎率、微观损伤致死率。 9 中国农业大学硕士学位论文枯草芽孢杆菌微观动力损伤致死的试验考证 2 4 结果与讨论 2 4 1 讨论 高强度动力作用下的杀菌方式表现为细胞破碎，因此我们对微观损伤致死现象的考证主要在一 系列低强度动力处理下进行。低强度处理条件的选择是通过对所用均质阀的配置进行组合，然后在 小同的组合下，按照由低至高的处理强度进行探索试验。 ( 1 ) 囤2 - l 图2 - 5 为不同处理条件下的枯草芽孢杆菌平扳培养照片和其处理后形态的光学显微 镜照片。光镜观察发现，在试验采用的各种相对较低的动力作用范围内，枯草芽孢杆菌有明显破碎 现象，但存在整体结构相对完整的菌体细胞( 见图2 - 1 2 5 的光镜照片) ，同时，对动力处理后的枯草 芽孢杆菌进行平板培养，考察致死性( 见图2 1 2 5 的培养照片) 。分别对各种处理条件下的破碎率和 致死率进行统计，其结果以直方图的形式给出( 图2 1 1 2 5 - 1 ) ，从圈中我们可以看出，在试验采用 的各种动力条件下，枯草杆菌细胞的致死率均高于破碎率，这一结果表明，在较低的动力强度下， 微观致死现象普遍存在。 ( 2 ) 试验采用的压力条件是基于机器的压力范围，从其能够稳定工作的最低压2 0 m p a 开始处理， 然后逐渐升压。由于不同阀门组合的动力强度还需通过试验来考证，因此，我们在每一种阀门组合 下都采取从2 0 m p a 压力开始，逐渐升压的1 次处理方式。试验结果表明，在每一种阀门组合形式下， 在由低至高的一系列压力范围内，均存在不同程度的微观损伤致死。从致死率和破碎率的直方图上( 图 2 - 1 - 1 2 4 - 1 ) 我们可以看出，4 0 5 0 m p a 的压力范围内微观损伤致死效果最为明显。 ( 3 ) 考察不同处理次数下的微观损伤致死效果首先选择最低强度的2 0 m p a 压力条件进行不同 次数的处理，统计其死亡率和破碎率。图2 1 - 2 2 5 2 为每种阀门组合下，采用2 0 m p a 压力，进行 不同次数处理的破碎率和致死率直方图。由图可见，随着处理次数的增加， 古草芽孢杆菌细胞的破 碎率和死亡率显著提高，但多次处理后的致死率和破碎率之间的差值却非常小，这说明多次处理条 件下，微观损伤致死的枯草芽孢杆菌细胞极少。所以处理次数不宣作为实现菌体微观损伤致死的动 力条件。 ( 4 ) 试验中除验证了内壁粗糙的小孔均质阀对微观致死效果的影响外，还选择了内壁光滑的大孔 均赝阀来考证微观致死现象。同样采用由最低2 0 陌压力开始，逐渐升压 次处理舶方式。结果表 明，利用内壁光滑的大孔均质阀可以在不同压力下实现枯草芽孢杆菌的微观损伤致死。大孔阀的最 佳微观损伤致死压力范围高于小孔阔f 图2 - 5 - 2 ) 。 ( 5 ) 试验中对小孔均质阀的每一种阀门配置都进行了由低压至高压、由一次至多次的微观损伤致 死试验验证。在每种均质阀配置下，均能在相对低压下实现对枯草芽孢杆菌微观损伤致死，面不同 的阀门组合下，微观损伤致死率存在差别。 2 , 4 2 结论 ( 1 ) 枯草芽孢杆菌细胞微观结构损伤致死现象在低动力强度作用下普遍存在。在不同形式的均 质阀组合下，以2 0 m p a 7 0 m p a 的相对低压对枯草芽孢杆菌细胞旄加动力破坏，菌体细胞的死亡率普 1 0 中国农业大学硕士学位论文 枯草芽孢杆菌微观动力损伤致死的试验考证 遍高于其破碎率，说明存在非破碎死亡，即存在细胞微观结构动力损伤致死现象。 2 ) 压力、均质阀配置形式和阀门构造是实现微观动力杀菌的有效宏观动力手段，较高的微观损 伤致死率发生在4 0 5 0 m p a 的压力范围内。增加处理次数可以显著增加致死率和破碎率，但多次处 理后的微观损伤致死率却非常低。 ( 3 ) 在较低的压力下即发生枯草芽孢杆菌细胞微观结构损伤致死现象，说明压力不是导致细胞微 观损伤致死的直接动力原因，只是产生动力作用的基础或条件。 图2 - 1 阀门组合正一正，不同压力下1 次处理后的培养照片和光镜照片 t a b 0 2 - 1 p h o t o f o r b r e e d 剐柑o p t i c a l m l c r o s o p e o f b a t e g g s u & # l h j 丘r a n g e i 廿i 扫f o r f a c e t o f a c e s n d d | f f e t e n t p r e s s u r e sf h r e 缸c 圈2 1 壤) t a b l e2 - 1 ( c o n t i n u e ) 2 尘里窒些奎兰堡圭鎏篓i ：一。 ，一。一。堑圣童堡垒童丝坠蝥奎銎堡圣丝墼兰竺茎垩 圈2 - 1 续) t a b l e2 - 1 ( c o n t i n u e ) 图2 - 1 1 阀门配置：正_ 正，不同压力1 次处理的破碎率和致死率直方国 f i g u r e f o r d e a t hr a t e sa n db r o k e nr a t e s i nv a l v e i n s t a l l f o r f a c e t o f a c e a n dd i f f e r e n t p r e s s u r e s f o r o n e t i m e 圈2 1 2 阀门配置：正一正，2 0 m p a 压力多次处理的破碎率和致死率直方图 t a b l e2 - 1 - 2f i g u r ef o rd e a t hr a t e sa n db r o k e nr a t e si nv a l v ei n s t a l lf o rf a c et of a c ea n dd i f f e r e n tt i m e sw i t h2 0 m p a 1 4 图2 - 2 阀门组合正呻反，不同压力1 次处理的培养照片和光镜照片 p h o t of o rb r e e da n do p t i c a lm i c r o s c o p eo f b a c i l l u ss u b t i l i si nv a l v ei n s t a l lf o rf a c et oa n t if a c ea n d d i f f e r e n tp r e s s u r e sf o ro n et i m e 1 5 中国农业大学硕士学位论文 枯草芽孢杆菌微观动力损伤致死的试验考证 图2 2 ( 续) t a b l e2 - 2 ( 续) 6 图2 - 2r 续1 t