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中文摘要 具有不同数量几丁质结合域的杂交几丁质酶 的构建及特性分析 微生物学专业硕士研究生裴小琼 指导教师裴炎教授 中文摘要 昆虫病原真菌是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一，具有直接穿透昆虫体擘而使 其致病的独特机制。在穿透昆虫体壁的过程中，真菌会分泌一系列的水解酶，如几丁质酶和 蛋白酶，降解寄主体壁，帮助菌丝穿透。结构分析表明，大多数几丁质酶具有多个结构域， 包括催化域、铰链区和几丁质结合域。几丁质结合域能帮助几丁质酶结合到几丁质底物上， 提高局部区域的酶浓度，从而促进对底物的降解。然而目前发现的来自昆虫病原真菌的几丁 质酶缺乏几丁质结合域。本实验室的前期工作表明，在不具有几丁质结合域的昆虫病原真菌 几丁质酶b b c h i t l 上添加家蚕几丁质酶的几丁质结合域，可以提高几丁质酶b b c h i t l 对不溶性底 物的结合及降解能力。在球孢白僵菌中超量表达该融合蛋白，菌株的毒力得到显著提高。但 是添加更多的几丁质结合域是否可以进一步增强几丁质酶与底物的结合能力，促进对底物的 降解，从而进一步提高菌株的毒力呢? 基于此设想，本文在前期工作的基础上构建了具有多 个几丁质结合域的杂交几丁质酶，并进行了表达及特性分析。 获得的主要结果如下： 1 杂交几丁质酶毕赤酵母表达载体的构建 在具有一个几丁质结合域的杂交几丁质酶b b c h i t i b m c h b d ( 本实验室构建) 基础上， 构建了具有两个和三个几丁质结合域的杂交几丁质酶的酵母表达载体 p p i c 9 k - b b c h i t l - ( b m c h b d h 和p p l c 9 k - b b e h i t l - ( b m c h b d ) 3 。 2 杂交几丁质酶的酵母表达及特性分析 在毕赤酵母中表达并纯化了带有l 、2 和3 个几丁质结合域的杂交几丁质酶 b b c h i t i - b m c h b d 、b b c h i t l 一( b m c h b d h 、b b e h i t l 一( b m c h b d ) 3 和野生型几丁质酶b b c h i t i 。结 合分析和酶学特性分析结果表明：1 ) 在酶浓度为8 0 p g m l 时，几丁质结合域的个数和杂交 几丁质酶与粉末几丁质的结合存在剂量效应，即随着几丁质结合域数量的增加，杂交几丁质 两南大学硕十学位论文 酶与粉末几丁质的结合能力增强。杂交几丁质酶b b c h i t l b m c h b d 、b b c h i t l ( b m c h b d ) 2 和 b b c h i t l - ( b m c h b d ) ，与粉末几丁质的结合率分别为6 4 4 、6 7 4 和8 6 8 ，明显高于野生型 几丁质酶( 4 3 ) 。而酶浓度为4 0 i t g m l 时，杂交几丁质酶与粉末几丁质的结合无明显差异。 2 ) 添加几丁质结合域对几丁质酶的最适反应温度和最适反应口h 无明显影响，野生型和杂交 几丁质酶均在p h 5 0 和5 5 c 的条件下具有最高的凡丁质酶活性。虽然添加几丁质结合域提高 了几丁质酶降解不溶性底物的能力，却降低了杂交酶的热稳定性。 3 杂交几丁质酶球孢白僵菌表达载体的构建 为了进一步分析几丁质结合域对球孢白僵菌毒力的影响，构建了b b c h i t i - ( b m c h b d ) 2 和 b b c h i t i - ( b m c h b d ) ，的球孢白僵菌表达载体p u c - b “：g f p b b e h i t l 一( b m c h b d ) 2 和 p i l c - b ：g 币一b b e h i t l - ( b m c h b d ) 3 。在下一步工作中，将进行相应的生测试验。 本论文研究表明添加2 个和3 个几丁质结合域b m c h b d 可以增加杂交几丁质酶对不溶性几 了+ 质的结合与水解能力，但是对球孢白僵菌的毒力的影响需要进一步研究。 关键词：几丁质酶几丁质结合域球孢白僵菌 n a b s t r a c t c o n s t r u c t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f h y b r i d c h i t i n a s e sw i t hv a r i o u sn u m b e r so f c h i t i n b i n d i n gd o m a i n s c a n d i d a t e ：p e ix i a o q i o n g a d v i s o r ：p r o f p e iy a n a b s t r a c t e n t o m o p a t h o g c u l cf u n g ia r ci m p o r t a n tb i o c o n t r o la g e n t sa g a i n s ta g r i c u l t u r a li n s e c t sa n di n v a d e t h e i rh o s t s b y d i r e c tp e n e t r a t i o no ft h eh o s t c u t i c l e d u r i n g t h e p e n e t r a t i o np r o c e s s ， e n t o m o p a t h o g c n i cf u n g ip r o d u c ee x w a c e u u l a rp l u 把a s a n dc h i t i n a t od e g r a d et h ep r o a f i n a c c x n b a n dc h i t i n o u sc o m p o n e n t so f i m e c tc u t i c l e ，a l l o w i n gh y p i m lp e n e t r a t i o nt h r o u g ht h ec u t i c l e ，m o s to f c h i t i n a s e sa r em u l t i d o m a l ne n z y m g $ c o n s i s t i n go fa c a t a l y t i cd o m a i n , al i n k e rr e g i o n , a n da c h i t i n - b i n d i n gd o m a i n ( c h b d ) t h ec h i t i n - b i n d i n gd o m a i nf a c i l i t a t e sc h i t i n a s eb i n d i n gt oi n s o l u b l e c h i t i na n dt h e r e b ye n h a n c e ss u b s e q u e n th y d r o l y s i sb yt h ec a t a l y t i cd o m a i n h o w e v e r , s of a r c h i t i n - b i n d i n gd o m a i nh a v en o tb e e nf o u n di nt h ec h i t i n a s er e p o r t e di ne n m m o p a t h o g e n i cf u n g i f u s i o n o fac h i t i n - b i n d i n gd o m a i nf r o mt h es i l k w o r mb o m b y xm o r it ob b c h i t l ，ac h i i m a a ef r o mt h e i n s e c t - p a t h o g e n i cf _ l m g i ，b e a u v e r i ab a s s i a n a ，t of o r m a l l e n g i n e e r e dc h i t i n a s ee n h a n c e dt h e c h i t i n o l y t i ca b i l i t yo fb b c h i t la g a i n s ti n s o l u b l ec h i t i n o v e r e x p r c s s i n go ft h i sh y b r i dc h i t i n a s e i n c r e a s e dt h ev i r u l e n c eo f b b a s s i a n at o w a r da p h i d s t oi n v e s t i g a t ew h e t h e ra d d i n go f m o r ec h i t i n b i n d i n gd o m a i n st ot h ec - t e r m i n a lo f b b c h i t l - b m c h b dw h i c hp o s s e s s e do n ec h i t i nb i n d i n gd o m a i n w o u l df u r t h e ri m p r o v et h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e s ，t w oo rt h r e ec h i t i n - b i n d i n gd o m a i n sw e r ef u s e dt o b b e h i t lt of o r me n g i n e e r e dc h i t i n a s e s t h eh y b r i dc h i t i n a s e sw e r ee x p r e s s e di np i c h i a p a s t o r i sa n d t e s t e df o rm y m a t i cp r o p e r t i e s t h er e s u l t sa ma sf o l l o w i n g s ： i c o n s t r u c t i o no f h y b r i de h i t i n a s e s b a s eo nt h eh y b r i dc h i t i n a s ew i t ho b ec h i t i n - b i n d i n gd o m a i nf r o ms i l k w o r m 丑m o r i ( b m c h b d ) t h eh y b r i dc h i t i n a s e sb b c h i t i - ( b m c h b d ) a n db b c h i t i - ( b m c h b d ) 3w i t ht w oo rt h r e cb m c h b d ， r e s p e c f i v e l gw e r ec o n s u u c t e d 2 e x p m s i o na n da n a l y 凼o f h y r i dc h i t i n a s e s t h ew i l d - t y p ec h i t i n a s eb b c h i t la n dt h eh y b r i dc h i t i n a s e sw e f es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e da n d 1 1 1 两南大学硕士学位论文 p u r i f i e df r o mpp a s t o r i $ a tt h ee 1 1 z y n l ec o n c e n w a t i o no f8 0p g m l , c h i t i nw a sb o u n de f f i c i e n t l yb y b b o h i t l - ( b m c h b d ) 3 ( 8 6 8 b i n d i n g ) ，b b c h i t l - ( b m c h b d ) 2 ( 6 7 4 b i n d i n g ) a n db b c h i t l - b m c h b d ( 6 4 4 b i n d i n g ) w h i l e ，o n l y4 3 o fb b c h i t lw a sb o u n dt oc h i t i n w h c ut h ec o n c e n t r a t i o nw a s d e c r e a s e dt o4 0p 咖l ，n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e so nt h eb i n d i n gc a p a b i l i t yo f h y b r i dc h i t i a u s e sw e ” o b s e r v e d h y b r i dc h t i u s s e sa n db b c h i t ih a v es i m i l a ro p t i m u mr c t i o np ha n dt e m p e r a t u r e h y b r i d c h t i n a s e sc n h , m l c e $ h y d r o l y s i sa g a i n s ti n s o l u b l ec h i t i n h o w e v e r , t h et h e r m o s t a b i l i t ya s s a yi n d i c a t e d t h a ta d d i n gc h i t i nb m d i n gd o m a i nd e c r e a s et h e r m o s t a b i l i t yo f b b c h i t l 3 c o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no fh y b r i dc h l t i n a s e si n 置加潮口 t h ev c c 幻w h i c hc o n t a i n e dh y b r i dc h i t i n a s e su n d e rt h ec o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s i n gp r o m o t e ro f g p a ，w e r ec o n s t r u c t e da n du s e dt ot r a n s f o r m & b a s s i a n aw i l d - t y p es t r a i u i no u r n e x ts t u d y i n g w e w i l la s 8 e s st h ev i r u l e n c eo f 且b s i a n ao v e r e x p r e s s i n gh y b r i dc h i t i n a s e sw i t ht w o o rt h r e ec h i t i n b i n d i n gd o m a i n r e s u l t si nt h ep r e s e n tp a p e rd o e m n e n t e dt h a tt h eh y b r i dc h i t i u s s e sw i t ht w oo rt h r e ec h i t i nb i n d m g d o m a i n s ( b m c h b d ) h a v eh i g h e rb i n d i n ga n dh y d r o l y t i ca b i l i t yf o ri n s o l u b l ec h i t i nc o m p a r e dt o h y b r i dc h i t i n a s ew i t ho u eb m c h b d h o w e v e r , w h e t h e rb o t ho ft h et w oh y b r i dc h i t i n a s e sc o u l db e u s e dt oi m p r o v et h ep e r f o r m a n c eo f e n m m o p a t h o g e n i cf u n g ir e q u i r e df u r t h e rs t u d y i n g k e yw o r d s ：c h i t i n a s ec h i t i n - b i n d i n gd o m a i n b e a u v e r i ab a s s i a n a 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 昆虫病原真菌在生物农药中的重要性 化学农药一直是防治病虫草害的重要手段。但其长期施用对环境和健康带来 了一系列问题。而生物农药具有对环境友好和害虫不易产生抗性等优点使其逐渐 成为化学农药的一个重要补充和替代。微生物生物农药主要有细菌、病毒和真菌。 其中昆虫病原真菌( e n t o m p a t h o g e n i cf u n g i ) 是刺吸式口器昆虫和鞘翅目昆虫的有效 防治手段，已在病虫害防治中显示出了良好的应用前景。目前研究和应用较多的 昆虫病原真菌主要有金龟予绿僵菌( m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ) 、球孢白僵菌 ( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 、玫烟色拟青霉( p a e c i l o m y c e s f u m o a o r o c u e ) 和蜡蚧轮枝菌 ( v e r t i c i l l i u m l e c a n i i ) 等。但是昆虫病原真菌在世界生物农药市场所占的份额却较 少，其原因在于其击倒害虫的时间过长和防效不稳定。利用基因工程技术对昆虫 病原真菌的致病机理和相关的毒力机制进行研究，有助于提高杀虫效果和商业价 值。 昆虫病原真菌是自然界控制害虫群体的主要因素之- - ( c h a r n l e y e l a ，1 9 9 7 ) 。 昆虫病原真菌是指那些在寄主正常生理条件下能直接侵入体内增殖和快速引起死 亡的类群。它们以吸收血淋巴中养分、分解寄主组织，和或产生有毒代谢产物 而杀死昆虫。广义的昆虫病原真菌还包括兼性病原和伤口病原( 梁宗琦，1 9 9 6 ) 。 多年的研究和生产实践表明，昆虫病原真菌有很多优点( 李增智，1 9 9 7 ) ：1 ，昆 虫病原真菌种类多，迄今已记录约1 0 0 属近1 0 0 0 种。我国己记录约5 0 属3 0 0 种。不 同的真菌寄主谱不同，一种昆虫多能被多种真菌寄生；2 ，由于独特的侵染方式， 对于有些昆虫( 尤其是刺吸式口器昆虫) 来说，真菌是唯一有希望的病原微生物： 3 ，昆虫病原真菌一般能侵染其寄主的不同发育阶段( 有时甚至包括卵) ，应用期 较长；4 ，昆虫病原真菌对人和其它脊椎动物没有危险，一般也不伤害昆虫天敌； 5 ，真菌致死昆虫后一般能在其体外大量产孢，引起扩散，在适宜的时候能形成流 行病；6 ，同各种天敌和杀虫剂相容；7 ，害虫对真菌产生抗性的可能性较小；8 ， 生长和繁殖快，易大量生产。基于以上这些优点，昆虫病原真菌有着广阔的开发 和应用的前景。 1 2 昆虫病原真菌的致病机制 昆虫病原真菌是唯一能通过昆虫体表侵染昆虫的微生物，是刺吸式口器昆虫 的重要的生物防治手段。昆虫病原真菌侵染昆虫的主要过程如图1 1 所示：l ，孢 子附着在寄主的表皮并萌发；2 ，侵染结构形成( 通常是不同的附着胞) ；3 ，侵染 钉的形成；4 ，菌丝进入寄主体腔，在寄主体内生长并致病( c l a r k s o n e l a ，1 9 9 6 ) 。 两南大学硕士学位论文 图l l 昆虫病腺真菌致病机制图( 摘自c l a r k s o n e f a ，1 9 9 6 ) f i g 1 it h e i n f e c t i o nm e c h a n i s md i a g r a mo f e n t o m o p a t h o g c n i cf u n g i ( a d o p t e df r o mc l a a s o ne ta ，1 9 9 6 ) 1 2 1 昆虫病原真菌致病昆虫的过程 昆虫病原真菌不需要被吞食而直接通过昆虫的外骨骼或表皮侵入虫体，是比 较特别的。它们可以感染昆虫的非取食阶段，如卵和蛹。真菌感染昆虫的部位一 般是在口器、节间折叠部位和气孔，这些部位的高湿度可以促进孢子的萌发，而 且没有骨化的表皮也有利于真菌的侵入( c h m n l e y ，1 9 8 9 ；h a j e ka n ds t l e g e r , 1 9 9 4 ) 。昆虫病原真菌通过附着胞黏附在昆虫体表开始侵染，昆虫病原真菌孢子附 着于昆虫体表。然后孢子在较高的湿度条件下，受寄主体表有关活性物质( 如选择 性蛋白质) 的刺激，通过克服寄主体壁上一些物质的抑菌作用而萌发，产生芽管 ( g e r mt u b e ) 。芽管依靠菌丝先端分泌的粘液粘附在上表皮表面并逐渐伸长、分 化产生诸如附着胞等的侵染结构，然后在附着胞先端的适当位冠产生侵染钉 ( p e n e t r a t i o np e g ) 。附着胞在建立昆虫病原真菌与寄主的相互关系中起着很重要 的作用，产生很高的膨压并分泌体壁降解酶，帮助侵染钉穿透昆虫体壁。 昆虫体壁主要由外表皮、i i i 表皮、后表皮和皮脂层组成( c l a r k s o nj a n d c h a m l e y a k ，1 9 9 6 ) 。外表皮主要由鞣化蛋白、多酚、脂肪酸和酯类组成；前表皮和后表皮 是昆虫体壁的主要部分，主要由几丁质和填充在其中的蛋白质组成；皮脂层是一 层有活性的细胞组成，向外分泌物质形成昆虫体壁。昆虫病原真菌侵染昆虫时， 穿透昆虫体壁是一关键步骤。对昆虫体壁的侵入是机械压力和酶共同作用的结果。 真菌入侵体壁自仃存在一个对营养的选择作用，可能造成物理压力，迫使真菌侵入 内含营养的虫体，同时入侵时真菌分泌的体壁降解酶消解体壁，打通通道，提供 营养，使侵染成功。 2 第一章文献综述 昆虫病原真菌在穿透昆虫体壁进入寄主血腔之后，就以囊孢子( b l a s t o s p o r e ) 、 原生质体( p r o t o p l a s t ) 及类原生质体等形式在寄主血腔内大量生长。同时产生一系 列的毒素，如白僵菌素( b e a u v e r o l i d e s ) 、环孢素( c y e l o s p o r i n e ) 及破坏菌素( d e s t r u x m ) 等也可能导致寄主昆虫死亡( g i l l e s p i ee ta ，2 0 0 0 ) 。然后昆虫病原真菌经过一 定时间的寄主生长后又从寄主体内长出，在虫尸的表面产生分生孢子并开始下一 轮侵染( c l a r k s o n 甜a ，1 9 9 6 ) 。当真菌在虫体上形成了孢子，就完成了感染昆 虫的整个生活史。在适当的条件，特别是高湿度条件下，真菌突破昆虫体壁，产 生气生孢子。这可以导致在昆虫群体内水平或垂直传播该疾病，形成流行病，而 留在病死昆虫体内的孢子则可以度过不利的条件。 1 2 2 侵染过程中体壁降解酶的作用 在昆虫瘸原真菌侵染昆虫时，穿透体壁是一个非常关键的过程，对此过程的 研究比较多也比较清楚。现在许多研究表明，昆虫病原真菌穿透昆虫体壁时产生 大量的水解酶，如蛋白酶、几丁质酶、脂酶和酯酶等，这些水解酶中较重要的是 蛋白酶和几丁质酶。对其作用机制和调控机理进行了大量的研究，其相关的基因 也被陆续的克隆。 1 ，2 2 1 蛋白酶 蛋白质是昆虫表皮的主要组成部分，因此，蛋白酶在昆虫病原真菌入侵过程 中起着重要的作用。s t l e g e r 等对昆虫病原真菌侵染寄主过程中产生的凝乳弹性蛋 白酶( p r l ) 和类胰蛋白酶( p r 2 ) 进行大量的研究。结果表明，p r l 的活力与昆虫 病原真菌侵染寄主的毒力密切相关，对昆虫的外壳有很强的降解能力，能够促进 真菌的入侵，还能激活昆虫的酚氧化酶系，使大量的酚类物质被氧化为醌类物质， 导致昆虫因醌类物质积累过多而自毒死亡( s t l c g c re l a l ，1 9 9 6 ) 。p r 2 多为丝氨 酸类蛋白酶( s t l e g e re t a l ，1 9 8 6 ) ，在功能上与p r l 不同，主要降解表皮中的可 溶性蛋白，虽然不直接降解寄主表皮，但可能对寄主表皮的降解有调控作用。徐 均焕等( 1 9 9 8 ) 通过测定1 7 株不同来源球孢白僵菌的胞外蛋白酶活性( v u ，p m o l m 1 4 m 酊1 ) 及其对血黑蝗( 胁，口阼印乜，fa n g u i n p e s ) 的毒力，分析用酶活性作为 毒力指标的可靠性。结果表明，菌株间毒力和酶活性差异较大，l ，t 5 0 的变化范围为 5 2 7 1 6 8 9 d ，对接种后各日累计死亡率及l t 5 0 进行回归分析，发现各菌株p u 与其 毒力相关显著。因此，p u 可作为大量菌株初筛的参考性毒力指标，但应谨慎使用， 不能以p u 钡i 定完全取代常规的毒力测定。 1 2 2 1 1 蛋白酶的类型及鉴定 西南大学硕十学位论文 真菌的蛋白酶的种类比细菌多( m a l a b r a o e l a ，1 9 9 8 ) ，如米曲霉能产生酸 性、中性和碱性蛋白酶。真菌蛋白酶有很广的活性范围( p h 4 到1 1 ) ，和很广的 底物特异性。真菌酸性蛋白酶最适反应p h 值在“5 ，能在p h 值2 5 6 条件下稳 定。真菌中性蛋白酶是金属蛋白酶，在p h 值7 0 有活性。在附着胞和以昆虫体壁 为唯一碳氮源的诱导培养基中有多种蛋白酶的表达，这些蛋白酶可分为两大类。 其一是对底物短肽s u e - a l a - a l a - p r o p h e - n z 具有活性，包括p r l ( 类枯草杆菌蛋白 酶) ；另一类是对短肽b e n p h e v a l a r g - n a 有活性的蛋白酶，包括p r 2 ( 胰蛋白酶) ( 裴炎等，2 0 0 3 ) 。而在以昆虫体壁为唯一碳氮源的诱导培养基中，金龟子绿僵 菌会产生多种蛋白酶，包括类枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n 1 i k ep r o t e a s e ) ，胰凝乳 蛋白酶( c h y m o t r y p s i n ) 金属蛋白酶( m e t a l l o p r o t e a s e ) ，胰蛋白酶( t r y p s i n ) ， 氨肽酶( a m i n o p e p t i d a s e ) 等。 昆虫病原真菌的孢子在昆虫表皮萌发过程中形成附着胞，产生一种能迅速降 解寄主表皮蛋白的丝氨酸类蛋白酶，被称为昆虫病原真菌凝乳弹性蛋白酶p r l ，由 于其性质与枯草杆菌蛋白酶相似，又被称为类枯草杆菌蛋白酶( 彭国雄等，2 0 0 0 ) 。 s t l e g e r 等( 1 9 9 6 ) 将来源于金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因p ，朋转入金龟 子绿僵菌，组成性的高效表达，转化子的杀虫速度大大提高。p ，埘表达水平最高 的重组子的杀虫时间缩短了2 5 ，昆虫取食量减少了4 0 。他们还证明了丹朋基因 是一个致病因子，在昆虫血淋巴中高浓度的p r l a 蛋白酶会引起昆虫酚氧化酶的过度 表达，从而导致昆虫中毒死亡。将蛋白酶注射到昆虫体内，能引起虫体黑化。方 卫国等( 2 0 0 2 ) 在球孢白僵菌中克隆了一个全长为1 1 5 7 b p ，命名为c d e p 珀日基因。 此基因含有一个1 1 3 4 b p 的开放阅读框( o r fo p e nr e a d i n g e l l z y m e p r o t e i n a s e ) ，编码 一个3 7 7 个氨基酸、分子量为3 8 6 1 6 的蛋白质，等电点为8 3 0 2 。n 端1 8 个氨基酸是 一个信号肽序列，其中含有一个带正电荷氨基酸( a r g ) ，8 个氨基酸的疏水区域和螺 旋转弯的氨基酸( p r o ) ，信号肽的剪切位点序列与蛋白酶k 、金龟子绿僵菌p d 、球 孢白僵菌p r l 的同源性分别为：5 7 9 、5 4 7 、8 3 3 。而球孢白僵菌凝乳弹性蛋白酶 b b p d ，是分子量为3 3 6 k d 左右和p i 为7 4 的蛋白酶。底物专一性测定显示，b b p r l 能水解p h e 或l e u 形成酰胺键和肽链。b b p f l 可被p m s f 抑制，表明其活性中心有s e r 残基，还可被胰凝乳蛋白酶抑制剂t p c k 和凝乳弹性蛋白酶抑制剂t e l 等所抑制； 胰蛋白酶抑制剂i e u p e p t i n 和e p i a n s m t m 及胃蛋白酪抑制剂p e p s t a i n 对b b p r l 活性无影 响( 杨星勇等，2 0 0 0 ) 。 丝氨酸类胰蛋白酶p r 2 是昆虫病原真菌中另一类重要的内切蛋白酶，在功能上 与p r l 不同，主要降解表皮中的可溶性蛋白，虽然不直接降解寄主表皮，但可能对 寄主表皮的降解有调控作用。裴炎等( 2 0 0 0 ) 以蝉蜕为底物诱导绿僵菌产生分解 昆虫外壳蛋白酶m a p 2 1 就是p r 2 蛋白。现在对此类蛋白酶的研究较少。 4 第一章文献综述 除了上述两种主要的蛋白质内切酶外，昆虫病原真菌在穿透寄主体壁的过程 中还会产生一些外切蛋白酶，如：氨肽酶。 1 2 2 1 2 蛋白酶对表皮的降解作用 附着昆虫寄主体表的真菌孢子，在适宜条件下萌发并产生芽管侵入表皮，不 溶性表皮成分被胞外酶降解成真菌生长所需的可溶性单体和其它低分子成分。蛋 白酶降解昆虫表皮一般经历以下几个步骤：( 1 ) 酶分泌后被吸附到表皮上，该吸附 过程多半由于表皮中羧基的作用；( 2 ) 蛋白酶作用位点与表皮蛋白质的专一性肽链 序列对接；( 3 ) 表皮肤片段被降解成氨基酸。 蛋白酶在起水解作用前必须先吸附到表皮上，吸附过程相当复杂，有以下途 径：l ，静电吸附作用。如绿僵菌蛋白酶能通过静电作用吸附到昆虫体表，用阴离 子去污剂处理体壁可增加其负电荷而促进蛋白酶的吸附( s t l e g e r e ta l ，1 9 8 6 ) 。2 ， 与蛋白质羧基的结合。b i d o c h k a 等( 1 9 9 4 ) 研究发现，通过对表皮蛋白质进行羧基酯 化( e s t e r i f i c a t i o n ) 和羧基酰胺化( c a r b o x a m i d a t i o n ) 的处理，可增加表皮对白僵菌蛋白 酶的吸附；而表皮酪氨酸羧基的乙酰化( a c e t y l a t i o n ) 处理将导致表皮对绿僵菌和轮 枝菌蛋白酶吸附力的下降，但不影响其对白僵菌蛋白酶的吸附。3 ，与蛋白质羟基 的结合。当寄主表皮存在酪氨酸羟基时，绿僵菌和轮枝菌蛋白酶需要在羧基和羟 基共同作用下才能达到最大的吸附量( b i d o c h k a e t a l ，1 9 9 2 ) 。4 ，与病菌的理化性 质和生理状态有关。如真菌孢子的疏水性及附着孢的形成影响到它侵入的位点， 这些位点往往也是蛋白酶的吸附点。 蛋白酶成功的吸附到昆虫表皮后，就开始降解表皮蛋白质。先是降解酸性蛋 白质，可能是因为白僵菌和绿僵菌的胞外蛋白酶主要是呈碱性的丝氨酸蛋白酶( p h = 1 0 ) ( 徐均焕等，1 9 9 8 ) 。 1 2 2 2 几丁质酶 几丁质是昆虫体壁的重要组成成分，由n 乙酰b d 葡萄糖氨 ( n - a c e t y i b d g l u c o s a m i n e ，g i u n a c ) 以p 1 ，4 糖苷键连接而成的不分支链状多糖， 占体壁干重的1 7 5 0 ，可以稳定上皮蛋白并为昆虫提供机械屏障。昆虫病原真菌 侵染昆虫时产生几丁质酶水解几丁质。s t l e g e r 等( 1 9 9 1 ) 从含l 粉末几丁质的 金龟子绿僵菌培养液中纯化了一个内切几丁质酶。纯化的几丁质酶不能水解芳基 糖苷与壳二糖( n 一乙酰葡萄糖氨的二聚体) ，对壳三糖仅有极低的活性，但能迅 速降解四聚体。该几丁质酶与其它微生物产生的几丁质酶有许多相似之处，包括 最适p h 5 3 ，分子量3 3 k d a 及不需要任何辅因子。 1 2 2 2 1 几丁质酶分类及特性 5 两南大学硕十学付论文 微生物几丁质酶有胞内和胞外两种。其中大部分微生物能产生胞外几丁质酶， 也是目前研究和应用较多的几丁质酶。微生物几丁质酶与其它来源的几丁质酶一 样，也可分为外切几丁质酶( e x o c l u t i n a s e ) 和内切几丁质酶( e n d o c h i t i n a s e ) 。内切几丁 质酶，可在几丁质链的任一部位进行随机切割，产生包括几丁二糖在内的几丁质 寡糖；外切几丁质酶，从几丁质链的非还原性末端依次切下几丁二糖( 李静等， 2 0 0 6 ) 。绝大多数微生物产生的几丁质酶是属于内切酶，若要将几丁质彻底水解 成为单体n 一乙酰氨基萄葡糖，还需要n 一乙酰氨基萄葡苷酶( 又称几丁二糖酶) 。目 前认为，昆虫病原真菌在降解昆虫体壁过程中分泌的几丁质酶主要有两类：几丁 酶( c h i t i n a s e ) 和n 乙酰葡萄糖氨酶( n a c e t y g l n c o s a m i n i d a s e ) 。 微生物几丁质酶最适p h 一般在3 1 l 之间。酶的等电点一般在p h 3 6 8 6 之间。酶 作用的最适温度多在5 0 6 0 ，温度过高，酶活力容易丧失。微生物几丁质酶的分 子量范围一般在1 9 k d 到1 1 0 k d 之间，不过也有大至1 3 4 7 5 9 k d 。微生物几丁质酶对 底物具有一定的专一性，一般都可水解粉状几丁质，胶状几丁质，可溶性几丁质 衍生物如乙二醇几丁质和二乙醇几丁质及可溶性的几丁三糖，四糖，戊糖和六糖 等几丁质寡糖。不能水解麦芽糖，淀粉和纤维素等由几丁二糖经糖苷键连接而成 的糖类( 李君等，2 0 0 0 。 现己从昆虫病原真菌中克隆了多个几丁质酶基因，如：在金龟子绿僵菌中克 隆了5 个几丁质酶基因，为c h i t 4 2 、c h l l l 、c h l 2 、c h l 3 和c h i a 。f a n g 等( 2 0 0 5 ) 从球孢白僵菌中克隆了b b c h i t i 基因。此基因包括了1 , 0 4 7 b p 的开放阅读框( o r f ) ， 编码3 4 8 个氨基酸几丁质酶前体，n 端2 8 个氨基酸残基为信号肽，无内含子，在球 孢白僵菌中为单拷贝。几丁质酶b b c h i t l 属于糖基水解酶家族1 8 ，分子量为3 3 k d ， 等电点为5 4 ，与金龟子绿僵菌几丁质酶基因c h l 4 2 、c h l 2 、c h i l l 和黄绿绿僵菌几 丁质酶基因c h l l 的相似性分别为2 0 、2 1 、2 3 和2 5 。而b b c h i t 2 基因含有3 个内含 子，开放阅读框长为l 2 7 2 b p ，编码一含4 2 3 个氨基酸几丁酶前体，与b b c h i t l - - 样， 含有真菌几丁酶保守区域s x g g 和d g i d x d x e 。但b b c h i t 2 推导氨基酸与鼬曲谢的 同源性只有2 0 左右，与白扁丝霉( a a l d u m ) 几丁酶基因c h l l 、瑞氏木霉 ( t r i c h o d e r m av 加 妇) 内切几丁酶基因v i r i 、葡萄穗霉菌( s t a c h y b o t r y se l e g a n s ) 几丁 酶基因、黄绿绿僵菌几丁酶基因c h l l 和金龟子绿僵菌几丁质酶基因a 了7 2 的相似 性却分别为7 2 、6 3 、6 1 、6 1 和5 8 ( f a n ge t a l ，2 0 0 5 ；方卫国，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 2 2 几丁质酶对昆虫病原真菌毒力的影响 s c r e e n 等( 2 0 0 1 ) 将来自金龟子绿僵菌的几丁质酶基因( 函打，) 构建在构巢 曲霉的g p d r d 动子之下，然后转入金龟子绿僵菌。转化子在诱导和非诱导的条件下 均产生了大量几丁质酶，但是毒力却没有提高。而f a n g 等( 2 0 0 5 ) 将肋拍f r 辟章入 6 第一章文献综述 球孢白僵菌后的毒力分析却表明，超量表达几丁质酶b b c h i t l 可以提高球孢白僵菌 对桃蚜的毒力。在孢子浓度为l x l 07 、5 x 1 0 7 个m l 时，几丁酶b b c h i t l 基因重组菌株 l - 4 及1 - 8 的致死中时l t s o ( 1 e t h a l m i d d l e t i m e ) 分别比野生型菌株缩短了1 9 8 、1 7 5 及1 4 6 、2 1 2 ；在8 4 h r 和9 6 h r 时，它们的致死中浓度l c 5 0 ( 1 e t h a lm i d d l e c o n c e n t r a t i o n ) 更是显著低于野生型菌株。可能因为研究者的菌株和几丁质酶的基 因不同，所以导致了不同的研究结果。 1 2 2 2 3 几丁质酶在其它方面的应用 近年来，随着人们对几丁质酶研究的深入，几丁质酶的用途受到越来越广泛 的关注。几丁酶在其它方面的应用主要表现在下列几个方面： ( 1 ) 高等植物本身不含作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但几丁质酶却广 泛存在于高等植物中，包括单子叶植物和双子叶植物。几丁质酶分布于植物的茎、 叶、种子及愈伤组织中。当植物受到真菌，细菌、病毒感染时，几丁质酶活性迅 速提高( 梁美霞等，2 0 0 4 ) 。研究表明将几丁质酶基因转入植物中，能提高植物 的对病虫害的抗性。如：戴富明等( 2 0 0 5 ) 用农杆菌介导木霉几丁质霉基因转化 拟南芥，转基因植株及t l 代对油菜核病菌的抗性显著提高。将番茄几丁质酶基因 转入西瓜中，转基因植株对尖孢镰刀菌西瓜专化型的抗病性均有一定程度的增加 ( 张志忠等，2 0 0 5 ) 。 ( 2 ) 对真菌病害的防治。几丁质酶能抑制真菌的生长。如：郑秀丽等( 2 0 0 6 ) 从土壤中分离到1 3 2 株细菌和链霉菌。用平板透明圈法筛选到3 2 株产几丁质酶菌 株。其中一株链霉菌经测定对稻瘟茵、水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌i 小麦赤霉 病菌等多种病原真菌具明显抑制作用，该菌经形态学及生理生化特性鉴定。初步 定为球孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg l o b i s p o r u s ) ，是一种新的几丁质酶产生菌。转绿色 木霉内切几丁质酶基因e b b i 的球毛壳菌c g l 2 转化子对a a l t e r n a t a 、p d i o s p y r i 、 s r o l f s i i 、p u m m u m 的抑菌效率发生了明显的变化，其中转化子c g l 2 1 4 和c g l 2 2 5 对a a l t e r n a t a 的抑菌效率、c g l 2 1 8 和c g l 2 2 1p d i o s p y r i 的抑菌效率、c g l 2 1 4 对 s r o l f s i i 的抑菌效率及c g l 2 2 1 对p u l t i m u m 的抑菌效率明显增强( 卢建平等， 2 0 0 6 ) 。 ( 3 ) 在食品行业的应用。我国海岸线长，富含几丁质的渔业废弃物如虾壳等 大量资源得不到充分利用。传统工艺用酸水解虾壳等生产几丁寡糖，成本昂贵且 对容器腐蚀大，因此难以推广。而用几丁质酶水解法，成本低，得到的几丁寡糖、 几丁二糖或n 乙酰葡萄糖胺在食品及药物方面有广泛的用途。几丁质经酶作用后 所产生的n 一乙酰几丁寡糖和壳聚几丁寡糖都具有清爽的甜味，吸湿性和保湿性好， 其在水中溶解度比单糖低，有助于调整食品的水活性，增进保水性，兼具调味和 7 两南大学硕十学付论文 改良食品质构的功能。还可以作为生长促进因子( 李静等，2 0 0 6 ) 。 ( 4 ) 几丁质酶可以分解许多含几丁质的生物的细胞壁。可用于产生真菌原生 质体。几丁质酶对有壳水生动物废物具有生物转换作用，因而在工业上可以应用 几丁质酶来进行几丁质废料的处理，进而在环境保护中发挥重要作用( 李君等， 2 0 0 1 ) 。 1 2 2 2 4 几丁质酶的三维结构 根据氨基酸序列的同源性，糖苷水解酶被分成5 8 个家族( h e n r i s s a te ta l ， 1 9 9 6 ) 。依据此分类方法几丁质酶属于家族1 8 和家族1 9 。大多数细菌、真菌、线 虫和昆虫的几丁质酶属于家族1 8 。植物几丁质酶根据特异性可以分成i 、i i 、i 、 和v 类。其中i 、i i 、类属于家族1 9 ，和v 类属于家族1 8 。 图1 2 几丁质酶的三维结构图。a 牯质沙雷氏菌几丁质酶a 的三维结构图；b ，大麦种子几丁质酶的三维结 构图。红色示d 螺旋，黄色求b 折叠( 摘f u k a m i z o ，2 0 0 0 ) f i g 1 2t h r e ed i m e n s i o