（预防兽医学专业论文）鸡源蛭弧菌的分离、生物学特性研究及对鸡白痢的治疗试验.pdf

摘要 无菌采取3 0 只健康鸡的盲肠、直肠内容物，以大肠杆菌0 8 为宿主。从这些样品 中分离到一株能裂解其它细菌的细菌。经形态学和生化鉴定，判断该菌为蛭弧菌。将 此菌命名为b d s a l 2 。以模式菌株1 0 9 j 为参考，研究鸡源蛭弧菌b d s a l 2 生物学特性 发现：鸡源蛭弧菌b d s a l 2 和模式菌株1 0 9 j 在不同p h 值的酸液中处理2 h 后，活菌 数随着p h 值的下降而极显著下降，可耐受的最低p h 值分别为3 0 和4 0 ；在含 0 1 0 - 4 ) 6 0 的胆盐培养基上培养，蛭弧茵的活菌数随着胆盐浓度的升高而极显著下 降，最高可耐受的胆盐浓度为0 4 0 和0 3 0 。在不同温度下培养，2 8 3 9 时b d s a l 2 的活菌数可达到1 0 5 p f u m l ，然后随着温度的升高而下降，4 2 不能生长；1 0 9 j 的活 菌数在2 8 最高，3 8 以上不能生长。抗生索敏感性试验表明，4 8 h 内1 0 9 j 对全部 所试抗生素敏感；除羧苄青霉素外，b d s a l 2 对全部所试抗生素均敏感。以不同细菌 为宿主，测定两株菌的寄主谱，b d s a l 2 和1 0 9 j 能裂解全部革兰氏阴性细菌和少数革 兰氏阳性细菌。对加热致死的大肠杆菌0 8 、0 1 4 9 、o m 、a t c c 6 5 9 2 2 、鸡白痢沙门氏 菌c 7 9 1 3 和鼠伤寒沙门氏菌都能裂解，以较快的速度形成噬菌斑。 用浓度为1 0 5 p f u m l 的b d s a l 2 菌液灌服昆明系小鼠，进行安全性试验。试验组 和对照组小鼠均健活，证明该菌对小鼠安全无毒。用b d s a l 2 和1 0 9 j 治疗人工感染 鼠伤寒沙门氏菌小鼠，存活率分别为9 0 和7 0 。b d s a l 2 的治疗效果优于1 0 9 j 。 b d s a l 2 组小鼠粪便中蛭弧菌的数量随着经口灌服次数的增加而增加，最高可达 1 0 4 p f u g , 治疗结束后，蛭弧菌的数量逐渐下降至1 0 2 p f u g 。 用浓度为1 0 “c f u m l 的鸡白痢沙门氏菌连续4 d 灌服2 日龄雏鸡，进行攻毒。用 浓度为1 0 5 p f u m l 和1 0 3 p f u m l 的b d s a l 2 菌液及6 0 m g m l 的新霉素分别灌服治疗发 病鸡，同时设攻毒不治疗组和健康对照组。各组鸡的死亡率分别为5 0 、6 0 、4 0 、 8 0 和0 。b d s a l 2 在治疗鸡白痢中起到一定作用。采取各组鸡的心脏、肝脏、脾脏、 胆囊，检测鸡白痢沙门氏菌易位情况。结果发现1 0 5 p f u m l b d s a l 2 组、抗生素组和 健康对照组均无细菌易位，1 0 3 p f u m l 组有l 例细菌易位，攻毒不治疗组全部都发生 细菌易位。检测肠道菌群变化时发现，与健康对照组相比，抗生素组大肠杆菌和乳酸 杆菌数都有极显著下降；1 0 5 p f u m l b d s a l 2 治疗组大肠杆菌数极显著下降，乳酸杆菌 数无明显变化：1 0 3 p f u m l b d s a l 2 组大肠杆菌数无明显变化，乳酸杆菌数显著下降。 从治疗鸡白痢的结果可以看出鸡源蛭弧菌b d s a l 2 对该病具有较好的治疗效 果。 关键词：蛭弧菌鸡分离生物学特性鸡白痢 i s o l a t i o n ，b i o n o m i e so f b d e l l o v i b r i of r o mb r o i l e ra n di t s t h e r a p e u t i ct e s tt op u l l o m md i s e a s e l in a n ( p r e v e n t i v ev e e t e r i n a t ym e d i c i n e ) d i r e c t e db yn ix u e - q i n a b s t r a c t ：t h ec o n t e n t so fe a e e u n la n dr e c t u n lo f3 0h e a l t h yb r o i l e r sw e r ec o l l e c t e db y a s e p t i cm e t h o d o n ek i n do fb a c t e r i u mw h i c hc o u l dp r e yo no t h e rb a c t e r i aw a si s o l a t e d u s i n gec o l io sa sh o s t i tw a sj u d g e da sb d e l l o v i b r i ob yi t sm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n db i o n o m i c sa n dw a sn a m e da sb d s a l 2 s t a n d a r ds t r a i n1 0 9 jw a su s e di nt h ef o l l o w i n g r e s e a r c h b d s a l 2a n d1 0 9 jw e r et r e a t e dw i t hd i f f e r e n tp ha c i dl i q u o rf o r2h o u r s b o t ht h e n u m b e ro fs u r v i v a lb d s a l 2a n d1 0 9 jd e c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l yw h e np hd e c r e a s e d t h el o w e s tp ht h e yc o u l dt o l e r a t ew a s3 0a n d4 0r e s p e c t i v e l y b d s a l 2a n d1 0 9 jw e r e c u l t i v a t e dw i t hm e d i u m ( i n c l u d i n gb i l es a l tr a n g e di no 1 0 o 6 0 1 b o t ht h en u m b e ro f s u r v i v a lb d s a l 2a n d1 0 9 jd e c r e a s e dv e r ys i g n i f i c a n t l y 觞t h ec o n c e n t r a t i o no fb i l es a l t i n c r e a s e d t h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o no fb i l es a l tt h e yc o d dt o l e r a t ew e r e0 4 0 a n d0 3 0 r e s p e c t i v e l y w h e nb d s a t 2w a sc u l t i v a t e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ，t h es u r v i v a ln u m b e r w a s1 0 p f u m li f t e m p e r a t u r er a n g e df r o m2 8 2t o3 9 c a n dd e c r e a s e da st h et e m p e r a t u r e i n c r e a s e db e y o n d3 9 0 t h en u m b e ro f1 0 9 jw a s1 0 5 p f u m lw h e nt h ec u l t i v a t i n g t e m p e r a t u r ew a s2 8 ( 2 t h eh i g h e s tt e m p e r a t u r eb d s a l 2a n d1 0 9 jc o u l dt o l e r a t ew a s 4 2 c a n d3 8 cr e s p e c t i v e l y t h er e s u l to f a n t i b i o t i cs u s c e p t i b i l i t yt e s ts h o w e dt h a t1 0 9 jw a s s e n s i t i v et oa l lt h et e s t e da n t i b i o t i c sa n db d s a l 2w 豁s e n s i t i v et oa l lt h eo t h e rt e s t e d a n t i b i o t i c se x c e p tc a r b o x y b e n z y p e n i c i l l i nd u r i n g4 8h o u r s u s i n gd i f f e r e n tb a c t e r i aa s h o s t s ，b o t hb d s a l 2a n d1 0 9 jc o u l dp r e yo na l lt h eg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i aa n dam i n o r i t y o fg r a m p o s i t i v eb a c t e r i a t h e ya l s oc o u l dp r e yo nt h eh e a t e db a c t e r i as u c ha sec o l io b e c o l i0 1 4 9 ，e c o l io m ，e c o l ia t c c6 5 9 2 2 s p u l l o r u mc 7 9 - 13a n ds t y p h i m u r i u m b d e l l o v i b r i of o r m e dp l a q u e sq u l c l 【l y t h es a f et e s tw a sc a r d e do u t t h r o u g hd r e n c h i n gk u n m i n gm i c ew i t h1 0 5 p f i g m l b d s a l 2 a l lt h em i c eo ft e s tg r o u pa n dc o n t r o lg r o u pw e r eh e a l t h y n i i sr e s u l ts h o w e d b d s a l 2w a ss a f et om i c e t h em i c ea r t i f i c i a li n f e c t e dw i t hs t y p h i m u r i u mw e r ec u r e db y b d s a l 2 ，a n dt h es u r v i v a lr a t ew a s9 0 t h en u m b e ro f b d e l l o v i b r i oi nt h em i c e sd q e c m i n c r e a s e d 鼬t h ed r e n c h i n gt i m e si n c r e a s e d t h em a x i m u mw a s1 0 4 p f u g a r e rt h ec o u r s e o f t r e a t m e n t ，t h en u m b e rd e c r e a s e dt ol o o p f t d gg r a d u a l l y t h eb r o i l e r so f2 - d a y o l dw e r ea r f i f i d a li n f e c t e dw i t h1 0 “c f u m lsp u l l o r u mb y d r e n c h i n gf o r4d a y sc o n s e c u t i v e l ya n da l m o s ta l l t h eb r o i l e rc a u g h ts e a k t h eb r o i l e r s 、v e r ct r e a t e dt h r o u g h d r e n c h i n gw i t h1 0 5 p f - u m lb d s a l 2 ，1 0 3 p f u m lb d s a l 2 ，a n d 6 0 m g m ln e o m y c i n a tt h es a l l l et i m e ，ai n f e c t e da n dn o n - c u r eg r o u pa n da h e a l t hg r o u p w e r es e t t l e d t h ed e a t hr a m sw e r e5 0 ，6 0 ，4 0 ，8 0 a n d0r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s h o w e dt h a tb d s a l 2p l a y e da l li m p o r t a n tr o l ei nt h et r e a t m e n tt op u l l o r u mt os o m ee x t e n t t h es h i f to fsp u l l o r u mw e r ed e t e c t e db yi s o l a t i n gt h eb a c t e r i u mf r o mb r o i l e r s sh e a r t ， l i v e r , s p l e e na n dc h o l e c y s t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t1 0 p f u m l b d s a l 2g r o u p ，n e o m y c i n g r o u pa n d t h eh e a l t hg r o u ph a dn 0s h i f to fs p u l l o r u m ，o n eb r o i l e ri n10 3 p f u m lb d s a l 2 g r o u ph a ds p u l l o r u m ss h i f t a l lb r o i l e r so fi n f e c t e da n dn o n c u t eg r o u ph a ds p u l l o r u m s s h i f t c o m p a r e dw i t ht h em i c r o b i a lp o p u l a t i o no fi n t e s t i n a lt r a c to fh e a l t hg r o u p ，t h e n u m b e r so f b o t hec o l ia n dl a c t o b a c i l l u so fn e o m y c i ng r o u pw e r es h a r p l yd e c r e a s e d ，t h e n u m b e ro fec o l io f1 0 p f u m l b d s a l 2g r o u pw a ss h a r p l yd e c r e a s e da n dt h en u m b e ro f l a c t o b a c i l l u sh a d n tc o n s p i c u o u sc h a n g e s , t h en u m b e ro f e c o l io f10 3 p f u m l b d s a l 2g r o u p t m d n tc o n s p i c u o u sc h a n g e sa n dt h en u m b e ro fl a c t o b a c i l l u ss h a r p t yd e c r e a s e d f r o mt h er e s u l to f t h et r e a t m e n tf o rp u l l o r u r n ，i ti sc o n c l u d e dt h mb d s a l 2i se f f c 。c t i v e t oc u t et h i sd i s e a s ea n di tm i g h th a v ew i d e l y u s e dp m s p e c t i v e k e yw o r d s ：b d e l l o v i b r i o b r o i l e r si s o l a t eb i o n o m i e sp u l l o r u md i s e a s e 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 t 构的学位或证书所使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 名柿 庐哲年彳月；一日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名 导师签名 鹰怖 饼勘 年月日 冲r 年6 只；db 1 刖置 1 1 蛭弧菌研究概况 蛭弧菌( b d e l l o v i b r i o ) 是s t o l p 和p e t o l d 于1 9 6 2 年从壤中分离噬菌体时首次 发现的。它是一类攻击、侵染、裂解其它细菌的寄生菌，有类似噬菌体的作用。蛭弧 菌的菌体较小。弧状或杆状，革兰氏阴性，端生单根鞭毛。b d e l l o v i b r t o 一词来源与 拉丁语，b d e l l a 意思为“类似水蛭”的意思，v i b r i o 意思为“弧状”。关于蛭弧菌的定 义在很大程度上是根据其生活方式，即利用其它细菌作为唯一营养来源，因而蛭弧菌 被叫作“寄生者”或“捕食者”。 4 0 年以来，许多国家的科研人员都对这类菌进行了研究。在我国，司稚东等在1 9 6 6 年首先对蛭弧菌做了研究，之后其他研究人员也相继对这类菌的生物学特性和实际应 用进行了探索。 1 1 1 蛭弧菌的分类地位 该菌从首次发现至今，其分类学位置已经历多次变动。最初，伯杰细菌鉴定手 册( 第八版) 将其列为蛭弧菌属，科未定【1 】。后在伯杰氏系统细菌学手册( 第二 版) 【2 】中，将其列为脱硫弧菌目，蛭弧菌科，蛭弧菌属。该属已描述的有3 个种： 噬菌蛭弧菌( b d e l l o v i b r i ob a c t e r i o v o r u s ) 、斯托普蛭弧菌( b d e l l o v i b r i os t o 加打) 、斯塔 尔蛭孤菌( b d e l l o v i b r i os t a r r i i ) ；另有两群未命名。一群是产包囊的菌株w ( b d e l l o v i b r i o s p ) 及相关菌株，另一群是来自海洋的菌株。最近，1 6 s r r n a 大分子同源性在细菌的 系统发育学研究中的广泛应用，人们将蛭弧菌归为“蛋白细菌( p r o t e o b a c t e r i a ) ”中 的6 科3 1 。b a e l m l 等1 4 选取三个代表菌株b d e l l o v i b r i ob a c t e r i o v o r 淞l o o t 、b d e l l o v i b r i o s t o l p i iu k i 2 和b d e l l o v i b r i os t a r r i ia 3 1 2 ，对它们的系统发育学关系进行研究后，发现 b d e ，f d v i b r i os t o l p i iu k i 2 和b d e l l o v 坫r h 7s t a r r i ia 3 1 2 有9 0 0 的相似性，这两株菌与 b d e l l o v i b r i ob a c t e r i o v o r u sl o o t 的相似性分别为8 1 7 和8 1 2 。由此证明b d e l l o v i b r i o b a c t e r i o v o r u sl o o t 和其它两株菌亲缘关系较远。d n a 杂交实验也证明，三株菌之间 只有 4 杂交。因此，他们建议将b d e l l o v i b r i os t o l p i i 和b d e l l o v i b r i os t a r r i i 划分到一 个新的属即b a c t e r o v o r a x 属。最近又有报道【5 1 ，原来的蛭弧菌属被分为两个属： b d e l l o v i b r i o 和b a c t e r o v o r a x 。通过对原来划分到蛭弧菌属下面三个种的1 6 s r d n a 的 序列进行测定，并对已有蛭弧菌的1 6 s r r n a 进行系统发育分析。比较b d e l l o v i b r i o b a c t e r i o v o r u s 、b a c t e r i o v o r a xs t o l p i i 、b a c t c r i o v o r a 饼s t a r r i i 的1 6 s r r n a 二级结构后发 现，在两个区域上有显著差异。目前，在蛭弧菌分类方面，一种利用1 6 s r r n a 的特 征序列和来源于基因位点触 与b b a c t e r i o v o r u s 的h - i 表型相关) 的杂交探针已经应 用到对于该细菌的鉴定中。该法比其它的方法能更快速、更准确地检测和鉴定出不同 的属、平中甚至亚种。对矗n 位点序列比较揭示出h i ( 宿主不依赖型) 和h d ( 宿主 依赖型) 表型中只有很少的碱基对发生改变。在分离细菌时，使用m t 探针的核酸分 型和杂交实验能够用来反映菌株的特t 6 j 。 1 1 2 蛭弧菌的生活史 根据蛭弧菌寄生的生活周期，可将其生活史主要分为：定位阶段、穿入阶段、细 胞内繁殖阶段和成熟后释放阶段。处于细胞外的蛭弧菌，在相差显微镜下观察，表现 为跳跃式积极寻找宿主的状态；处于细胞内阶段的蛭弧菌通过改造宿主细胞壁结构， 以宿主细胞为营养来源进行生长发育；最后，成熟的子代蛭弧菌从宿主细胞中释放出 来。另外，在一种未定名的蛭弧菌株w 的生活周期中，游离阶段和繁殖阶段之间， 还有一个以形成包囊为特征的休眠阶段【7 l 。由于包囊的形成也是在宿主细胞内进行， 在此也将包囊期列入蛭弧菌的细胞内发育期。宿主依赖型蛭弧菌的全部生长过程如 下： 一、定位阶段：蛭弧菌寻找宿主的方式一直是研究的热点。目前认为，蛭弧菌主 要是依靠趋化性和随机碰撞来定位宿主。研究表明，蛭弧菌对多种物质都表现出趋向 性。蛭弧菌是需氧菌，对氧表现出较强的趋向性。1 。s c s t r a l e y 等研究发现，蛭弧菌 对o 5 的酵母提取物也表现出了趋向性。1 。并且，当酵母提取物的浓度在0 珈5 之 间时，蛭弧菌的趋化性随着该物质浓度的增加而逐渐增强。乙酸盐、丙酸盐、硫代醋 酸盐等化学物质对蛭弧菌也有吸引作用。a g l a m a r r e 等报道，蛭弧菌对多种氨基酸 如l 一天冬酰胺、l 一半胱氨酸、l 一谷氨酰胺、甘氨酸、l 一组氨酸、l 一赖氨酸、l 一苏氨 酸等都表现出了趋向性“”。c l a m b e r t 的试验发现，如果使蛭弧菌的m e p 2 基因( 编码 甲基接受趋化蛋白的基因) 失活，结果导致蛭弧菌形成噬斑的能力明显下降【”1 。这说 明甲基依赖趋化系统在引导蛭弧菌定位宿主的过程中起着很重要的作用，并且更加有 力地证明趋化性是蛭弧菌定位宿主的过程中不可缺少的方式之一。s , c s t r a l e y 等还发 现，非宿主菌比宿主菌大o 5 倍时，在两种菌浓度基本相同的情况下( 1 0 8 个m e ) ， 蛭弧菌对非宿主菌的碰撞频率更高。这说明随机的运动对蛭弧菌寻找宿主也有一定的 作用 t 2 e 二、穿入阶段：开始侵染时，蛭弧菌迅速运动，与寄主细胞激烈相撞，以没有 鞭毛的一端吸附在寄主细胞壁上。菌体以超过1 0 0 r s 速率转动，同时释放一系列的酶 使宿主细胞璧变薄。被侵染的宿主菌外表结构改变，导致宿主原生质体和细胞壁特异 膨胀，然后，在蛭弧菌进入的位点彼此分离。而蛭弧菌仍然紧紧地固定在宿主原生质 2 体上。结果，蛭弧菌被动地从宿主细胞壁的微孔( 附着位点) 穿过细胞壁。以进入膨 胀的宿主周质而结束。电镜显示，蛭弧菌侵染宿主时，在宿主细胞壁上形成一个微孔 之后，分化了的穿入端与宿主原生质体相连【】。这种紧密结合一直持续到穿入过程的 结束，但整个过程是短暂的。相差显微镜下，也能明显看到这种结合。因此。蛭弧菌 不能够进入质壁分离的宿主菌，或者膜壁关系被低膨胀压所影响的细胞。 在侵染过程中，如果蛭弧菌释放出聚糖酶，就会导致所侵染的宿主细胞形态发生 变化。以大肠杆菌为宿主，电镜下观察，在未遭到蛭弧菌侵染时，大肠杆菌的形态正 常，具有不光滑的外表结构：在蛭弧菌侵入过程中，大肠杆菌表现出明显的膨胀，并 且其边界也变得不规则；蛭弧菌完全侵入后，大肠杆菌的外表变得光滑【l4 】。而当蛭弧 菌侵染热致死的宿主菌或者蛭弧菌株w 侵染任何一种宿主菌时，由于没有聚糖酶的 活动，也没有出现宿主菌的变圆。 三、细胞内繁殖阶段：蛭弧菌穿入宿主细胞后，通常宿主细胞的结构发生相应的 改变，这种改变使蛭弧菌能更好地在宿主中生长发育。蛭弧菌小体是蛭弧菌侵入宿主 后，在其中生长繁殖的宿主细胞结构；主要分为四层：蛭弧菌小体壁、宿主细胞组成 的膜状结构、蛭弧菌细胞壁以及细胞膜。蛭弧菌穿入6 0 分钟之后，蛭弧菌小体的体 积增至最大，超过原来宿主细胞的体积。宿主细胞肽聚糖中多数的葡萄糖胺和胞壁酸 发生去乙酰化作用，b r a u n 脂蛋白和o m p a 蛋白逐步丢失【”一6 1 。同时，又有6 0 的 椽榈酸和2 0 的油酸通过羧酯键连接手宿主的肽聚糖上，使蛭弧菌小体获得较强的抵 抗渗透压的能力。 蛭弧菌在蛭弧菌小体里发育时，形态上发生改变。蛭弧菌首先脱去原来的鞭毛， 然后延长呈丝状：丝状的蛭弧菌在蛭弧菌小体中继续发育至成熟。蛭弧菌在这一阶段 主要是从宿主摄取营养成分来合成自身的核酸、脂肪酸、外膜蛋白等大部分物质 1 7 1 9 。宿主细胞被降解的核酸和核糖体是蛭弧菌合成和代谢的前体物质单核苷 酸和脱氧单核苷酸的来源。蛭弧菌以不经改变的、磷酸化的形式摄取单核苷酸，使其 以较低的能量来获得宿主细胞的成分。处于该阶段的蛭弧菌有很强的适应能力，r u b y 发现将蛭弧菌小体置于e d t a 中，然后用溶菌酶处理，处于周质问生长的各种阶段的 蛭弧菌被释放出来。此时的蛭弧菌停止了正在进行的d n a 的合成，并分化为侵袭形 式的细胞。这一过程靠消耗细胞自身的储存物质而进行。 b d e l l o v r b r i os p w 的生活史中，还有一个被称为蛭弧菌包囊的阶段，是蛭弧菌的 一个体眠阶段蛭弧菌由于其高的内源呼吸率和储存物质的缺乏。所以较其它大多数 细菌，对饥饿更加敏感。当宿主菌量下降，或者外界环境的营养水平降低而不利于宿 主菌生存时，个别菌株，如b d e l l o v i b r i os p w 侵入宿主细胞后，一般有2 8 会在其 周质间形成一种休眠结构臣弧菌包囊。蛭弧菌包囊比生长期的细胞含有更多的 d n a 、r n a 、蛋白质和糖类。包囊在没有宿主的状态下培养时，仍能够继续存活。 而生长期的蛭弧菌则迅速失去存活能力。并且，蛭弧菌包囊比生长期的蛭弧菌对升温、 声波的处理和干燥的条件具有更强的耐受性。蛭弧菌包囊被宿主细胞壁包裹，除了无 定形的外层之外，没有如孢衣一类的不可渗透的屏障，仍具有渗透能力。这一点和其 它细菌的休眠状态不同。 蛭弧菌w 进入宿主菌的周质间以后，宿主细胞形态没有发生明显改变。在包囊 形成的早期，细胞内有包涵体物质出现，这种物质在正常生长期的蛭弧菌里却不存在 2 0 l 。侵入后3 - - 4 h ，形成包囊的原生质体的直径增加。随着蛭弧菌包囊的形成，蛭弧 菌的细胞壁开始增厚，直到5 h 的时候。厚度达到最大。这个过程中，蛭弧菌包囊呈 肾形，凹面的细胞壁以及相连的原生质膜发生凹陷。在包囊形成的后期，已经形成包 囊的蛭弧菌和宿主细胞壁紧密地结合在一起，即使用声波处理也难将其分开。电镜下 观察，在此阶段原生质的电子密度开始增加，核区也比生长期蛭弧菌的更加致密，包 囊的内壁和周质膜内陷。 蛭弧菌包囊在适当的条件下开始萌发。电镜下观察，萌发开始以后，前1 5 3 0 分钟内蛭弧菌包囊在形态上发生很大的变化【2 ”。包囊的外层开始扩展，呈纤维状：包 涵体的形状变锝不规则，对重金属染料的亲热力也逐步增加。随着缨胞壁凹陷的消失。 萌发的细胞也略微增大。而在这个阶段，细胞质区域的电子依然密集，核区仍为致密 的状态。4 5 - 6 0 分钟之后，蛭弧菌包囊的外层进一步破裂，结构变得更加松散，并且 呈更明显的纤维状。宿主细胞壁开始与萌发的细胞分离。核区域扩大。占据细胞的较 大部分。原生质体变得高度不规则，呈多叶状外观。随着细胞的生长，外层均匀地破 裂。相差显微镜下观察，萌发的包囊延长成s 形。当外层溶解之后，萌发的蛭弧菌从 宿主细胞中出来，成为一个活跃的菌体。 四、成熟蛭弧菌的释放：蛭弧菌在宿主细胞内发育到一定的阶段以后，合成细胞 壁和鞭毛，然后，均匀分裂为子代个体；在酶的作用下，蛭弧菌小体壁裂解，子代蛭 弧菌从中游离出来，又开始下一轮的侵袭。 1 1 3 宿主依赖型蛭弧菌生长有关的因素 1 1 3 1 宿主菌因素 具有s 层( s - 1 a y e r ) 的细菌能免遭噬菌蛭弧菌的侵染。s 层又称为表面层，是单 分子呈晶体排列的蛋白质亚基，为细胞表面结构的一部分。当细菌发生变异，缺乏s 4 层或者菌体没有被s 层完全覆盖时，就会被蛭弧菌裂解。s e k o v a l 等的实验表明， 当a q u a s p i r i l l u m 卯功e 凇v h a 完全披其s 层覆盖时，能够抵抗蛭弧菌的侵染；当该菌 的s 层缺失时，则逐渐被蛭弧菌裂解从其它细菌上也得出相似的结果【捌。s 层是自 然界中许多细菌表面稳定的成分，在细胞生长过程中能利用较低的自由能自我组装成 完整的超分子结构。s 层的这种特性可能导致蛭弧菌不能在所有的细菌中寄生，从而 不会将宿主彻底清除。 宿主菌的荚膜层不影响蛭弧菌的吸附和穿入。荚膜是细胞分泌的一种由多糖和 ( 或) 蛋白质组成的胶状基质，包围着整个细胞并封闭了细胞壁。荚膜的存在能够使 某些病原菌提高抵御吞噬作用和致病能力。电镜下观察，虽然蛭弧菌对于有荚膜的宿 主的侵入过程不是很快，但是对有荚膜和没有荚膜的宿主菌的总体的清除时间没有明 显的区别【2 3 1 。蛭弧菌通过鞭毛运动主动进入荚膜，整个过程没有酶的参与，也没有导 致相邻荚膜基质的解体，进入后，宿主菌仍然保有荚膜。 蛭弧菌不能侵染已经被其它蛭弧菌侵入的宿主菌。在蛭弧菌穿入宿主细胞壁的过 程中，宿主细胞的肽聚糖有6 0 - - , 7 0 0 o 的葡萄糖胺及胞壁酸发生去乙酰化作用。从而使 蛭孤菌在侵入宿主菌后，宿主的细胞壁由对溶菌酶敏感变为不敏感，保护其不再被继 续破坏。蛭弧菌株w 进入宿主菌后，虽然对溶菌酶敏感，但其它的蛭弧菌也不能再 侵染该宿主菌。即有蛭弧菌寄生的宿主菌内不能出现重复寄生现象 h l 。 自然环境中，许多革兰氏阴性细菌，在蛭弧菌的侵染压力下，表型发生变化，能 够抵抗蛭弧菌侵染。s h e m e s h 等通过比较与蛭弧蔼接触之前的宿主菌和与蛭弧菌接触 之后存活下来的宿主菌，发现这些细菌提高了抵抗侵染的能力【2 4 1 。许多革兰氏阴性细 菌都具有这种抗性。此外，这种抗性作用并不针对其接触过的蛭弧菌以及其类似微生 物( b l o ) 菌株。该抗性不是突变的结果，而是一种与表型改变有关的可塑性的反应。 当消除寄生菌后，这种现象也随之消失。由于这种抗性作用不是绝对的，在这种机制 下，蛭弧菌和其宿主都不能无限生长繁殖。 1 1 3 2 非宿主菌因素 虽然蛭弧菌的宿主范围广泛，但只占微生物种类中的一部分。蛭弧菌定位宿主时， 非宿主菌也是一个不可忽略的因素。非宿主菌浓度较高时( 1 0 7 1 0 9 个m l ) ，蛭弧菌 对于非宿主菌偶尔也能进行短暂的吸附。尽管不象对宿主菌那样有剧烈的撞击，但是 蛭弧菌还是会围绕非宿主菌运动一定的时间。据此，m i c h a e l 提出一种诱导机制假说： 非宿主细菌对蛭弧菌的侵染有竞争性的障碍作用，这种作用能够阻碍蛭弧菌在多样性 的生态系统中将病原菌彻底清除【2 5 1 。 1 1 3 3 环境因素 蛭弧菌和其它微生物一样对环境中的许多因素都很敏感。这些因素有的会对蛭弧 菌产生致死性效果，有的会导致蛭弧菌由宿主依赖型变为非宿主依赖型。 近紫外光线( 3 2 5 4 0 0 n m ) 对蛭弧菌的生长有不利的影响，这种影响会因为外 源光敏剂的存在而被扩大。d f r i e d b e r g 发现，有外源光敏剂存在时，如果在光和氧同 时具备的条件下培养宿主依赖型蛭弧菌，会导致形成的噬斑数量下降1 0 3 ：而如果在 氮气中光照培养或者在有氧条件下于黑暗处培养，则对蛭弧菌都没有影响【2 们。另外， 没有外源光敏剂存在时，在高强度的可见光条件下培养，没有引起蛭弧菌噬斑形成能 力的下降；但近紫外区光线对蛭弧菌却能产生致死性作用。这说明蛭弧菌在吸收了 3 2 0 4 0 0 n m 的光线以后，某些细胞成分起了光敏剂的作用。 刚从蛭弧菌小体内释放出来的蛭弧菌对青霉素、先锋霉素i 、杆菌肽素、d 环丝 氨酸、氯霉素和叠氮钠等药物敏感 2 7 1 。尿素和酚存在的情况下也能导致蛭弧菌数量的 下降。因为蛭弧菌的肽聚糖以3 0 * d h 的速度高速更新，青霉素等抗生素会抑制肽聚糖 的合成，使刚刚释放出来的蛭弧菌由高速运动的杆状变成高速运动的球状，称为蛭弧 菌原生质球。但是，原生质球在稀释缓冲液中稳定，遇到渗透性休克也不破裂。有宿 主存在时，如果环境中有一定剂量的有毒化学药物，蛭弧菌能以蛭弧菌小体的形式降 低这些有害成分对自身的影响。m a r k e l o v a 研究发现，如果在蛭弧菌和宿主菌的混合 液中加入尿素和酚等有害化学物质，会发现蛭弧菌对宿主菌的侵染加快，同时，蛭弧 菌小体形成速度和数量也比对照组要高出许多口钔。 1 1 3 4 培养条件 在培养宿主依赖型蛭弧菌时，盐度、温度、酸碱度和二价阳离子浓度等条件都会 影响到蛭弧菌的正常生长。 o 9 的n a c i 和0 0 5 磷酸盐能够阻止一般的蛭弧菌株对宿主的吸附t 2 9 l 。对于蛭 弧菌中的海洋菌株来讲，数量与盐度的关系很大。盐度过低( 小于8 p p t ) 或者过高( 2 5 3 0 p p t ) 的海水蛭弧菌的含量小；当n a c i 浓度为9 1 8 p p t 时，蛭弧菌的数量才能达 到最高p 。 培养温度过高如热休克则会使蛭弧菌不能按正常的宿主依赖型生长。蛭弧菌每一 轮d n a 的合成都需要一个启动信号，该信号一般是在蛭弧菌穿入宿主细胞壁6 0 分 钟之后，由蛭弧菌所在宿主的周质环境提供。而r f g o r d o n 等实验结果表明，热休 克能够产生或刺激正常来源于宿主的生长信号，促进宿主依赖型的蛭弧菌在不含宿主 的人工培养基p p y e ( o 1 p r o t e o s ep e p t e o n e 和0 0 3 b a c t oy e a s te x t r a c tp h 7 03 m m 6 m g c l 2 和2 r a me a c h ) 上生长；并且每次热休克之后，都会促进新一轮的不依赖宿主 的生长【：，l j 。 此外，在营养成分已经耗尽的宿主菌肉汤中也存在导致蛭弧菌以非宿主依赖型生 长的因子。蛭弧菌在这种培养条件下会以1 - 2 0 p f u 1 0 9 p f u 的比例产生自发性的突变 d 2 1 。在培养宿主依赖型蛭弧菌时，需尽量减小这些因素的影响。 i 1 3 5 蛭弧菌自身因素 蛭弧菌在宿主细胞内生长时，靠降解宿主的大分子物质为单体来合成自身d n a 、 蛋白质等。如果个别宿主依赖型蛭弧菌株含有质粒，在缺乏宿主菌的条件下培养宿主 依赖型蛭弧菌时，质粒作为菌体生存非必需的d n a 大分子，可能是菌体繁殖所必需 的基因组d n a 合成的前体物质来源和蛭弧菌的营养来源，但是这种由质粒提供的营 养随着蛭弧菌在无宿主的情况下传代，而被很快耗尽。焦鹏等研究证明，当把含有质 粒的蛭弧菌单独培养时，随着细胞的传代，这些质粒逐渐丢失，蛭弧菌的生长也逐渐 停止：若将此时的蛭弧菌重新接入含有宿主菌的培养基上，蛭弧菌又可以活跃生长1 3 3 1 。 另外，对蛭弧菌基因组序列中m e 位点的诱变，会导致h i 表型( 非宿主依赖型) 的出现。有试验证明，每一个h i 突变株的由t 都在1 3 5 b p 的范围内，如果将野生型 噬菌蛭弧菌( 即宿主依赖型) 的h i t 基因与h - i 突变株基因组重组后，能够极大地加 强h i 型蛭弧菌的噬斑形成能力。进一步了解蛭弧菌的基因组序列，以及每一个片 段的功能，通过人工诱变的方法得到适合于生产应用的工程菌会使对于蛭弧菌的研究 更有价值。 1 1 3 6 噬菌体因素 尽管蛭弧茵能够裂解其它的细菌，作用与噬菌体类似，但是在自然界中也有蛭弧 菌的噬茵体。1 9 7 0 年h a s h i m o t o 等从活水中分离出兼性寄生的蛭弧菌的噬菌体，为 大小6 0 - 7 0 n m 之间的六角形，无尾( h d c 1 ) ，单链d n a 3 5 l 。以后陆续又从其它寄生 菌株中发现类似的噬菌现象。噬菌体在蛭弧菌中寄生时，如果形成溶源性细菌，则该 溶源性蛭弧菌在宿主菌体内寄生时。会产生宿主菌蛭弧菌- 噬菌体“三位一体”的现 象。某些情况下，溶源性细菌的噬菌体会自行消失，变为非溶源细菌；在某些情况下。 溶源性细菌会发生自发裂解、诱发裂解。从而导致蛭弧菌的死亡。该现象不利于在生 产实践中的应用。 蛭弧菌作为一种新发现的细菌，因其独特的生物学特性，在微生态研究领域已被 作为一种新型微生态制剂的菌种得到开发和应用，并取得明显效果。该菌从发现至今， 尽管在基础研究方面已经取得明显进展，但是到目前为止，其生物学特性仍然没有得 到全面了解，影响蛭弧菌生长的因素及其作用机制也未彻底探明，仍需作更深入、更 广泛的研究。 1 2 鸡白痢的防制现状 沙门氏菌病( s a l m o n c l l o s i s ) ，又名副伤寒( p a r a t y p h o i d ) ，是各种动物由沙门氏 菌属细菌引起的疾病总称，临诊上多表现为败血症和肠炎。本病发生于世界各地对 牲畜的繁殖和幼畜的健康带来严重威胁。许多血清型的沙门氏菌( 包括鼠伤寒沙门氏 菌) ，对多种宿主具有致病性，而且可使人感染和发生食物中毒。 鸡白痢沙门氏菌病( p u l l o r u md i s e a s e ) ( 简称鸡自痢) 是由鸡白痢沙门氏菌 ( s a l m o n e l l ap u l l o r u m ) 引起的各种年龄鸡常发的传染病此病不仅给养鸡业带来严 重危害，造成很大经济损失，而且鸡白痢沙门氏菌能够在家禽肠道内定植，在加工家 禽胴体时。污染鸡肉，继而进入人类食物链，成为人类沙门氏菌感染的潜在来源，一 些鸡病专家认为应将鸡白痢列在鸡病的首位，所以该病备受人们的关注。鸡白痢严重 影响雏鸡成活率，成年鸡多为慢性或隐性感染，一般不表现明显的i 临床症状，但严重 影响其生产性能。病菌可经种卵垂直传播，在种鸡场造成恶性循环以致难以消灭， 从而成为困扰养鸡业的一大难题。对于该病的控制目前我国各地主要通过使用抗菌药 物进行预防和治疗。磺胺药首先用于鸡白痢的预防和治疗，此后又有多种抗生索被采 用，它们对控制鸡白痢发挥了重要作用，但迄今尚未发现任何一种或几种药物的合并 使用能够使鸡白痢从群体中消灭【3 “。 使用抗菌药物治疗细菌性疾病，可能具有短期的经济价值，而仅仅依靠药物控制 是被动的，并不是防制鸡自痢的最好办法。近年来，鸡自痢沙门氏菌耐药状况的变化 趋势已引起了人们的关注，有许多关于该菌药敏试验结果的报告。潘志明等试验表明， 9 0 年代鸡白痢沙门氏菌耐受七种以上抗生素菌株的比例已占到9 0 以上，能够耐受的 抗生素有复方磺胺、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、壮观霉素、环丙沙星、氧氟 沙星、甲氧苄胺嘧啶、氟哌酸、氯霉素、链霉素、青霉素、羧苄青霉素、磺胺异恶唑 等。各地报告虽有差异，但从总体看来。鸡白痢沙门氏菌耐药率的增加及耐药谱增宽 的趋势却是一致的f 圳。动物机体的正常菌群构成了有机体的微生态系，它不仅对机体 起着重要的免疫作用和营养作用，同时还起着细菌质粒库的作用，为细菌质粒的转移 和扩散提供原料和场所。目前医学上抗生素的应用存在诸多问题：抗生素滥用，耐药