（食品科学专业论文）由商品果胶酶制剂制备高纯果胶酯酶制剂的研究.pdf

摘要 摘要 果胶酯酶( p e ) 广泛存在于植物、霉菌和细菌中。在一些水果和蔬菜的加工中，天然存在的果 胶酯酶起保护果蔬质构的作用。高纯度的果胶酯酶( p e ) 酶制剂主要应用于果蔬保藏、制备低甲氧 基果胶、研究酶的行为模式以及确定果胶结构和功能性质之间的基本关系等。本研究以商品果胶酶 作为原料，探索一种制备高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂的生产工艺。 采用超滤和s ps e p h a r o s e f a s tf l o w 强阳离子交换凝胶色谱结合的方法复合果胶酶制剂p c 一3 中的果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶进行分离。研究结果表明，超滤后，果胶酯酶活力由i i 2 2 u m l 上 升至9 8 1 2 u m l ，总酶活力由1 4 0 2 5 下降到1 3 4 9 1 5 ，活力损失3 8 ；聚半乳糖醛酸酶酶活由 1 7 4 6 u m l 上升至1 5 6 3 5 u m l ，总活力由2 1 8 2 5 下降到2 1 1 0 7 3 ，活力损失了3 3 ；酶活比( p e ：p g ) 没有发生改变，均为0 6 4 。在p h4 2 时，粗酶中果胶酯酶的吸附率为4 3 0 8 ，聚、仁乳糖醛酸酶的 吸附率为7 1 0 8 。在o 2 5 m l m i n 的洗脱流速下得到最高的第一部分酶活比( p e ：p g ) ：3 6 9 ，但是 果胶酯酶的总得率仅为5 5 9 7 ，而且整个洗脱结果也并未将两种酶完全分离。 研究了p c 一3 中果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的热稳定性，发现粗酶中果胶酯酶的最 适温度为4 3 ，聚、# 乳糖醛酸酶有两个最适温度，分别为3 0 。c 和5 0 。c 。不同温度下两种酶的热失 活研究表明，果胶酯酶是热不稳定的，聚毕乳糖醛酸酶分为热稳定和热不稳定两个部分。在5 5 加 热l o m i n 后，有7 8 1 6 的果胶酯酶酶活力保留下来，聚半乳糖醛酸酶残留酶活为9 9 8 ，两种酶的 失活均为不可逆失活。说明通过适当的热处理可以改变粗酶制剂中果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶的酶 活比例，从而得到高果胶酯酶酶活的酶制剂。 研究了抑制剂对p c 一3 中果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 抑制效果，发现高氯化铁( f e c l d ， 七水合硫酸亚铁( f e s 0 4 7 h 2 0 ) 和l 一谷氨酸钠对聚半乳糖醛酸酶酶活均具有明显的抑制作用，甘氨 酸并不具有很好的抑制能力。同时上述几种试剂对果胶酯酶都没有抑制作用。而脲对两种酶均有抑 制作用。从食品安全利抑制效果两个角度出发，七水合硫酸亚铁( f e s 0 4 7 h 2 0 ) 是一种较好的聚半 乳糖醛酸酶酶活抑制剂。在其浓度为l m m o l l 的时候，p g 酶活迅速下降到原酶活的3 3 1 5 ，在浓度 为5 u o l l 时，p e 残留酶活仍高达9 2 7 。 通过正交实验，得到制备高纯果胶酯酶制剂的最优工艺条件是：温度5 5 ( 2 ，七水合硫酸弧铁 ( f e s 0 4 7 h 。o ) 浓度l m o l l ，时间l o m i n 。在此条件下，果胶酯酶酶活残余为8 0 5 7 ，而聚半乳 糖醛酸酶的活力仅仅残留了8 2 9 。 研究了自制果胶酯酶( p e ) 制剂对菠萝颗粒硬度的影响，并将实验结果与r a p i d a s e 雪f ps u p e r 进行了比较。正交实验表明自制果胶酯酶制荆应用于菠萝果粒的最优条件是果胶酯酶溶液浓度为 0 5 ，乳酸钙浓度为0 3 ，处理时间是2 5 m i n 。在此条件处理，放置一周后，菠萝颗粒硬度较未处理 的样品增加了8 4 2 9 。在相同果胶酯酶活力的处理条件下，r a p i d a s e 雪f ps u p e r 使菠萝颗粒的硬 度增加了1 6 3 倍。 关键词l 果胶酯酶；聚半乳糖醛酸酶； s ps e p h a r o s e 雪f a s tf l o w ；热稳定性；抑制剂； r a p i d a s eof ps u p e r ；菠萝；硬度 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e c t i n e s t e r a s e ( p e ) e x i s t si nt h ep l a n t , 西a n dt h eg e r mw i d e l y i ns o m ef r u i t sa n dv e g e t a b l e p r o c e s s i n g , t h en a t u r a lp eh a st h ef u n c t i o no f p r o t e c t i n gt h et e x t u r a t h ep ep r o d u c t i o no f h i 曲p u r ed e g r e e i sm a i n l ya p p l i e dt op r e s e r v et h ef r u i ta n dv e g e t a b l e ，p r o d u c tl o wm e t h y lo x y g e np e c t i n ，s t u d yt h eb a s i c r e l a t i o n s h i po fp e sb e h a v i o rp a t t e r na n dt h ep e c t i n ss t r u c t u r ea n df u n c t i o np r o p e r t y ，a n ds oo n t h i s r e s e a r c hi n v e s t i g a t e dak i n do fp r o d u c t i o nc r a f tt h a tm a k e sah i g hp u r ed e g r e ep ep r o d u c t i o nf r o m c o m m e r c i a lp e c t i n a s ep r e p a r a t i o n t h ep ea n dp o l y g a l a c t u r o n a s e ( p g ) o fp c - 3w e r ei s o l a t e db yu l t r a f i l t r a t i o na n ds ps e p h a r o s e f a s t f l o w o n es o r to fi n t e n s ec a t i o n i cg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y a f t e ru l t r a f i l t r a t i o n , t h ep ea c t i v i t yw a s r a i s e df r o m1 1 2 2 u m lt o9 8 1 2 u m 1a n dt h et o t a la c t i v i t yw a sd e s c e n d e df r o m1 4 0 2 5t o1 3 4 9 1 5 t h ep g a c t i v i t yw a sr a i s e df r o m1 7 4 6 u m lt o1 5 6 3 5 u m la n dt h et o t a la c t i v i t yw a sd e s c e n d e df r o m2 1 8 2 5t o 2 11 0 7 3 b u tt h ea e t i v i t yr a t i o s ( p e ：p g ) a r eb o t ho 6 4 a tp h 4 2 ，t h ea d s o r p t i o nr a t i oo fp ei nt h ec r u d e e n z y m es o l u t i o nw a s4 3 0 8 a n dt h a to fp gw a s7 1 0 8 t h em a x i m a la c t i v i t yr a t i or p e ：p g ) w a s o b t a i n e da to 2 5 m l m i na n dt h ev a l u ew a s3 6 9 b u tt h ey i e l do fp ew a so n l y5 5 9 7 t h e yw e r en o t s e p a r a t e dc o m p l e t e l y 1 1 1 et h e r m a lc h a r a c t a r i z a t i o no f p ea n dp go f p e 一3w a ss t u d i e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo f p ei s4 3 p gh a st w oo p t i m a lt e m p e r a t u r e s ：3 0 a n d5 0 t h es t u d yo ns t a b i l i t yo fp ea n dp ga td i f i e r e n t t e m p e r a t u r e sd e c l a r e dt h a cp ei s t h e r m a lu n s t a b l ea n dp gh a st w os o r t s ：t h e r l u a ls t a b l ea n dt h e r m a l u n s t a b l e a t i e rt r e a t e dl o m i na t5 5 p ea c t i v i t yr e t a i n e d7 8 1 6 a n dp ga c t i v i t yr e m a i n e do n l y9 9 8 i t p r o v e sw ec a no b t a i nh i g hp ea c t i v i t yp r o d u c t i o nt h r o u g hp r o p e rt h e r m a lt r e a t m e n t t h ei n h i b i t i n ge f f e c to np ea n dp ga c t i v i t yo f c o m m e r c i a lp e c t i n a s ep r e p a r a t i o nb yi r o n ( i i i ) c h l o r i d e h e x a h y d r a t e ，i r o n ( 1 i ) s u l f a t eh e p t a h y d r a t e ，g l y c i n e ，l - g l u t a m i ca c i ds o d i u ms a l ta n du r e aw a ss t u d i e d 1 r o n ( i i i ) c h l o r i d eh e x a h y d r a t e ，i r o n ( ) s u l f a t eh e p t a h y d r a t ea n dl - g l u t a m i ca c i ds o d i u ms a l th a v et h e o b v i o u sa n ds i m i l a ri n h i b i t i n ge f f e c t ：t h e i ri n h i b i t i n ga b i l i t i e si n c r e a s e dc o m p a n i e dw i t ht h e i rc o n c e n t m t i o n i nac e r t a i nr a n g ea n dk e p tu n a l t e r a b l eo u to f t h er a n g e g l y c i n eh a su n s t a b l ei n h i b i t i n ga b i l i t y 1 1 1 ea b o v e f o u rr e a g e n t sh a v en oi i l l l i b i t i n ge f f e c to np e u r e ah a st h ei n h i b i t i n ge f f e c to nt w oe n z y m e sa n dt h ee f 话c t o np gi ss t r o n g e r c o n s i d e r i n gt os a f e ，f e s 0 4 7 h 2 0i st h eb e s ti n h i b i t o ra m o n gt h e m w h e ni t s c o n c e n t r a t i o nw a s1 m m o i l ，t h ep ga c t i v i t yd r o p p e do f ft o3 3 1 5 a n dw h e ni t sc o n c e n t r a t i o nw a s 5 m m 0 1 l ，t h ep ea c t i v i t yr e m a i n e d9 2 7 t h eo p t i m u mp r o c e s s i n gc o n d i t i o n so fh i 曲p ea c t i v i t yp r o d u c t i o nw a ss t u d i e da n do b t a i n e d a s f o i l o w i n g ：t e m p e r a t u r e ：5 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0c o n c e n t r a t i o n ：l m o i l ，t i m e ：1 0 m i n a t t h i sc o n d i t i o n t h e p er e s i d u a la c t i v i t y ( ) w a s8 0 5 7 a n dt h ep gr e s i d u a la c t i v i t y ( ) w a s8 2 9 r e s p e c t i v e l y 。 t h ei n f l u e n c eo nt h eh a r d n e s so fp i n e a p p l eg r a i nb yt h es e l f - m a d ep ep r o d u c t i o nw a ss t u d i e d u n d e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n ( p ec o n c e n t r a t i o n ：0 5 t h el a c t i ca c i dc a l c i u mc o n c e n t r a t i o n ：0 3 t i m e ：2 5 m i n 1 ， t h eh a r d n e s si n c r e a s e d8 4 2 9 a f t e rb e s t o w e dlw e e k r a p i d a s e f ps u p e rm a d et h eh a r d n e s sr a i s e d 1 6 3 w i t ht h ee q u a lp ea c t i v i t y k e y w o r d ：p e e t i n e s t e r a s e 口e ) ；p o l y g a l u c t u r o n a s e ( p g ) s ps e p h a r o s e f a s tf l o w ； t h e r m a ls t a b i l i t y ：i n h i b i t o r ；r a p i d a s e f ps u p e r ：p i n e a p p l e ：h a r d n e s s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：趁逛 日期：膨声万月召e t日期：么产彩月召 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：缢燃，导师签名；塑坠望 日期：川年6 月i ；日 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 酶是一种具有催化特异性的蛋白质，在食品保藏利加工中具有重要的作用。不同的酶在不同的 食品加工工艺中已经得到了广泛的应用。例如。采用蛋白酶水解法加工等电点可溶的水解大豆蛋白 质。由于在酸性条件下可以溶解，因而可以添加到果汁等酸性饮料中，以提高营养价值和改善风味； 葡萄糖淀粉酶已被广泛的用来生产葡萄糖；等等。 一般地讲，在食品加工过程中使_ 1 j 酶的目的包括回收副产物，制造食品，提高提取的速度及产 量，改进风味和稳定食品质量。在食品加工中使用酶的优点包括：它们是天然的和无毒的物质；它 们一般催化一种指定的反应而不造成不需要的副反应；在很温和的温度和p h 条件以及低酶浓度下它 们是具有活性的；通过调节温度、p h 和所用酶的数量能控制反应的速度；在反应进行到期望的程度 之后即可使酶失活“。 果胶酶是自然界中广泛存在的一种酶，它主要包括两大类：一类打断果胶分子链中的a 一1 ，4 糖苷键，催化果胶解聚，其中包括聚甲基乍乳糖醛酸酶( p m g ) ，聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( p m g l ) ， 聚半乳糖醛酸酶( p g ) ；另一类水解果胶分子中的酯键，将高甲氧基( 删) 果胶转化成低甲氧基( l m ) 果胶，即果胶酯酶( p e ) ij l a 。 果胶酶系的作用模式见图1 1 。 + 十 图1 1 果胶酶作用的模式 f i g u r e l 1t h em o d e lo f p e c f i n a s eb e h a v i o r + + 在高等植物当中，通常含有果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) ；而霉菌中存在各种果胶酶， 例如：黑曲霉中不仅含有果胶酯酶( p e ) 利聚半乳糖醛酸酶( p g ) ，还含有果胶裂解酶( p m g l ) ；个 别酵母如克鲁氏酵母含有聚半乳糖醛酸酶( p g ) ；而细菌中的果胶酶主要是聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 ( p m g l ) 。 1 2 果胶酶的生产 一般食品工业加工中所使用的酶制剂大部分是用微生物生产的。用微生物生产酶制剂具有以下 优点：从理论上讲有可能发现一种微生物生产任何一种酶；微生物经诱变或遗传工程改性之后能生 产大量的酶或不同的酶；由于许多微生物酶胞外的，因此它们是易于回收的；生产微生物酶所需要 的原料是容易得到的：微生物具有很高的生长速度和很高的酶产量”1 。 许多微生物都具有产生果胶酶的能力。目前，研究和应用较多的有真菌果胶菌有酱油曲霉 鳗一鲑 缚霹 o o 转一埋赣泔牵卜秘 孓 o 蜮一陆 罐町搏 江南大学硕士学位论文 ( a s p e r g i l l u ss o j o e ) 、日本曲霉( a s p j a p o n i c a s ) 、金黄曲霉( a s p a u r e u s ) 、中赛卡曲霉 ( a s p f o n s e c a e u s ) 和黑曲霉( a s p n i g e r ) 等。其中，黑曲霉a s 3 3 1 6 菌株是国际上公认的用于食 品的安全微生物。由于黑曲霉生产酶制剂的食品安全性已经得到了广泛的论证，因此，商品果胶酶 制剂通常是由黑曲霉经液体深层发酵、过滤、浓缩而成制得的复合酶制剂，其主要成分是果胶酯酶 ( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) ”“”。 果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 也可以由高等植物制得。当利用高等植物制备时，通 常采用生化分离技术，根据其分子量和等电点的不同，分别制得高纯度的果胶酯酶( p e ) 和聚半乳 糖醛酸酶( p g ) 。然而，由于植物果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的最适p h 在中性范围内， 不适合在食品工业中应用，因此，商品果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 制荆通常还是由霉 菌制得，一是从曲霉果胶酶的制备物中纯化，一是通过改变培养基中营养成分的相对比例，从而诱 导生产出某一种酶占优势或只合成一种酶的高纯度的酶制剂”。 1 3 果胶酶的应用 1 3 1 聚半乳糖醛酸酶的应用 聚半乳糖醛酸酶( p g ) 包括内切和外切聚半乳糖醛酸酶，它们只能裂开和游离羧基相邻的糖苷 键，催化果胶酸降解，使底物的黏度快速下降。 在果汁和酒的生产中，真菌聚半乳糖醛酸酶( p g ) 主要用来增加果汁的产鼍，便于加压和过滤， 而且可以提高果汁和酒的透明度。内切聚半乳糖醛酸酶( p g ) 除用于蔬菜泥和果汁的加工外，在果 胶多聚糖和果胶寡聚糖作为药品进行生产的过程中也有着重要的作用。低聚半乳糖醛类是聚半乳糖 醛酸酶( p g ) 的降解产物，它们不仅仅可以调节植物的防御、发育和共生，而且它们是不能被消化 的低聚糖，因此在人类和动物营养方面，它们可以作为健康促进剂。 1 3 2 果胶酯酶的应用 果胶酯酶( p e ) ，又称为果胶甲酯酶( p l i e ) ，存在于植物、霉菌和细菌中，通常和聚半乳糖醛酸 酶协同作用。 在一些水果和蔬菜的加工中，天然存在的果胶酯酶起保护果蔬质构的作用。研究表明，果蔬组 织中存在的果胶甲酯酶，通过降低装罐过程中烫漂阶段的温度及食品中存在钙原子，可逆转加热处 理时的软化效应，激发该酶活性，使果蔬中形成更大的果胶聚合物，使食物的青脆度近于新鲜。 高纯度的果胶酯酶( p e ) 主要应用于果蔬保藏。由于大多数成熟果实含高甲氧基( 删) 果胶， 当使用果胶酯酶( p e ) 酶制剂后，使之脱酯形成自由羧基，此时，如果有钙、镁等二价金属阳离子 存在，两个分子链的羧基就可以通过钙桥实现离子连接以及氢键共同作用，在原位形成坚固不溶解 的果胶酸凝胶，果胶的凝胶特性从高甲氧基( 删) 果胶转变成低甲氧基( l m ) 果胶，从而提高了果 实颗粒的坚硬度、尺寸与形状”“。 帝斯曼公司已经在这一领域作出了大量的研究，其果胶酯酶产品r a p i d a s e f ps u p e r 加入草莓 整果中，在一定比例的c a c l 2 存在的情况下，草莓的硬度和稳定性都显著增强”1 。 除用于果蔬保藏以外，高度专一的p e 还可以用于制各低甲氧基( l m ) 果胶。低甲氧基果胶是食 品、医药、日用化工不可缺少的原料，可作为食品的增稠剂、胶凝剂、稳定剂和乳化剂，广泛用於 罐头、果酱、果汁、冰淇淋和巧克力。相对于来自丁二高甲氧基( 删) 果胶的凝胶来说，低甲氧基( l m ) 果胶的凝胶更软，对p h 的依赖性降低。果胶酯酶将果胶脱甲酯后形成的低甲氧基( l m ) 果胶比高甲 氧基( 删) 果胶对潮湿利热更稳定，并当存在二价阳离子如钙离子时得到低热无糖凝胶“。在医 药方面，它除具有食品的四种作用外，尚作为前体药物载体以及成膜材料，如亲水软膏基质、骨架 胶囊剂和肠道出血的止血剂。近年研究证明果胶能与金属离子形成不溶于水的化合物，果胶是铅、 汞和钴等金属中毒的良好解毒剂和预防剂。 此外，高纯度的果胶酯酶( p e ) 制剂还可用于研究酶的行为模式以及果胶结构和功能性质之间 的基本关系“”。 因此，果胶酯酶( p e ) 催化果胶甲酯基团水解，并导致果胶钙凝胶的形成。这一现象导致果汁 沉淀的产生，同时也提高了水果和蔬菜产品的质构1 。 2 第一章绪论 果胶酯酶凝胶作用机理见图1 2 。 忡l 孝之了蔷过警逆厂 l ：= ： 。过：盯j 砬汀 l c - 图1 2 果胶酯酶凝胶作用示意图。1 f i g u r e l 2 t h e c h a r t o f p e c t i n g e l f o r m a t i o nc a t a l y z e d b y p e c t i n e s t e r a s e 1 3 3 果胶酶制剂的应用 微生物果胶酶制剂是食品工业中使用量最大的酶制剂之一，是农产品加工中非常重要的一种工 业酶制剂，由于其中士要的两种酶果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的协同作用，它主要被 广泛应用于果蔬汁的提取和澄清“1 。 果实的细胞壁主要由平行排列的纤维素微晶纤维构成，由半纤维索木葡聚糖交联，水果的质构 应该归功于基本细胞壁与中间吊带层的结构完整性。果胶是水果细胞肇与吊带层的主要结构多稽。 吊带层中果胶作为相邻细胞的粘合剂，给水果组织带来强度与韧性。 根据果胶的凝胶特性不同可分为两大类： 高甲氧基果胶( 珊果胶) ：甲酯化程度超过5 0 ，因此基本与钙离子不发生反应( 主要是疏水相 互作用并形成氢键) 。 低甲氧基果胶( l m 果胶) ：甲酯化程度低于5 0 ，能与钙离子形成凝胶( 形成钙离子络合物) 。 大多数成熟水果含有高甲氧基( 删) 果胶，当加入果胶酶制剂后，其中的果胶酯酶( p e ) 使之 脱酯形成自由羧基，将其转变成为低甲氧基( l m ) 果胶，之后酶制荆中的聚半乳糖醛酸酶( p g ) 打 断与游离羧基相邻的糖苜键，将果胶分子降解成为单聚或寡聚半乳糖醛酸，使被果胶分子包裹着的 粒子暴露出来，通过非酶静电相互作用沉淀下来，从而达到澄清的目的。 1 4 果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶的生化性质 1 4 1 等电点与相对分子量 文献资料显示，通常，果胶酶的等电点在p h 4 o 9 0 之间。但是，不同来源的果胶酶其生 化特性是不同的。来自于高等植物的果胶酯酶其相对分子量通常在2 7 k d a - 5 4 k d a ，其等电点通常高 于p i t 7 0 “。而来源于微生物的果胶酯酶其相对分子量通常在2 7 k d a 一4 6 k d a ，其等电点通常在 7 0 - 8 4 “。但是，对于由黑曲霉系生产的果胶酯酶的等电点却没有报道过。 对于聚半乳糖醉酸酶来说，许多研究工作证明内切聚半乳糖醛酸酶具有多种分子形式和同功酶， 例如，在番茄中该酶有两种分子形式，分子量分别为3 5 0 0 0 和8 5 0 0 0 。不同来源的内切聚半乳糖醛 酸酶具有类似的分子量和l ( 1 l l 值，但是他们的比活力存在着很大的差异。大多数内切聚半乳糖醛酸酶 的最适p h 在4 5 范围内，其中黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶的最适p h 是4 0 。 3 銎l 妮移 江南大学硕士学位论文 来源于微生物的聚半乳糖醛酸酶其相对分子量通常在2 0 k d a - 1 1 5 k d a ，等电点通常在4 2 7 6 “”“”，其中，由黑曲霉系的某些曲霉菌属生产的聚半乳糖醛酸酶的生化特性已经被详细报道。例 如：汤鸣强等( 2 0 0 5 ) 用黑曲霉s l 2 2 1 1 1 生产的聚半乳糖醛酸酶的相对分子量在7 1 5k d a ，等电 点大于6 4 ”；张红霞等( 2 0 0 5 ) 由a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 生产的聚半乳糖醛酸酶的相对分子量在 6 0 k d a ，等电点在3 5 5 ”；s r i d e v ia n n a p u r n as i n g h ( 2 0 0 2 ) 等由黑曲霉制备的聚半乳糖醛酸酶的 相对分子量在3 0 k d a - 6 0 k d a ”1 ；n a a j a n ad e v l ( 1 9 9 6 ) 等测得由a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s 制得的 聚半乳糖醛酸酶的相对分子量在4 1 k d a 一6 3 k d a 。； s h i g e t a k ai s h i i ( 1 9 7 2 ) 等对从a s p e r g i l l u s j a p o n i c u s 中提出的聚半乳糖醛酸酶研究发现其相对分子量为3 5 5 k d a 1 ，等等。 为了获得纯度较高的果胶酯酶制剂，一种方法便是采用发酵法通过改变培养基的营养成分从而 诱导生产出某种酶活力占绝对优势的高纯酶制剂，例如汤鸣强( 2 0 0 6 ) 通过固体发酵的方法改变碳 氮源，无机盐及培养条件等因素，从诱变菌株s 1 2 1 1 1 得到果胶酯酶硫酸铵分级沉淀的浓度可达到 9 0 “；焦云鹏( 2 0 0 4 ) 对黑曲霉( a s 33 3 2 4 ) 用高甲氧基果胶诱导，当接种量为3 1 0 个孢子，3 0 恒温培养，转速9 0 r n f i n ，液体培养4 d 时，果胶酯酶的活力最大，为9 0 2 u l 培养基；等 等。目前，深层发酵法已广泛应用于果胶酯酶制剂的生产。 另外，也有大量的研究试图通过利用果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶生化性质例如相对分子量或者 等电点的差异性通过生化分离的方法分离纯化果胶酯酶。例如：m a r i ac m a l d o n a d o 等( 1 9 9 4 ) 曾 用d e a e 阴离子交换剂对由自制的黑曲霉生产的果胶酶进行分离纯化，他们将仅含有果胶酯酶酶活的 部分收集起来，最终得到了完全不含聚半乳糖醛酸酶活力的纯酶液，其最终得率为3 7 “1 。 1 4 2 热性质 不同的酶由于其分子大小和结构的复杂性的不同而具有不同的热稳定性，其包括两个方面：一 是酶的最适温度，另一个方面是酶的热失活速度。一般来说，温度越低，酶越稳定，并且，有些酶 的初制荆的稳定条件完全不同于他的纯化形式，通常粗酶制剂的稳定性高于其纯化形式，并且更易 保藏，其原冈可归结于非纯化的保护作用1 。 研究表明，高等植物的果胶酯酶( p e ) 是比较耐热的，在低于3 0 c 时，其酶活逐渐上升。在3 0 6 0 时，其酶活始终在较高水平并可达到最大酶活，当温度超过6 0 时酶才开始逐渐失活，并 且在8 0 c 左右加热5 1 0 分钟后酶才完全失活”；然而，霉菌果胶酯酶对丁_ 温度有更强的热敏感性， 相对于植物果胶酯酶来说，其热稳定性较低。例如，商品霉菌果胶酯酶在p h 3 5 和5 0 。c 加热半小时， 活力没有损失；而当温度升高到5 8 5 c 和6 2 。c 时，酶活力分别损失5 0 9 6 和1 0 0 。通常大部分的霉 菌果胶酯酶的最适温度在4 5 左右，超过此温度后，酶活逐渐丧失，在6 0 。c 加热1 0 分钟，其酶活 几乎完全丧失。 黑曲霉生产的果胶酯酶( p e ) 具有如下特性“1 l 、最适p t t 4 5 2 、最适温度4 0 - - 4 5 ( 5 - - - 1 0 时有3 0 的活力) 对于聚芈乳糖醛酸酶来说，无论是来源于植物还是微生物，都具有很强的热不稳定性，通常情 况下，当温度超过5 0 c 时，其酶活逐渐丧失”“1 ，并且随着温度的升高和热处理时间的延长，其 酶活丧失速度越快”“”。 1 - 4 3 抑制剂 对于果胶酯酶( p e ) 来说，除了含有十二烷基硫酸钠( s o d i u ml a u r y ls u l f a t e ) 和烷基芳基硫 酸盐( a l k y la r y ls u l f a t e ) 的合成清洁剂在低浓度下可使其失活以外，其酶活力通常不受化学试剂 的影响，并且真菌果胶酯酶( p e ) 比植物果胶酯酶( p e ) 对这些试剂更有抵抗力1 。一定浓度的某 些一、二价金属阳离子，比如n a + ，c a 2 + 等，还能够使植物果胶酯酶( p e ) 的酶活力增加5 - 6 倍 4 1 - 4 5 1 ， 使微生物果胶酯酶( p e ) 的酶活力增加1 5 - 2 倍“”“2 ”“。 而对于聚半乳糖酵酸酶( p g ) 来说，有多种物质和试剂可以使其酶失活。这些物质主要分为两 大类，一类是天然存在于植物组织中的植物组织中的一种多肽或蛋白质( p g i p ) 。这类物质首先不具 有毒性，而且其抑制效果非常好，尤其是对真菌聚半乳糖醛酸酶( p g ) ，此外，其抑制效果几乎不受 温度的影响，只是随着其加入量的增加抑制效果变大1 。另一类抑制剂是某些化学试剂。酚类化合 4 第一章绪论 物及其氧化产物对聚半乳糖醛酸酶的抑制作用已经众所周知1 ；n e e l a mp a t h a k 等( 2 0 0 0 ) 在对香 蕉聚半乳糖醛酸酶的抑制研究中发现，巯基键合试剂( s u l p h y d r y lb i n d i n gr e a g e n t s ) 中的碘乙酰 氨( i o d o a e e t a m i d e ) 和对氯高汞苯甲酸( p - c m b ) 对其酶活有抑制作用。其中，碘乙酰氨 ( i o d o a c e t a m i d e ) 在l m m 浓度时抑制2 0 的酶活，而氯高汞苯甲酸( p - c m b ) 在浓度为0 1 m m 时便 抑制4 5 的酶活，在浓度为0 5 m m 时抑制效果达到6 5 “”；n a n j a n a d e v i 等( 1 9 9 6 ) 在对由a s p e r g i l l u s c a r b o n a r i u s 生产的聚半乳糖醛酸酶的抑制研究中发现某些金属离子对不同的聚半乳糖醛酸酶的同 功酶也有抑制作用，如f e 3 + 。h 9 2 + ，m n 2 + ，其最大抑制效果分别为4 0 ，8 5 和3 5 1 ；此外，还 有一些化学试剂也被证明对聚半乳糖醛酸酶具有抑制作用，如尿素，甘氨酸，甲醛1 ，聚谷氨酸钠 等等。 某些化学试剂通过抑制果实中乙烯的产生，延长内源聚半乳糖醛酸酶虽大酶活的产生周期和降 低其最大酶活从而达到一定程度抑制聚半乳糖醛酸酶酶活的目的，因此，它们通常被用于果实成熟 前及采摘后的保鲜处理，如：s t s ，c h i ，2 ，4 - d ( 2 ，4 - - - - - 氯苯氧基乙酸) 等“”。其中，研究较多的 是卜甲基环丙烯i - m c p ( 卜m e t h y l c y c l o p r o p e n e ) ，它可推迟果实的成熟，在适当处理后，其果实中 的聚半乳糖醛酸酶的最大酶活的产生推迟并且其最大活力随着卜甲基环丙烯卜m c p ( 卜m e t h y l c y c l o p r o p e n e ) 加入量的增加可降低达到三分之一”1 。 另外，酶活产物对酶活也有抑制作用。例如，聚半乳糖醛酸酶酶活的最终产物半乳糖醛酸在达 到定浓度的时候，便会对其酶活产生明显的抑制作用。但是，半乳糖醛酸同时对果胶酯酶也会产 生酶活抑制作用，其原因剑目前为止还没有得到完美的解释1 。 至于这些化学试剂抑制聚半乳糖醛酸酶酶活力的原囚。到目前为止大部分归结于其破坏了酶的 活性中心存在的s h 一基团从而使酶的酶活丧失“”1 。 1 5 本课题研究背景 我国是世界果品、蔬菜产量的第一大国。但我国果蔬产业存在的最主要问题之一便是采后损失 率高，保鲜技术薄弱，全国每年果品腐损近1 2 0 0 万吨，蔬菜1 3 亿吨”“。美国等发达国家的果蔬 采后损失率不到5 ，而我国高达3 0 左右，特别是果蔬产后保鲜等方面技术差距更大，这己成为制 约我国果蔬产业快速发展的瓶颈。农业部在十五计划目标中就明确提出要重点发展果蔬贮运保鲜， 大力提高采后保鲜等商品化处理程度，大力发展水果的贮藏保鲜与加工重点开发水果生物保鲜技术。 因此，果蔬保藏以及在食品加工过程中和产品在货架期的稳定性已经成为我国研究的一个重要课题。 在果蔬保藏和果实加工的过程中，植物的聚半乳糖醛酸酶( p g ) 必须没有活性，这是由于这些 植物内源聚半乳糖醛酸酶( p g ) 可以抵抗多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白，并且可以连续的降解果胶直 至超过解聚作用的水平从而导致过多的组织软化，如腌制蔬菜的生产。食品加工方法如冷冻和罐装 也会导致水果和蔬菜结构的变化，然而通过调节植物内源聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的活性便可以加强 细胞壁的强度。在番茄加工的过程中，为了防止组织软化情况的发生，生产者常常采用热失活的方 法，即将要处理的东西迅速加热至8 5 以上以使酶失去活性，但是，这样的一个过程也会影响产品 的黏度和其他指标，如挥发性芳香化合物的总量和成分”1 。 用遗传改良的方法也可以使植物中p g 的活性降低，这方法已经用于番茄产品加工中。在生产 番茄酱的过程中，果实中果胶的浓度越高，越能减少浪费，节省能源，而且在加工过程中可以减少 增厚剂的用量。因此，用这种经遗传改良的番茄加工成番茄酱比用不经遗传改良的番茄费用要低。 用含有抗p g 和果胶酯酶的抗性基因的番茄制成的果汁，与普通的相比，具有更高的黏度”1 。 一种后期处理的方式，将高度专一的果胶酯酶( p e ) 制剂用于处理成熟果实是果蔬保藏领域的 新方法。采用这种方法可以使其在细胞内壁形成稳定的果胶聚合物，使得果胶被降解的时间延长， 青脆度近于新鲜，从而达到保鲜的目的。 但是，到目前为止，国内有能力生产高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂的公司几乎没有，大量依靠国 外进口，而且关于将果胶酯酶( p e ) 制剂应用于果蔬保藏和加工的研究文献也很少。而国外已经大 规模生产高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂并对其在果蔬保藏和加工中的应用做了广泛的研究和实践。例 如。帝斯曼公司生产的r a p i d a s e f ps u p e r ；诺维信公司生产的n o v o s h a p e ”“。 江南大学硕士学位论文 1 6 本课题研究目的及意义 综上所述，高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂的生产工艺的研究具有重要的意义，首先，它可以解决 目前国内果胶酯酶( p e ) 制剂大量依赖于进口的问题，改变生产现状；其次，将国内自主生产的果 胶酯酶( p e ) 制剂应用于果蔬保藏和果实加工的研究，可以降低研究经费，从而加大研究力度，有 利于科技成果的产出和利用，改变在这一领域研究的落后现状；第三，将国内自主生产的果胶酯酶 ( p e ) 制剂应用于果蔬保藏和果实加工的科技成果转化为实际生产应用后，可使产品的生产成本降 低，一定程度上解决我国目前因为果蔬保藏技术落后而浪费严重的现状，同时提高果实加工中的利 用率，增加经济效益。 因此，本课题研究的目的就是探索一条低成本、高产出的高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂的生产工 艺。 1 7 本课题研究主要内容 1 、利用真菌果胶酶制剂中果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 生化性质( 分子量，等电点 等) 的差异，采用生化分离方法制备果胶酯酶( p e ) 活力占优势的高纯度果胶酯酶( p e ) 制荆。 2 、利用真菌果胶酶制剂中果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的耐热能力的差异，采用热 处理方法制备果胶酯酶( p e ) 活力占优势的高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂。 3 、利用不同食品添加剂对真菌果胶酶制剂中果胶酯酶( p e ) 和聚半乳糖醛酸酶( p g ) 抑制效果 的差异，采用抑制剂处理方法制备果胶酯酶( p e ) 活力占优势的高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂。 4 、采用高纯度果胶酯酶( p e ) 制剂对果蔬保藏和果实加工进行初步研究。 6 第二章商品果胶酶中果胶酯酶和聚芈乳糖醛酸酶的生化分离 第二章商品果胶酶中果胶醑酶和聚半乳糖醛酸酶的生化分离 2 1 引言 为了获得高纯活力的酶制剂，可以考虑根据混合酶制剂中各种酶的生化性质例如分子量、等电 点等的不同，通过生化分离技术将其分离纯化，从而在某一部分得到纯的或者目标酶酶活占优势的 酶制剂。 虽然对于由黑曲霉生产的聚半乳糖醛酸酶的生化特性已有了较为深入的研究，但是，由黑曲霉 生产的果胶酯酶，除了在相对分子量上可以得到某些信息以外，在等电点方面的信息还没有明确的 报道。同时，由于黑曲霉在生产中会产生多种果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶的同功酶，其相对分子量 和等电点相互交错，因此也给利用生化分离方法来纯化果胶酯酶或聚半乳糖醛酸酶增加了难度 州3 小”牌1 。m a r i ac m a l d o n a d o 等( 1 9 9 4 ) 曾对自制的黑曲霉果胶酶进行分离纯化，他们将仅含有 果胶酯酶酶活的部分收集起来，最终得到了完全不含聚半乳糖酵酸酶活力的纯酶液，在此条件下果 胶酯酶的得率为3 7 。 本研究采用超滤结合大容最的强阳离子交换凝胶色谱s ps e p h a r o s e f a s tf l o w 对商品果胶酶 制剂进行分离纯化，以探讨可能的果胶酯酶制备方案。 2 2 实验材料、仪器和方法 2 2 1 实验材料 远天3 4 复合果胶酶制剂广州市天河区远天酶制剂厂 p c 一3 复合精制果胶酶制剂天津市佳益酶制剂技术有限公司 复合果胶酶制剂 北京东华强盛生物技术有限公司 f 2 0 1 格林酶素北京中农博特生物技术有限公司 柑桔果胶 s i g m a s ps e p h a r o s e of a s tf l o w p h a r m a c i ab i o