（食品科学专业论文）磁性微球用于乳糖酶的固定化研究.pdf

磁性微球用于乳糖酶的固定化研究 食品科学专业 研究生李黎指导教师马力 磁性高分子微球是最近发展起来的一种新型功能高分子材料，它是有机一 无机纳米复合粒子，具有磁性，在外加磁场作用下很容易进行分离和磁性导向， 现作为酶、细胞、药物等的载体被广泛地应用到了生物工程、细胞学和生物医 学等领域。将壳聚糖和磁性纳米粒子结合制各磁性壳聚糖微球，具有重要的学 术意义和应用价值。磁性壳聚糖微球因其表面具有与生物活性物质反应的活性 羟基和氨基，可被广泛用于生物活性物质的载体，同时又因其具有磁性，在外 加磁场作用下能快速分离，使原来昂贵、低效的分离技术变得低廉、高效。本 文选用壳聚糖制备的磁性微球作为固定化乳糖酶的载体材料。固定化的乳糖酶 可以重复回收使用，既节约酶的消耗量，又为自动化生产管理提供了便利的条 件。 本论文主要包括以下三个方面的内容： 以氯化亚铁、氯化铁、氢氧化钠为主要原料，采用化学共沉淀法合成了f e 3 0 4 磁性粒子，并对f e 3 0 4 粒子的平均粒径、分散稳定性、相对磁性大小进行了测试 与表征。用正交设计法优化了f e 3 0 4 微粒的合成工艺条件，得到制备f e 3 0 4 粒子 的最佳实验条件为f e 2 + f e 3 + 的物质的量之比为2 ：1 、共沉淀时的p h 值为1 1 、熟 化温度为9 0 。c 、表面活性剂( p e g ) 的用量为4 0 m l ，此时制得的f e 3 0 4 粒子粒径 最小，为7 8 r i m ，f e 3 0 4 溶液的分散稳定性最好，相对磁性最强。从f e 3 0 4 的扫描 电镜图可以看出，f e 3 0 4 微粒晶体颗粒为纳米级。 以f e 3 0 4 磁性粒子为内核，液体石蜡为分散介质，s p a n - 8 0 为乳化剂，戊二 醛为交联剂，采用反相悬浮交联法制备磁性壳聚糖微球( m c s ) ，探讨了交联 时间、反应温度、壳聚糖浓度、f e 3 0 4 c s 质量比、戊二醛用量、分散介质用 量等因素对磁性壳聚糖微球性能的影响，并对其形态、粒径、分散性、磁响应 性进行了初步表征。磁性壳聚糖微球在外加磁场下具有强磁性能，在自然状态 下具有良好的悬浮稳定性。壳聚糖与f e 3 0 4 纳米粒子形成的复合微粒呈球状，纳 米粒子被包裹在微球内，为核壳结构，且微球表面较平滑，单分散性好。制备 的m c s 粒径介于l m 1 5 岬l 之间，该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分 离。 将磁性壳聚糖微球( m c s ) 用于乳糖酶的固定化。考虑加酶量、磁性微球 本身的性质、缓冲液的p h 值、固定化时间对固定化效果的影响，确定了最佳固 定化条件。与游离酶相比，固定化酶有更宽的p h 适用范围；游离酶的最佳催化 温度为4 0 ，固定化酶最佳催化温度为4 5 ，比游离酶提高了5 ，固定化后的 乳糖酶的温度耐受性有所提高；固定化后的乳糖酶的米氏常数比游离酶下降， 说明乳糖酶在固定化后其结合底物的能力有所增强；固定化酶反复使用5 次后， 酶活仍保持了6 5 以上；乳糖酶被固定化后，其贮存稳定性也有所提高。 关键词：磁性微球，固定化酶，乳糖酶，壳聚糖 s t u d yo n t h ei m m o b i l i z a t i o no fl a c t a s e o nm a g n e t i cm i c r o s p h e r e s s p e c i a l t y ：f o o ds c i e n c e p o s t g r a d u a t e ：l il is u p e r v i s o r ：m al i m a g n e t i cp o l y m e rm i c r o s p h e r ei san o v e lf u n c t i o n a lm a t e r i a lt h a th a sb e e n d e v e l o p e dr e c e n t l ya n di t i sak i n do fo r g a n i c i n o r g a n i cc o m p o u n dn a n o p a r t i c l e ， w h i c hh a sm a g n e t i s ma n dc a l lb es e p a r a t e da n do r i e n t e de a s i l yu n d e ra p p l i e d m a g n e t i cf i e l d a st h ec a r r i e ro fe n z y m e ，c e l la n dd r u g ，i tc a l lb ew i d e l ya p p l i e di n m a n yf i e l d s ，s u c ha sb i o e n g i n e e r i n g , c y t o l o g y , b i o m e d i c a ls c i e n c ea n ds oo n m a g n e t i c c h i t o s a nm i c r o s p h e r e sh a v ea t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o na st h e y d i s p l a yv e r yi m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ea n dv a l u ei nt h e o r e t i c a l a n da p p l i c a t i o n a s p e c t s f o re x a m p l e ，t h e yc a l lb ea p p l i e da sc a r r i e ro fb i o m a c r o m o l e c u l e sa n d c e l l sb e c a u s eo ff u n c t i o n a l 咀2a n d - o ho fc h i t o s a ne n c a p s u l a t i n gm a g n e t i c p a r t i c l e s w h i l s t ，o w i n gt o t h e m a g n e t i s mo ft h em i c r o s p h e r e s ，s e p a r a t i o n e f f i c i e n c yi si n c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo fo u t e rm a g n e t i cf i e l d ，w h i c hl e a d st o a c h i e v ea c h e a pa n dc o n v e n i e n ts e p a r a t i o ni nm a n ya s p e c t s i nt h i sp a p e r , l a c t a s e i m m o b i l i z a t i o nw a sp r e p a r e du s i n gm a g n e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e sa st h ec a r r i e r m a t e r i a l s i m m o b i l i z e dl a c t a s ec a nb er e p e t i t i v e - u s e d n o to n l yt h ec o n s u m p t i o n o f e n z y m ew a sr e d e c e d ，b u ta l s oa u t o m a t i o nm a n a g e m e n tb e c o m e sp o s s i b l e t h i st h e s i sm a i n l yi n c l u d e st h r e ea s p e c t sa sf o l l o w s ： f e 3 0 4m a g n e t i cp a r t i c l e sw a ss y n t h e s i z e db yt h ec h e m i c a lc o - p r e c i p i t a t i o n , u s i n gf e c l 2 ，f e c l 3a n dn a o h t h ea v e r a g ed i a m e t e r , t h ed i s p e r s i o ns t a b i l i t ya n d t h er e l a t i v es i z eo fm a g n e t i co ff e 3 0 4m a g n e t i cp a r t i c l e sw e r et e s t e da n d c h a r a c t e r i z e d t h e s y n t h e t i c c o n d i t i o n so ff e 3 0 4 m a g n e t i cp a r t i c l e s w e r e d e t e r m i n e dt h r o u g ho r t h o g o n a ld e s i g na n dt h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s a sf o l l o w s ：n f e 2 + n f e 3 + w a s2 ：1 ，p hw a s l l ，c u r i n gt e m p e r a t u r ew a s9 0 。ca n dt h e a m o u n to fp e gw a s4 0 m 1 u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ea v e r a g ed i a m e t e ro ff e 3 0 4 p a r t i c l e sw a s7 8 n m ，t h ed i s p e r s i o ns t a b i l i t yw a st h eb e s ta n dt h er e l a t i v es i z eo f m a g n e t i cw a st h es t r o n g e s t i tc o u l db es e e nf r o ms c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t h a tf e 3 0 4c r y s t a lp a r t i c l e sw e r en a n o m e t e r m a g n e t i cc h i t o s a nm i c r o s p h e r e s ( m c s ) w e r ep r e p a r e db yr e v e r s ep h a s e s u s p e n s i o np r o c e s su s i n gf e 3 0 4a sc o r e ，p a r a f f i na sd i s p e r s e dm e d i u m ，s p a n 一8 0a s e m u l s i f i e r , a n dg h i t a r a l d e h y d ea sc r o s s - l i n k i n ga g e n ta n dt h es h a p e ，t h ea v e r a g e d i a m e t e r , t h ed i s p e r s i o ns t a b i l i t ya n dt h e r e l a t i v e s i z eo fm a g n e t i cw e r e c h a r a c t e r i z e d t h ec r o s s l i n k i n gt i m e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f c h i t o s a n ，m f e 3 0 4 m c s ，t h ea m o u n to fg l u t a r a l d e h y d ea n dt h ea m o u n to f d i s p e r s e dm e d i u mw e r ed i s c u s s e d , w h i c he f f e c t e dt h ep e r f o r m a n c eo fm c s m c sh a ds t r o n gm a g n e t i s mu n d e re x t e r n a lm a g n e t i cf i e l da n dg o o ds u s p e n d e d s t a b i l i t yu n d e rt h en a t u r a lc o n d i t i o n m c sw a ss p h e r o i d a la n df e 3 0 4m a g n e t i c p a r t i c l e sw a sp a r c e l e di nm i c r o s p h e r e s o b v i o u sc o r e s h e l ls t r u c t u r ec o u l db es e e n i nt h ep a r t i c l e sa n di t ss u r f a c ew a ss m o o t h t h ed i a m e t e rw a sb e t w e e n1 儿m 1 5 p m ，w h i c hw a sg o o df o rd i s p e r s i o na n dm a g n e t i cs e p a r a t i o n i nt h i sp a p e r , l a c t a s ei m m o b i l i z a t i o nw a sp r e p a r e du s i n gm a g n e t i c 、c h i t o s a n m i c r o s p h e r e s ( m - c s ) 猫t h ec a r r i e rm a t e r i a l sa n dt h ea m o u n to fl a c t a s e t h e c h a r a c t e r i s t i co fm - c s ，t h ee f f e c t so fp hv a l u e ，t h ee f f e c t so fp hv a l u ea n d i m m o b i l i z i n gt i m eo i lt h ea c t i v i t yi nt h ew h o l ei m m o b i l i z ep r o c e s sw e r es t u d i e d a sc o m p a r e dw i t hf r e ee n z y m e ，t h ei m m o b i l i z e dl a c t a s eh a dw i d e ra p p l i c a b l e r a n g eo fp h ；t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ff r e ee n z y m ew a s4 0 。b u tt h a tf o r i m m o b i l i z e de n z y m ew a si m p r o v e dt o4 59 c t h e r e f o r e ，t h et e m p e r a t u r et o l e r a n c e o f i m m o b i l i z e de 1 1 z y m eh a db o o s t e du p t h ek mv a l u eo f i m m o b i l i z e dl a c t a s ew a s l o w e rt h a nt h a to ff r e el a c t a s e ，w h i c hm e a n e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dl a c t a s eh a d h i g h e ra f f i n i t yt o w a r d st h es u b s t r a t e ；a f t e r5c y c l e so fo p e r a t i o n ，t h ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e d e n z y m e r e m a i n e do v e r6 5 i n i t i a l a c t i v i t y ；i na d d i t i o n , i m m o b i l i z a t i o ni m p r o v e dt h es t a b i l i t yo f l a c t a s e k e y w o r d s ：m a g n e t i c c h i t o s a nm i c r o s p h e r e s ，i m m o b i l i z e d e n z y m e ，l a c t a s e ， c h i t o s a n 西华大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获 得西华大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师指导下取 得的，论文成果归西华大学所有，特此声明。 作者签名：力赡 导师签毡夕 阳g 年岁月朋日 丽年j 月oe l 西华大学硕士学位论文 1 综述 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知 的维生素和多种矿物质，尤其是钙含量高，钙磷比例适当，易被人体消化吸收， 还含有免疫球蛋白等抗病因子，所以乳及乳制品有i 丘乎完美的食物”的美称， 是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品。然而，不是所有的人群都可 以享用牛奶，特别是亚洲地区，患有“乳糖不耐症而导致不能食用牛乳的人群 比例相当大。据报道，亚洲人口中约有7 0 的人患有不同程度的“乳糖不耐症”。 所谓“乳糖不耐症”是指由于人体小肠内缺乏分解乳糖的1 3 半乳糖苷酶，饮用牛 乳或乳制品后引起的对乳糖不耐受的非疾病性症状，主要表现为消化不良、腹 胀、肠鸣、呕吐、急性腹痛或腹泻等。由于“乳糖不耐症”的普遍存在，使相当 一部分人无法像正常人一样接受牛乳这一天然、具有良好平衡性食品，这成为 我国乳品工业发展的主要障碍之一。 一般水解7 0 8 0 的乳糖即可解决“乳糖不耐症”的问题。目前，降低乳 糖的方法有三种：超滤法、化学酸水解法和酶解法，其中酶解法最适合生产低 乳糖牛奶。用b 半乳糖苷酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，可以有效地消除人体 对乳糖的不耐受症状，对于发展我国乳品工业，提高人民的健康水平具有十分 重要的意义。但是，将1 3 半乳糖苷酶直接加入牛乳中，酶的活性较低、半衰期 短，酶只能使用一次，利用率低，导致生产成本较高，限制了b 半乳糖苷酶在 乳制品工业中的应用，不能适应日益增长的市场需求。为克服这些问题，可通 过物理的或化学的方法，将乳糖酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活 性，又便于与反应液分离，并可以重复使用，即固定化乳糖酶。作为固定化酶 的一部分，载体材料的结构和性质对固定化酶的各种性能都有着巨大的影响。 与其它载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化乳糖酶的载体具有诸多优 点：提高酶的稳定性，易于将酶与底物和产物分离；提高酶的生物相容性和免 疫活性；操作简便，可降低成本；磁性载体固载酶放入磁场稳定的流动床反应 器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作；利用外部 磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方 式，提高固定化酶的催化效率。 用磁性高分子微球固定化乳糖酶，将为乳糖酶在乳制品工业中的应用开辟 西华大学硕士学位论文 一条更为切实可行的新途径，必将成为乳制品工业技术革新和技术改造的一个 新亮点。该项目的实施对于优化乳制品生产工艺、生产优质低乳糖乳制品、降 低生产成本、提高乳品业发展水平等具有重要的实际意义。 1 1 磁性微球研究进展及其在固定化酶中的应用 酶是一种天然的高分子催化剂，催化效率极高、反应专一性强、来源广泛、 无污染，在食品加工、医药等产业中有着极为广阔的应用。但天然酶稳定性差、 易失活、不能重复使用，并且反应后易混入产品，纯化困难，难以在工业中广 泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催 化剂的成本。为了克服这些问题，酶的固定化技术于2 0 世纪6 0 年代应运而生并 发展起来，成为近几年酶工程研究的重点。固定化酶( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 是 通过物理的或化学的方法，将酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性， 又便于与反应液分离，可以重复使用，它是酶制剂中的一种新剂型。过去曾称 其为水不溶酶或固相酶。1 9 7 1 年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶 的名称。而作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能对固定化酶的各种 性能都有着巨大的影响f 1 。由于载体材料的重要性，因此自固定化酶技术兴起 以来，很多学者就一直致力于对载体的研究。迄今为止，随着科学技术的发展， 固定化酶的载体材料已从最初的天然高分子材料发展到合成高分子材料、无机 材料，以及现在的复合材料等。复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组 成的新载体材料。如磁性高分子微球，它是一种内部含有磁性金属或金属氧化 物的超细粉末从而具有磁响应性的高分子微球。与其它载体材料相比，磁性高 分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较 低等诸多优点，因此引起了国内外许多学者的广泛关注。 磁性高分子微球是最近发展起来的一种新型功能高分子材料。它的研究始 于2 0 世纪7 0 年代末，u g e l s t a d 成功地在重力条件下制备了尺度均一的单分散的 聚乙烯微球。磁性高分子微球是指通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物 质结合起来形成的具有一定磁性及特殊结构的微球。它不但可以通过共聚、表 面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应性功能基团( 如o h 、c o o h 、 c h o 、- n h 2 、s h 2 等) ，也可通过共价键来结合酶、细胞和抗体等生物活性物 2 西华大学硕士学位论文 质，还可对外加磁场表现出强烈的磁响应性，进行快速运动或分离【2 1 。因此， 它被用做酶、细胞、药物等的载体广泛地应用到了生物医学、细胞学和生物工 程等领域。 1 1 1 磁性高分子微球的制备 就目前研究现状来看，磁性高分子微球一般为核壳式结构。可分为三类： 一是以磁性材料为核，高分子材料为壳的核壳式结构；二是以高分子材料为核， 磁性材料作为壳层的核壳式结构：三是内层、外层皆为高分子材料，中间层是 磁性材料的夹心式结构。其中研究较多且具有广泛应用前景的主要是第一类磁 性高分子微球，因此本文主要就第一类磁性高分子微球的制备方法及其在酶的 固定化中的应用进行介绍。 磁性高分子微球的制备方法主要有包埋法、单体聚合法、原位法等。 1 1 1 1 包埋法 包埋法是运用机械搅拌、超声分散等方法使磁性粒子均匀悬浮于高分子溶 液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段制得磁性高分子微球。磁性粒子表 面与亲水性高分子之间存在一定的亲和力，所以若把磁性粒子浸泡于这些高分 予的溶液中，再经过乳化等处理过程，就可以在磁性粒子表面形成高分子壳层。 为了增加微球的稳定性，可用交联剂交联高分子壳层进行稳定化处理。天然高 分子磁性微球均采用这种方法制备。邱广亮【3 】以明胶包埋磁性氧化铁制备出稳 定的磁性明胶复合微球，又考察了磁性固定化酶最适合温度、p h 值等，指出磁 性固定化酶比自由酶的稳定性显著提高。 包埋法制备磁性高分予微球所需的条件简单，易于进行，但制得的磁性粒 子粒径分布宽，形状不规则，粒径不易控制，壳层中难免会有一些诸如乳化剂 之类的杂质，用于免疫测定、细胞分离等领域会受到很大限制。同时由于磁性 材料一般为亲水性颗粒，所以包埋的高分子一般也要为亲水性分子，否则很难 将磁性微粒完全包裹。这在一定程度上进一步限制了包埋法的应用【4 j 。 3 西华大学硕士学位论文 1 1 1 2 单体聚舍法 目前制备磁性复合微球的方法主要是单体聚合法。单体聚合法是先将磁性 粒子、单体、引发剂、稳定剂等的混合液通过均化器分散均匀，再在适当的条 件下进行聚合以制备核壳式磁性高分子微球。单体聚合法得到的载体粒径较 大，固载量小，但作为固定化酶的载体，有利于保持酶的活性，而且磁性也较 强。 聚合方法主要有：悬浮聚合、乳液聚合、分散聚合、可控自由基聚合等方 法。由于用悬浮聚合法制得的磁性微球在粒径分布、磁含量方面均不理想，给 固定化酶的分离带来影响。目前大都采用乳液聚合法和分散聚合法制备的磁性 微球担当固定化酶的载体。利用乳液聚合技术难以得到粒径大于l p m 的磁性微 球，当磁性高分子微球用于细胞分离、固定化载体的领域时，为了能在磁场下 快速分离，多希望利用大于1 岫的磁性高分子微球。而分散聚合对于合成大粒 径、单分散的磁性高分子微球具有得天独厚的优势，因此用分散聚合法合成的 磁性高分子微球很受欢迎【5 。很多有机单体疏水性很强，难以与磁核的亲水表 面紧密结合，所以往往要对磁微球表面进行预处理，使其表面具有一定的疏水 性，或者适当改变聚合体系的有机组成，以利于聚合的进行。n o g u c h i 6 】等用乳 液聚合法制备了磁性高分子微球，讨论了影响颗粒大小的因素及磁性微球完全 被包裹的条件。邱广吲7 报道了磁性聚苯乙烯微球的合成，得到了稳定性好、 单分散的磁性微球。该方法克服了传统的乳液聚合法难以找到的引发点，形成 理想的合成聚合场所的缺点。 1 1 1 3 原位法 该方法首先制得致密或多孔聚合物微球，此微球含有可结合铁、钴、镍、 锰等金属离子的基团( 如可与铁离子等形成配位键的一n h 2 、n h 、- n 0 2 等含氮 基团以及可与铁离子等形成离子键的c o o h 、s 0 3 h 、o h 等基团) ，随后依靠 高分子在金属盐溶液中的溶胀以及功能基团与金属离子的作用来制备磁性高 分予微球。如果含有n h 2 、- n h 、c o o h 等基团可直接加入合适比例的二价和 三价铁盐溶液，使聚合物微球在铁盐溶液中溶胀、渗透，再升高温度和p h 值， 制得磁性高分子微球；如果含有氧化性基团，可加入二价铁盐，使其氧化而得 4 西华大学硕士学位论文 到磁性高分子微球：如果含有还原性基团，可加入三价铁盐，使其还原而制得 磁性高分子微球。u g e l s t a n d t 8 】等用原位法制备出了磁性高分子微球，并开发了 系列商品化的产品d y n a b e a d s 。该产品己成功地应用于微生物学、分子生物学、 免疫学等诸多领域。 原位法的突出优点在于：磁性微球的粒径和粒径分布取决于聚合物微球本 身，因此磁性微球具有良好的单分散性；各微球的磁含量相同，在磁场下具有 一致的磁响应性；可制备磁含量大于3 0 的高磁含量微球。但也有其难于克服 的缺点：由于聚合物微球表面必须含有特定的功能基团，所以不适用于不含上 面提及的功能基团的聚合物：由于磁性无机粒子在聚合物微球的表面发生沉 积，所以最终制备出复合微球的表面不光，同时也限制了磁性复合微球的应用。 1 1 2 磁性高分子微球的性质 1 1 2 1 表面效应和体积效应 即比表面积效应。随着微球的细化，其粒径达到微米级甚至纳米级时，比 表面激增，表面能大大增加，微球官能团密度及选择性吸附能力变大。同时由 于粒径变小，超细微粒包含的原子数减少使带电能级加大，从而使吸附平衡的 时间大大缩短，粒子的稳定性大大提高。 1 1 2 2 磁效应 具有磁性可使生物高分子微球在外加磁场作用下方便地进行分离和磁性 导向。当磁性四氧化三铁晶体的直径小于3 0 r i m 时，其具有超顺磁性，即在磁场 中有较强磁性，没有磁场时磁性很快消失，从而使高分子微球能够在磁场中不 被永久磁化。 1 1 2 3 生物相容性 磁性微球在生物工程，特别是在生物医学工程中应用，有一个重要方面就 是要有生物相容性。多数生物高分子如多聚糖、蛋白质类具有良好的生物相容 性。 西华大学硕士学位论文 1 1 2 4 表面功能基团特性 在制备磁性高分子微球时，可以选择多种功能基团作为反应活性点，如 o h 、- c o o h 、- n h 2 。这些活性基团可连接具有生物活性物质，如免疫蛋白、 生物酶等【9 1 。 1 1 3 磁性微球用于酶的固定化研究 磁性高分子微球作为固定化酶的载体，具有以下优点：提高酶的稳定性， 易于将酶与底物和产物分离；提高酶的生物相容性和免疫活性；操作简便，可 降低成本：对于双酶反应体系，当一种酶的失活较快时，就可以用磁性材料来 固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本；磁性载体固载酶放入磁场稳定的 流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作； 利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械 搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。 在固定化酶体系中，磁性高分子微球可用作结合酶的载体，其固定化酶的 方法可分为：吸附法，交联法，共价法，碳化二亚胺法，包埋法等。 1 1 3 1 吸附法 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目 的的方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的 酶，便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。此 法操作简单，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使 用失活后可以重新活化和再生，但酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的 丧失和玷污反应产物。 邱广亮【l0 等用磁性琼脂糖复合微球做载体，采用物理吸附法，制备出磁性 固定化纤维素酶，简称磁性固定化酶( m i e ) 。m i e 既可稳定分散于水相中，又 可借助外部磁场方便简单地分离回收和磁性导向，因而为该酶在工业、医药、 食品、纺织品等方面的应用提供了新途径。安小宁【3 j 等采用壳聚糖包埋磁粉， 经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁性壳聚糖微粒。此微粒共价结合卵清 蛋白得到磁性亲和吸附剂，应用于胰蛋白酶的亲和纯化，纯化倍数为1 5 6 ，活 6 西华大学硕士学位论文 性回收率为4 1 2 。高艳春1 1 1 等以磁性聚乙二醇胶粒为载体，采用吸附交联法 制各具有磁响应性的固定化糖化酶，该固定化酶的活力可达1 7 0 9 5g 干胶，活力 回收率为6 3 ，酸、碱、热稳定性比游离酶大大提高。 1 1 3 2 交联法 交联法就是借助双功能团或多功能团试剂使酶分子之间发生交联作用，制 成网状结构固定化酶的方法。常用的双功能团试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯 二酸酐、双偶氮苯等。酶蛋白中的游离的氨基、酚基、咪唑基及巯基等均可参 与交联反应。其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛分子内的醛基可与酶蛋白的 游离氨基反应，形成席夫( s h i f t ) 碱而使酶分子交联【1 2 】。邱广明、邱广亮【1 3 】 等采用复合技术制备出粒径为1 0 0 3 0 0 n m 的磁性淀粉复合微球。以此为载体采 用溴化氰共价结合法、戊二醛交联法、物理吸附法固定化旺乙酰乳酸脱羧酶。 以戊二醛交联法制各的磁性酶为最佳。张寒飞【l4 等以磁性聚苯乙烯为载体，戊 二醛为交联剂制得的磁性固定化漆酶与底物亲和力显著提高，其热稳定性、贮 存稳定性$ 1 p h 稳定性较游离酶均有所增强。杜崇旭【”1 等以制备的磁性聚乙二 醇胶粒子为载体，戊二醛为交联剂，固定化辅酶维生素b 6 ，对固定化的条件进 行了探索，确定了固定化的最佳条件：室温下，o 0 3 9 磁性聚乙二醇微球与 5 m l ( 8 ) 戊二醛交联，固定0 0 1 9 辅助酶维生素b 6 ；振荡时间为1 2 h 。钱斯日古 楞【l6 】等以磁性淀粉微球为载体，采用戊二醛交联法固定化脂肪酶。磁性淀粉微 球的主要组成是淀粉和磁粉。结果得到，磁性固定化脂肪酶的总活力、蛋白载 量、比活、活性回收率、最适温度和最适p h 值分别为4 8 9 7 1 5 u g 、5 0 5 9 m g g 、 9 8 5 8 u m g 、7 2 7 3 、4 5 和8 0 。 1 1 3 3 共价结合法 共价结合法是利用酶蛋白分子上的非必需基团与载体反应，形成共价结合 的固定化酶的方法称为共价结合法。这时酶与载体结合非常牢固，不易发生酶 的脱落，有良好的稳定性和重复使用性，有利于保持酶的活性，而且磁响应性 也较强。 载体与酶形成共价键，可借助于某一方法，在载体上引进入活泼基团，然 西华大学硕士学位论文 后，此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。载体活化方法很 多，主要有：形成肽键法( 叠氮形成法、酸酐形成法、缩合剂法、酰氯法) 、烷 基化法或芳基化法、重氮化法、异脲键合法( 异硫氰酸法、溴化氰法、氰脲酰 氯法) 等。参加共价结合的氮基酸残基应当是酶催化活性所非必需的，否则会 导致酶活力损失。载体的物化性质对固定化酶也有很大影响。 任广智【l “等根据磁性壳聚糖微球表面含有大量烃基的特点，通过对这些烃 基进行活化，在微球表面引入环氧基团，然后和脲酶表面的氨基反应。共价结 合固定化脲酶。a m t k a 一1 8 等提议一种新形式，将脂肪酶共价固定在可逆溶胶 共聚物上，与把其固定在多孔固体载体上相比，其扩散容易，利于酶的重新使 用。a r i c a 0 9 1 等将环六亚甲基二胺( h m d a ) 连接在聚异丙烯酸甲酯( p m m a ) 磁 性微球表面，用c d i 或c n b r 激活后用于共价结合葡萄糖淀粉酶。吴颉【2 0 1 等制 备出磁性聚乙烯醇缩丁醛微球，并用该微球做载体，采用共价交联法固定淀 粉酶。磁性聚乙烯醇缩丁醛微球具有较大的酶和蛋白载量。所制磁性固定化酶 的稳定性优于自由m 淀粉酶，由于它具有磁性，可通过外加磁场方便地加以分 离。该微球是一种可用于工业化生产的优良载体。姜德生【2 1 l 等以磁性壳聚糖微 球为载体，戊二醛为交联剂，共价结合制备固定化漆酶。与游离酶相比，该固 定化漆酶热稳定性明显提高，并具有良好的操作和存储稳定性。 1 1 3 4 碳化二亚胺法 共价交联进行酶固定化的一类常用的方法是运用水溶性碳化二亚胺在 p h 4 7 5 p h 5 时与载体上的羧基起反应，使载体上产生大量高活性。一酰基异 脲衍生物。用于酶固定化的碳化二亚胺法有两种基本类型，目l j - - - 步法和一步法。 前者是先将载体用碳化二亚胺活化，洗涤后再加入酶，此法最为常用；后者是 将载体和酶混合在一起后加入碳化二亚胺进行酶的固定化。此外，尚有将酶先 用碳化二亚胺处理，此作用发生在酶蛋白的羧基，然后被固定到载体氨基上 2 2 1 。 k o n d o 2 3 1 等采用两步无皂乳液聚合的方法制备了热敏性磁性聚合物微球，并进 一步采用碳化二亚胺法将胰蛋白酶固定在微球上，实验结果表明，经过这种微 球固定的胰蛋白酶仍具有非常高的活性。国内邱广明【2 4 等采用改进的乳液聚合 制备了表面带有羧基的磁性聚合物微球，采用碳化二亚胺法在磁性微球表面固 8 西华大学硕士学位论文 定中性蛋白酶，制各活性高达7 0 0 u g ；缓冲溶液p h = 6 0 、离子强度较高时， 固定化酶的活性最高。 1 1 _ 3 5 包埋法 包埋法是酶在载体中发生聚合、沉淀，并被物理包埋于高聚物网格内的方 法，一般反应条件温和，对酶自身的结构改变很少，因此酶活性损失较小，固 定化效率较高。y o s l l i m o t 0 嘲等在用过氧化氢还原三价铁离子合成f e 3 0 4 磁流体 时，以、一二羧甲基聚乙二醇作分散剂，然后用n 羟基琥珀酰亚胺法活化 磁性微球，将微球和脂肪酶或卜一天门冬酰胺酶的磷酸缓冲液混合后，室温下 搅拌1 h ，得到的磁性固定化酶很容易从反应混合物中回收，并且没有酶的活性 损失。 1 1 4 应用前景 作为一种新型载体，磁性高分子微球具有良好的应用前景。它受到了各国 学者的高度重视，得到了广泛的研究。但对磁性高分子微球的基础理论研究却 略嫌不足。如磁性高分子微球的形成机理、磁性高分子微球的磁性起源、结构 和性能的关系等，由此限制了磁性高分子微球的工业应用。因此在以下方面有 待进一步探索：完善不同结构的磁性高分子微球的形成机理，如制备方法和反 应参数间的关系等；探讨磁性高分子微球的磁性起源、结构和性能的关系，无 机物间、无机物与聚合物问的磁相互作用；深入研究磁性高分子微球的物理性 质，尤其是磁性能。更深入地研究磁性高分子微球的基础理论及尽快使已取得 的成果由实验阶段进入应用阶段，将成为今后磁性高分子微球研究的重点。 目前制备磁性微球的技术还没有发展得很成熟，还有很多问题没有得到很 好的解决：如何得到具有强磁响应性和高比表面的磁性高分子微球，如何解决 磁性复合微球的生物相容性问题，如何探索更好的制备磁性复合微球的方法， 如何调节磁性载体表面特性、提高固定化酶在实际操作条件下的稳定性等等也 都是今后研究工作的重点。 从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为高分子载体、无 机载体，复合载体等。目前这几种固定化酶载体材料各有优缺点。如天然高分 9 西华大学硕士学位论文 子材料作为载体材料时具有无毒性、传质性能好等优点，但材料强度较低；合 成有机高分子材料在作为载体材料时具有很强的灵活性，但传质性能较差；无 机材料稳定性好、机械强度高、成本低，但用于固定化酶时，固定化率均比较 低。与这些固定化材料相比，磁性微球具有在分离上的巨大优势，易回收、操 作简便、成本较低。因此，用磁性微球作为固定化酶载体是固定化载体材料发 展的必然趋势。 1 2 酶的固定化技术及载体材料 1 2 1 酶的固定化方法及研究进展 1 2 1 1 酶的固定化方法 近年来，细胞固定化技术、固定化多酶技术及反应器、固定化微生物多酶 反应系统、固定化酶一微生物复合物等技术相继发展起来，而酶的固定化是这 一发展的基础。以往报道酶的固定化方法有几百种，切实可行的主要包埋法、 吸附法、共价法、交联法等。 包埋法 交蘩法 吸附溘热价按 f i 9 1 1m e t h o d so f e n z y m ei m m o b i l i z a t i o n 图1 - 1 酶的固定化方法示意图 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中。这样 可以防止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶接触。此法较为简便、酶 分子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用【3 3 】。 1 0 殖华大学硕士学位论文 吸附固定是最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和 氢键。此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 共价法是酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形 成共价键连接的方法。其优点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反 应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻。 交联法使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应。生成不溶于水的 二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，都是 靠化学结合的方法使酶固定化。其区别在于交联法使用了交联剂，常用的交联 剂有戊二醛、鞣酸。 1 2 1 2 酶的固定化研究进展 酶固定化的研究进展主要体现在以下几个方面： 新载体的研制异常活跃，如：纤维素、淀粉、黄原胶、几丁质、海藻酸盐、 壳聚糖、虾青素、琼脂糖、戊二醛、血纤维原、磁性高分子聚合物、离子交换 树脂、水合氧化钛和膜等【3 2 】。 新方法。随着天然酶的开发和工程菌的改造，传统固定化方法不断被应用 到新酶的固定化研究上，同时酶固定化技术也不断取得进展，一些新技术如磁 性技术、分子沉淀技术及辐射技术等不断运用于固定化酶载体的制备。 新机理。酶的固定化技术经过几十年的研究已经发展成为酶定向固定化技 术，研究表明已经有几条途径使酶蛋白能够以有序的方式附着在载体表面，从 而避免了酶蛋白的多点附着引起的无序定向和结构变形，实现了酶的定向固定 化，使酶活性损失降低到最小程度。目前采用的方法主要有借助化学、磷蛋白、 抗体、糖蛋白和基因工程的位点专一性固定化等。这种有序的定向固定化技术 已广泛用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和 层析以及蛋白质结构和功能的研究。 1 2 2 固定化酶的制备原则 固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于固定化制各的物理、 化学手段及材料等多种多样。制备固定化酶要根据不同情况( 不同酶、不同应 西华大学硕士学伉论文 用目的和应用环境) 来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方 法，都要遵循几个基本原则【2 q ： 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶的催化反应取决于酶蛋白质分子 所特有的高级结构和活性中心。酶的活性中心是由一定的氨基酸残基所构成 的，是酶的催化功能所必需的，酶蛋白的空间构象与酶活力密切相关。酶在固 定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使活性中心的氨基 酸残基不发生变化。因此，在酶的固定化过程中，必须注意酶活性中心的氨基 酸残基不发生变化，也就是酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且 要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、 有机溶剂等