（分析化学专业论文）用于细胞内生物活性分子检测的含硒新型荧光探针的研究与应用.pdf

山东师范大学硕士论文 摘要 生命活动是由各种生物活性物质参与的，相互关联、相互制约的众多化学反 应的总结果。许多生物活性物质可以与氨基酸、蛋白质或其它有机基团结合，发 挥重要的生物学作用、特殊的生理功能和高度的生化效应。 近年来，检测细胞中生物活性分子的研究越来越多，荧光法不仅简单易行， 便于操作，还具有高灵敏度、高选择性和广泛可用的荧光染料的特点。更加吸引 人的是探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞，与活细胞内的生物活 性分子等结合生成强荧光物质，并借助于激光共聚焦成像技术，实现细胞内待测 活性分子的“可视化”，从而对它们在生命体内进行“实时在线”的检测。最近，生 物成像在活细胞的生物分子检测上取得了巨大进展，而荧光探针由于具有高灵敏 度，实时监测等优点成为生物成像最主要的工具。 本论文基于荧光探针与生物活性分子特异性作用后荧光光谱性质的改变从 而实现对特定物质的检测，并将所设计探针成功用于生物活体细胞的共聚焦显微 成像。本论文主要开展了以下三方面的研究工作： ( 一) 用于检测硫醇的有机硒新型荧光探针的设计与合成。 受谷胱甘肽过氧化物酶类似物e b s e l e n 的启发，我们将与含巯基类物质发生 特异性反应的硒氮键引入荧光染料，设计合成了一种以罗丹明1 1 0 为母体的含有 硒氮键的新型荧光探针用于识别巯基化合物，并用i r , 1 h n m r ，1 3 c n m l l 7 7 s e - n m r 和m s 对其进行了表征。该探针合成简单、条件温和、产率高，而且产 品稳定( 在- 4 冰箱中放置三个月无任何变化) 。 ( - - ) 用于检测硫醇的有机硒新型荧光探针的分析研究及在细胞成像中的应 用。 在模拟生理条件下对探针的光谱特性进行了检测。该探针试剂本身没有荧 光，与硫醇类物质反应后，硒氮键被打断，形成罗丹明1 1 0 强荧光的开环结构， 荧光增强1 7 0 倍。探针的激发和发射波长分别为4 9 9n m 和5 2 2n m 。该探针能够高 选择性的检测硫醇类物质，活性氧( r o s ) 、金属离子、生物胺及其他抗氧化剂 不干扰测定。在0 0 1 5 1 0g m 范围p i j g s h 的浓度与荧光强度成很好的线性关系， 方法的检测限为1 4 4p m 。h l 7 7 0 2 人正常肝细胞及h e p g 2 人肝癌细胞内巯基类物 山东师范大学硕士论文 质的荧光共聚焦成像实验表明：探针具有膜穿透性，能够对两种细胞内巯基类物 质的含量差异产生响应，表现了良好的生物适用性。 ( - - ) 一种用于检测过氧亚硝基自由基的荧光探针的设计及合成。 关键词：有机硒荧光探针，硫醇，合成，激光共聚焦显微成像，活性氧自由基， 过氧化亚硝基自由基 2 山东师范大学硕士论文 a b s t r a c t t h ep r o g r e s so fl i f ei sat o t a lr e s u l to fm a n yr e l a t i v ec h e m i c a lr e a c t i o n sw h i c ha n u m b e ro fb i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e st a k ep a r ti n m a n ya c t i v es u b s t a n c e sc a l l c o m b i n ew i t ha m i n oa c i d ，p r o t e i no ro t h e rb i o l o g i c a lm o l e c u l e s ，a n dp l a yi m p o r t a n t b i o l o g i c a la c t i o n , s p e c i a lp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o na n dh i g hb i o c h e m i c a le f f e c t s n o w a d a y s ，m o r ea n d m o r es t u d i e sf o c u so nd e t e c t i n gb i o a c t i v em o l e c u l e s a m o n g t h e s em e t h o d s ，u s i n gf l u o r e s c e n tp r o b e sh a sm a n ya d v a n t a g e ss u c ha sh i 【g hs e n s i t i v i t y , l l i 曲s e l e c t i v i t y , e a s yt oo p e r a t e ，a n dt h ea v a i l a b i l i t yo fa w i d er a n g eo fi n d i c a t o rd y e s w h a ti sm o r ea t t r a c t i v ei st h a tf l u o r e s c e n tp r o b e sc a np e n e t r a t ei n t oc e l l sw i t h o u ta n y d a m a g e ，a n dc o m b i n e 埘血b i o a c t i v em o l e c u l e s t of o r m s t r o n g l y f l u o r e s c e n t s u b s t a n c e w i t ht h eh e l po fc o n _ f o c a lm i c r o s c o p i ci m a g i n g ，v i s u a l i z i n ga n dr e a l t i m e d e t e c t i n go fb i o - a c t i v em o l e c u l e sc a nb ea c h i e v e d r e c e n t l y , i m a g i n go fl i v i n gc e l l s h a sm a d eg r e a tp r o g r e s s ，a n df l u o r e s c e n tp r o b eh a sb e c o m et h em o s ti m p o r t a n tt o o l b e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e s b a s e do nt h ec h a n g e si ns p e c t r u mc h a r a c t e r so ft h ef l u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i n gw i t l l b i o - a c t i v em o l e c u l e s ，w eh a v ea c h i e v e dt h ed e t e c t i o no ft h e s ei n g r e d i e n t s t h e d e s i g n e df l u o r e s c e n tp r o b e sw e r ea l s oa p p l i e dt oc o n f o c a li m a 百n go fs e v e r a lk i n d so f c e l l s w eh a v ec a r d e do u tt h r e ea s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，t h i sp a p e rp r e s e n t e dt h ed e s i g na n ds y n t h e s i so fo r g a n o s e l e n i u mf l u o r e s c e n t p r o b ef o rt h i o l s i n s p i r e db ye b s e l e n ，t h ew e l lk n o w n m i m e t i co fg p x ，w e d e s i g n dt oi n t r o d u c et h e s e l e n i u m n i t r o g e nb o n dw h i c hr e a c t sw i t ht h i o l s t of l u o r e s c e n c ed y e s an o v e l r h o d a m i n e110 - b a s e df l u o r e s c e n tp r o b ec o n t a i n i n gas e - nb o n df o rd e t e c t i n gt h i o l s w a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，a n dc h a r a c t e r i z e db yi r , 1 h - n m r ，1 3 c - n m r , 川s e - n m ra n dm s t h ep r o b ew a ss y n t h e s i z e di nh i 曲y i e l da n dw a ss t a b l eo v e r3 m o n t h sw h e nk e p ti nar e f r i g e r a t o ra t - 4o c s e c o n d ，t h i sp a p e rp r e s e n t e dt h ea n a l y s i sa n da p p l i c a t i o no fo r g a n o s e l e n i u m f l u o r e s c e n tp r o b ei nv i t r oa n di nv i v o t h es p e c t r a l p r o p e r t i e so ft h ep r o b ew e r et e s t e d i ns i m u l a t e dp h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n t h ep r o b ew a sn o n f l u o r e s c e n ti nt h ef o r mo fr h o d a m i n e110s p i r o l a c t a m u p o ns e l e c t i v er e a c t i o nw i t ht h i o l s ，s e - nb o n di s c l e a v e da n ds t r o n gf l u o r e s c e n c e g e n e r a t e s ，a c c o m p a n y i n gaf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ye n h a n c e m e n th i g h e rt h a n17 0 - f o l d 3 山东师范大学硕士论文 ( a 味) i 锄= 4 9 9 5 2 2r i m ) t h ep r o b ef e a t u r e se x c e l l e n ti m m u n i t yt oi n t e r f e r e n c e s ， i n c l u d i n g r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) ，m e t a li o n s ，b i o a m i n e sa n db i o l o g i c a l a n t i o x i d a n t s t h e r ew a sa9 0 0 dl i n e a r i t yb e t w e e nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya n dg s h c o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g eo f0 0 15t o1 0 州t h ed e t e c t i o nl i m i to f14 4p mw a s a c h i e v e d c o n f o c a lm i c r o s c o p ye x p e r i m e n t si nb o t hh l - 7 7 0 2c e l l sa n dh e p g 2c e l l s s h o wt h a tr h - - s e 2c a nv i s u a l i z ed i f f e r e n c ea n dc h a n g e si nt h i o l sc o n c e n t r a t i o n si n n o r m a la n da b e r r a n tc e l lt y p e s ，a l l o w i n gas i m p l ea n dr e l i a b l ef l u o r o m e t r i cs y s t e mf o r i n t r a c e l l u l a rt h i o l sa n a l y s i s t h i r d , t h i sp a p e rp r e s e n t e dt h ed e s i g na n ds y n t h e s i so fa no r g a n o s e l e n i u m f l u o r e s c e n c tp r o b ef o rp e r o x y n i r t e k e y w o r d s ：o r g a n o s e l e n i u m f l u o r e s c e n t p r o b e ，t h i o l s ，s y n t h e s i z e ，c o n f o c a l m i c r o s c o p i ci m a g i n g ，r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，p e r o x y n i r t e 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：尹俊足 勖腌寺弋凯l 乏 导师签字： 、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂拉有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：尹饮灭- - 7 副潜协、，乏导师签字：、 签字日期：2 0 0 9 年y 月3 1 日签字日期：2 0 0 9 年y 月司日 山东师范大学硕士论文 第一章绪论 第一节硒的生物作用简介 硒是人体必需的微量元素，是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂。1 9 5 3 年s c h w a r t z 发现s e 能使大鼠免遭膳食性的肝坏死，并提出s e 是机体不能缺少的一 种微量元素。我国科学工作者经过多年的协同研究，于1 9 7 3 年首先提出s e 与克山 病的发生有密切关系，并进行了大量的临床干预研究，取得了显著的成效，从而 肯定了s e 是人体必不可少的一种微量元素，这些工作引起国际上学者的广泛关注 和肯定。世界卫生组织( w h o ) 于1 9 7 3 年确认硒为人体必需的第一类( 包括碘、 锌、铜、钼、铬、钴、铁) 微量元素【i 】。硒的生物学作用主要包括以下几个方面： 1 参与酶的催化反应：硒蛋白作为哺乳动物酶系统的基本成分，促使正常代 谢过程中产生的有毒过氧化物分解，防止其堆积，进而保护细胞中重要的膜结构 不受损害；直接参与膜磷脂氢过氧化物的还原，从而达到保护生物膜的目的。 2 增强机体免疫力：硒能促进淋巴细胞产生抗体，使血液免疫球蛋白水平增 高或维持正常，增强机体对疫苗或其他抗原产生抗体的能力。硒能增强淋巴细胞 转化和迟发型变态反应( t d h ) ，能增强吞噬细胞的功能。缺硒时淋巴细胞对有 丝分裂原刺激的反应下降，使动物多形核白细胞( p m n ) 内谷胱甘肽过氧化物 酶( g s h p x ) 的活性降低，h 2 0 2 积聚，脂质过氧化物增多，抑制葡萄糖脱氢酶 的活性，破坏了磷酸戊糖途径，n a d p h 不能及时产生，而导致p m n 杀菌力减弱。 3 参与阻断自由基反应：过氧化脂质物( l p o ) 是机体自由基反应的主要产 物，而且l p o 能导致生物膜损害。g s h p x 和磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物 酶( p h g p x ) 是人体内阻断自由基反应，清除其反应产生的有毒产物l p o 的重 要物质，而硒是g s h p x 和p h g p x 的活性成分。 4 硒是体内拮抗有毒物质的保护剂：硒在人和动物体内能保护组织免受有毒 物质的侵害，对机体中的有害金属元素起拮抗作用。大量动物实验结果显示：硒 可拈抗许多有毒金属元素的毒性，硒在多方面、多水平拮抗镉的毒性，抑制镍的 诱癌作用，抑制砷的毒性和致畸性，预防甲基汞中毒，还可降低铅、氟、顺铂、 银等的毒性作用。 5 抗癌作用：硒的抗癌作用表现在以下几个方面：1 ) 抑制癌细胞生长及其 d n a 、r 3 q a 和蛋白质的合成，抑制癌基因的转录。2 ) 干扰致癌物质的代谢。某 山东师范大学硕士论文 些致癌物质必须在体内代谢为中间产物后才具致癌性，硒可使催化中间代谢产物 生成的酶活性降低，使清除中间产物的酶活性增强。3 ) 抗氧化作用。许多化学 致癌剂和放射性物质致癌均与自由基形成有关。机体在代谢过程中产生大量自由 基，这些自由基可启动生物膜的脂质过氧化反应，使膜的结构和功能遭到破坏而 导致癌变。硒是g s h p x 和p h g - p x 的必需成分，这两种酶均具有很强的抗氧化作 用，可以清除自由基，使生物膜免受损伤。4 ) 对免疫系统的影响。硒能提高机 体的免疫功能，增强机体的抗癌能力。 硒的生物效应是多方面的，其中最重要的是硒的抗氧化性，硒的抗氧化性主 要是针对活性氧自由基及其衍生物。硒化物的抗氧化作用可能包括以下五个方 面：1 ) 清除脂质过氧化中间产物；2 ) 分解脂质过氧化物；3 ) 修复水化自由基 ( h o 、h 等) 引起的硫化物的分子损伤；4 ) 在水化自由基破坏生命物质之前将 其清除或转变为稳定化合物；5 ) 催化巯基化合物作为保护剂的反应【2 】。 硒的抗氧化分为酶和非酶两类，其中非酶硒化合物的研究是目前研究的熟 点。e b s e l e n ( 2 苯基1 ，2 苯并异硒唑3 ( 2 h ) 酮) ( 图1 ) 是目前研究最广泛的含 硒化合物，它具有与g p x 相似的酶活性，毒性低，抗氧化作用型引。 r c ) o h g s h 图1e b s e l e n ( 1 ) 结构式及其抗氧化机理 本论文受e b s e l e n 启发，将能够被硫醇特异性打断的s e - n 键引入荧光团，设 计合成了以罗丹明1 1 0 为母体的的含有s e - n 键的新型荧光探针用于识别巯基类化 合物。 6 山东师范大学硕士论文 第二节生物活性分子卅( 硫醇) 的生理作用及其检测技术简介 生物体是由各种不同的化学物质组成的，这些物质及其复杂的化学组成、结 构及化学变化构成了千姿百态的生命现象。随着生物化学与分子生物学的发展与 各种物理、化学、生物学的研究手段的应用，使生物体内的化学反应过程逐渐得 到阐明。在生物体中，各种生物活性物质是细胞、组织和器官不可缺少的组成部 分，并且参与细胞增殖与分化、生命遗传、细胞新陈代谢等活动。因此，生命活 动是许多具有生物活性的物质参与的各种化学反应的总结果。生物分子是生物体 最重要的组成部分，约占生物体质量的三分之一以上。生物分子是生物体和生命 现象的结构基础和功能基础，是生物化学研究的基本对象。因此，在生命科学的 研究中，对核酸、蛋白质、肽等生物活性分子的研究占有重要的地位。 目前生物体内还原性物质研究较多的是含巯基的物质，即硫醇类物质。硫醇 是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重 要的作用【5 “】。硫醇包括小分子硫醇和大分子硫醇。小分子硫醇包括半胱氢酸 ( c y s ) 、谷胱甘肽( g s h ) 、硫辛酸和辅酶a ；大分子硫酵包括含巯基的多肽、 酶和生物膜。大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化 还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反应以及辅酶a 参与的反应等【_ 7 1 。谷胱 甘肽( g s h ) 是细胞内含量最高的小分子硫醇( 1 1 0m m o f l ) s q o ，它存在氧化 型谷胱甘肽( g s s g ) 和还原型g s h 的氧化还原动态平衡【1 1 1 。大量资料显示【1 2 16 】， 谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起 着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此， 定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。 目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法【m 1 9 1 、电化学法 1 2 0 - 2 2 1 、荧光法等。荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、 动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化 示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段。本文按荧光 探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较详细介 绍。 1 利用巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针 1 1 利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇 7 山东师范大学硕士论文 利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马 来酰亚胺类衍生物。马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室 温下p h5 8 时几分钟即可完成。k a n a o k a 发现包含氮取代的马来酰亚胺类的大 多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有 强荧光的加成产物2 劓。k a n a o k a 于1 9 7 0 年开发了第一个比较实用的马来酰亚 胺类荧光试剂1 ，1 是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧光试剂1 ，缺点是 激发和发射均处于紫外区，且水溶性差。经过对荧光发射团系统的研究后k a n a o k a 又进一步开发了波长较长水溶性较好的2 啪1 ，2 的激发和发射波长分别为4 0 0n m 和4 8 0n m ，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲 氨基基团。1 和2 被称为k a n a o k a 试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质 中的巯基活性点。近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发一3 ， 用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的g s h 、c y s 等具有重要生物学意 义的小分子硫醇。 q p 札n h 爿f h ，c k ( c 2 h 5 ) 2 n -z 3 1 9 9 5 年5 个以苯并香豆素( n a p h t h o p y r a n o n e ) 为母体荧光团的氮取代的马来酰 亚胺类硫醇荧光探针4 。8 r l a n g m u i r 嬲t t 2 7 】设计合成，这些探针与一些小分子 硫醇立f l g s h 、c y s 等在生理p h 条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白 不干扰测定。l a n g m u i r 等将这五个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针3 【2 s 】比较， 研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量 子产率显著增大( 其中8 荧光量子产率变化最大0 0 1 2 - 0 6 6 ) ，是比3 ( 0 0 2 1 - - 0 1 3 ) 更为灵敏的探针。 4 5 r = a o 6r = m e 78 o 山东师范大学硕士论文 2 0 0 2 年，武汉大学张华山课题组设计合成探针5 - m a l e i m _ i d y l 2 锄m e t h y l p h e n y l ) b e n z o x a z o l e ( m m p b ) 【2 9 姗，与其它马来酰亚胺类探针相比， 由于m m p b g s h 和m m p b c y s 荧光性质的不同，该探针可以实现对g s h 和 c y s 的选择性响应。在激发和发射波长分别为2 9 9 21 1 1 t i 和3 5 5 8 皿时，m m p b 可以 选择性的检钡u g s h ，在含有0 4 倍的c y s 的情况下对g s h 的检出限可达3 2 3 x 1 0 1 0 m o l l ，其它氨基酸1 0 0 倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于人的血液、猪肝 和猪心中g s h 含量的测定；在激发和发射波长分别为3 0 5 6n m 和4 2 5 6r i m 时， m m p b 还可选择性的检；澳l j c y s ，在同时存在o 1 5 倍的g s h 的条件下对c y s 的检出限 可达6 2 x 1 0 1 0 m o l l ，其它氨基酸1 0 0 倍存在时不干扰测定。该探针被成功用于蛋 白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液 c y s l 捌定，回收率高、重现性好。该探 针虽然可以实现对g s h 和c y s 的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中 背景荧光干扰比较大。该课题组2 0 0 5 年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探 针9 【3 1 1 ，激发和发射波长分别为4 0 1n l l l 和4 9 6n m 。9 用于检钡f j c y s 线性范围 1 o x l o - s - - , 6 0 x 1 0 m o l l ，检出限5 7 x 1 0 毋m o l l ；检测g s h 线性范围 6 0 x 1 0 母 4 0 x 1 0 m o l l ，检出限5 6 4 x 1 0 一m o l l 。9 被成功应用于检测人血清和血 浆中的g s h ，人尿液中的c y s ，回收率9 6 2 1 0 3 0 。9 用于检测巯基类物质简 单快速、可行性强，3 5 时1 5m i n l i p 可反应完全，且与前一个探针m m p b 相比 波长较长，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰。 91 0 n a g 趾。课题组【3 2 1 - t 2 0 0 7 年设计合成了基于p e t ( 光诱导电子转移) 机理的绿 色荧光探针o m a l e i m i d e b o d i p y ( 1 0 ) ，该探针的荧光被供体b o d 口y 到受体 m a l e i m i d e 的激发态光致电子转移过程( d p e t ) 强烈猝灭，与硫醇类物质反应后 荧光团b o d i p y 的荧光恢复，荧光增强3 5 0 倍，反应前后荧光量子产率变化比较 山东师范大学硕士论文 大( 0 0 0 2 - 0 。7 3 ) 。该探针是目前所见的马来酰亚胺类硫醇荧光探针中除荧光素马 来酰亚胺( f l u o r e s c e i n 5 m a l e i m i d e ) 外，唯一一个在可见光区激发和发射的探针， 且信噪比远高于f l u o r e s c e i n - 5 - m a l e i m i d e 冽( 荧光增强倍数仅有十倍，荧光量子产 率变化为0 0 6 - 4 ) 6 4 ) 。探针1 0 可以用来清楚定量地标记极低浓度的牛血清蛋白 ( 牛血清蛋白最低浓度为5m g l ) 。探针1 0 由于激发和发射波长均处于可见光区， 可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰，但是仍没有应用到细胞内进行 检测。到目前为止，该类探针应用于细胞内成像的还未见报道。 氮取代的马来酰亚胺基团对硫醇类物质选择性好、灵敏度高，是很好的检测 硫醇的活性基团。因此，改善传统荧光团，开发长波长、长寿命以及双光子激发 的氮取代的马来酰亚胺类荧光分子探针，使其更适用于生物活体内检测硫醇或标 记硫蛋白，是今后该类探针发展的一个重要方向。 2 0 0 7 年a i m 等【蚓采用固相文库合成法合成出一系列的罗丹明类荧光化合物， 并从中筛选出可高选择性的与谷胱甘肽响应的荧光探针1 1 ，1 1 在生理条件下( p h 7 4h e p e s 缓冲液中) 与g s h 发生亲核加成反应使荧光增强，3 0 曲即可达荧光最 高点，荧光最大增强1 1 倍，荧光量子产率由0 0 3 3 升高到o 2 8 。g s s g 无荧光增强 现象，包含巯基的其它分析物( 例如d d t 、巯基乙醇、c y s ) 有荧光弱增强现象 但是不影响测定。探针被成功应用于实时检测活的成肌细胞( 3 t 3c e l l s ) 中的g s h 浓度的变化，通过加入增加细胞i 为g s h 浓度的硫辛酸和减少g s h 浓度的n m m ， 发现荧光强度发生显著变化，证明其探针能够对细胞i 为m m o l l 的g s h 产生响应。 1 2 利用巯基对缺电子芳环的亲核取代反应( a r s n ) 检测硫醇 2 0 0 5 年m a e d a 等【3 5 】以荧光素为母体荧光团，设计合成了2 个荧光素磺酸酯的 硫醇荧光探针1 2 和1 3 ，2 , 4 二硝基苯磺酰基( d b s ) 强吸电子作用将荧光素的荧 光猝灭，由于巯基的强亲核作用发生a r s n 反应，磺酸酯键断裂，荧光团母体结构 恢复，荧光增强。探针与g s h 反应在3 7 生理条件( h e p e sp h7 4 ) 下，1 0m i n 即达到荧光最大值，探针1 2 和1 3 的反应速率分别为1 7 x 1 0 2m o l ( l s ) 和1 4 x 1 0 2 m o l ( l s ) ，检出限可达p m o l l 。探针虽然在水溶液中存在水解副反应，但对测定 影响不大( 3 7 生理缓冲液中lh 探针1 2 和1 3 分别仅水解0 7 和1 1 ) 。 1 0 山东师范大学硕士论文 佾鸸 、八c 0 2 h 、八c 0 2 h p 撅：一黥。胀。 1 2 ：r = h1 3 。r = c h 3 z h a n g 等 3 6 】在2 0 0 7 年设计合成了一个在可见区激发的荧光增强型的可选择 性检测半胱氢酸( c y s ) 和同型半胱氨酸( h e y ) 的探针1 4 ，该探针激发和发射 波长分别为4 6 5n m 和5 8 8n m ，荧光最大增强可达7 5 倍，更为突出的是该探针可用 作c y s 和h e y 的裸眼探针，自 i n c y s 或h e y 后溶液颜色发生明显变化( 由黄绿色变 为橘红色) ( 图2 ) 其它1 8 种氨基酸无明显颜色变化。探针利用巯基的亲核性， 温和条件下( 2 5 ，v ( 甲醇) ：v ( h e p e s 缓冲液，出7 0 ) = 7 ：3 ) 反应1 0 r a i n 即可完成，由于位阻效应其它硫醇在此条件下几乎不发生反应。a c c m 细胞激 光共聚焦成像实验显示探针膜渗透性好，可以显示c y s 和h c y 亚细胞分稚。更为 突出的是该探针可用于双光子荧光成像，可以极大地减小对细胞的光损伤、提高 光穿透的深度、降低细胞内本体自发荧光的干扰。 + h 3 c 0 0 “! ! ：掣 o 。簿n 铲。 图21 0p m o l l 探针和1 0l a m o t l 探针口 丹荆邪 口氮酸，半胱氪簸，谷就甘肚，同型半胱氟 酸，谷氨酸，色氨酸，精氨酸，异亮氨酸，天冬氨酸丝氪酸甘氨酸，缬氮酸亮氨酸，天冬 酰胺酸，酪氨酸，蛋氧酸，脯氯酸，赖氮酸，苏氮酸和组氩酸颜色的变化( 按从左到右，从下 到上的顺序) ” 同年j 1 a 1 1 9 等 3 7 1 利用荧光i 羽n b d ，c l 设计合成了一个利用磺酰胺检测硫醇的荧 光探针1 5 ，由于烷基硫醇与苯基硫酚p k a 的不同( 分别为85 和65 ) ，中性条件下 烷基硫醇几乎不能电离而苯基硫酚能够丈部分电离，电离出的巯基负离子的亲核 山东师范大学硕士论文 性远大于巯基，因此该探针在中性条件下可以选择性的检测苯基硫酚，烷基硫醇 不干扰。探针1 5 由于分子内电子转移( i c t ) 使母体荧光团的荧光猝灭，由于苯 基硫酚中性条件下电离出的巯基负离子具有强亲核性，与2 ，4 _ 二硝基苯发生a r s n 反应使磺酰胺键断裂，i c t 受阻荧光恢复。该探针灵敏度高( 与苯基硫酚反应可 产生5 0 倍的荧光增强) ，选择性好( 半胱氨酸、谷胱甘肽、烷基硫醇以及其它具 有亲核性的胺、氰根等不干扰测定) ，条件温和( 室温下p h7 3 磷酸缓冲水溶 液中1 0m i n 反应基本完成) ，是第一个可以选择性的检测苯基硫酚而烷基硫醇不 干扰的荧光探针。由于苯基硫酚是一类高毒性的环境污染物，在石油和煤的精炼 厂、橡胶和塑料工业中都会产生大量的苯硫酚污染物，因此能够选择性的检测高 毒性的苯基硫酚在环境科学中具有重要意义。 n 0 2 n 0 2n 0 2 1 5 1 6 2 0 0 8 年b o u f f a r d 掣3 8 1 开发了一个红色的荧光增强型的磺酰胺荧光探针1 6 ，由 于i c t 过程探针分子本身的荧光很弱，与硫醇反应后磺酰胺键断裂，吸收光谱红 移1 5 8n m ，荧光增强1 2 0 倍。探针成功用于小鼠胚胎纤维原细胞( 3 t 3c e l l s ) 成 像，由于探针的发射波长位于近红外区( 6 2 3r i m ) ，b o u f f a r d 等在文中指出，该 探针具有在小动物的活体内成像的潜能。探针缺点在于本体荧光团在水溶液中的 荧光量子产率非常低，仅为0 0 1 ，作者在检测时是通过加入1 的人血清蛋白将其 荧光量子产率提高到o 2 4 。 同年s h i b a t a 等【3 9 】设计合成了一个罗丹明磺酰胺测硫醇的荧光探针1 7 ，该探针 基于罗丹明开环闭环结构的变化，探针本身无荧光，与硫醇类物质反应后磺酰胺 键断裂，罗丹明1 1 0 的强荧光结构恢复，荧光增强5 8 0 0 倍。探针1 7 成功用于人乳 腺癌细胞( h e l ac e l l s ) 共聚焦成像，证明该探针膜渗透性好、可以对活细胞内 硫醇浓度的变化产生响应。 1 2 山东师范大学硕士论文 叫杏n o 昏 ， 0 2 n n 一蔓奄慨 n - 音飞沪2 o 一 1 7 2 利用巯基与二硫键的氧化还原反应检测硫醇的荧光探针 生物体内存在巯基和二硫键的氧化还原动态平衡，因此可以利用巯基和二硫 键的作用来设计检测硫醇的探针。基于s s 键与巯基的选择性响应，近年来开发 了4 个可用于生物体内检测硫醇的s s 键荧光探针。 2 0 0 6 年p u l l e l a 等【加】利用荧光共振能量转移原理( f r e t ) 设计合成了可用于 细胞成像的检测巯基的荧光探针d s s a ( 1 8 和1 9 ) ，该探针以荧光素( d ，d o n o r ) 和 罗丹明b ( a ，a c e e p t o r ) 作为荧光供受体对，中间以二硫键连接。由于荧光素的 发射光谱和罗丹明的激发光谱的有效重叠，荧光素的荧光被猝灭，与硫醇反应后 二硫键断裂，供受体荧光团分离，荧光素的荧光恢复，通过检测荧光素荧光强度 的变化来检测硫醇浓度的变化。探针的优点在于还原电势低( p = - 0 6v ) ，不会 引起细胞内的氧化损伤，探针被成功用于斑马鱼胚胎显微成像。 e t n ， e t i e t 、n 1 8 l e t e i s 、s h s 村矿u 湖h h 一 1 9 p i g g o t t 等 4 1 】利用f r e t 原理设计合成了f s s f ( 2 0 ) ，该探针根据荧光素本身 发射光谱和吸收光谱的重叠，将两个荧光素分子作为供受体对，中间以二硫键连 山东师范大学硕士论文 接，探针被成功用于检测g s h 及谷胱甘肽还原酶( g r ) 的活性。p i g g o t t 等在文中提 到，该探针足够灵敏，用于活细胞中实时检测g s h 、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽 转移酶的活性是切实可行的。 h 曰 h 科从s - s v n f ；jh h p i r e s 等【4 2 】于2 0 0 8 年基于二硫键设计合成了探针2 1 ，探针由于形成内酯的非 共轭结构本身无荧光，当与硫醇类物质反应后，硫醇还原二硫键使其断裂，暴露 出强亲核性的巯基负离子，巯基负离子进攻邻近的氨基甲酸盐使酰胺键断裂，罗 丹明11 0 的强荧光结构恢复。为了证明氨基甲酸盐的稳定性，作者合成了对照化 合物2 2 ，实验发现在2 2 的溶液中加入硫醇没有荧光增强现象产生，通过对照实验 证明了与硫醇反应的官能团是s s 键。探针2 1 成功用于h e l a 细胞激光共聚焦成 像，证明探针2 1 膜渗透性好，可以对细胞内硫醇浓度的变化产生响应。m t t 细胞 毒性实验显示，细胞内2 1 浓度为8 0l a m o l l 时，细胞仍可正常生长。 oo 2 1 2 2 3 利用醛基与氨基和巯基的共同作用检测含巯基的氨基酸( c y s 、 h e y ) 和g s h 利用g s h ( 2 3 ) 中巯基和氨基共同与邻苯二甲醛( 2 4 ) 作用产生荧光化合物 1 4 山东师范大学硕士论文 ( 2 5 ) 的方法，是目前在食品、环境、医药卫生等方面比较常用的检j ! ! i g s h 的方 法。该法是1 9 6 6 年c o l l t l 和l y l e 建立的【4 3 1 ，其原理是在碱性介质中，g s h 具有还原性 的巯基和氨基与2 4 反应产生荧光化合物2 5 ，荧光激发和发射波长分别为3 5 0m 和4 2 0r i m , 在0 0 6 3 2 5p m o l l 范围内荧光强度与谷胱甘肽浓度呈线性关系，反应 在室温下，p h8 0 进行，反应时间1 5m i n ，产生的荧光化合物2 5 在3 0i 血内保持 稳定，测定中氧化型谷胱甘肽，含硫氨基酸、肽、嘌呤等其它物质对g s h 的测定 没有影响。2 4 的缺点在于波长短，不适用于生物体内检测。 啪c 八方0 y + q ：一 h 2 n o o h o o 2 3 2 4 2 5 在2 4 的基础上又发展了萘2 ，3 二甲醛2 6 ，2 6 与2 4 相比优势在于激发和发射 波长长，分别为4 7 21 1 1 1 1 和5 2 8n l n ，2 6 是h p l c 、激光共聚焦、流式细胞计数和毛 细管电泳中常用的检测谷胱甘肽的荧光试剂【州9 】。 啪c 八方o y + ：一 h 2 n 西o o o 2 0 0 4 年r u s i n 等【5 0 】开发了可选择性检测c y s 和h c y 的探针荧光素二醛2 7 ，探针 与c y s 或h c y 反应后荧光猝灭，紫外吸收光谱发生红移( 最大可移动2 5r i m ) ，溶 液颜色发生显著变化( 1 0 x 1 0 0m o l l l 拘c y s 或h c y 力i ：i , k 1 0 x 1 0 6m o l lp h9 5 的探 针水溶液中，溶液颜色由黄色转为棕黄色( 如图3b 和c 所示) 。探针可以检测生 理浓度范围i 内c y s 或h c y 浓度( 2 9x1 0 6 之5 1 0 弓m o l l ) 的变化，胺、氨基酸、 其它的硫醇和蛋白质干扰很小。探针为检测血浆中的氨基硫醇提供了一种很好的 荧光和紫外可见方法。 山东师范大学硕士论文 abcdef 鬟纛 圈3 揉 t 2 7 溶液颜色的改变：a 来加分析物ib c ”：c h c y ；d 牛血清蛋白：e 氪基乙酸； f 丙胺 5 ” 同年t a n a k a 课题组设计台成出荧光增强型醛基荧光探针2 8 ，该攘针可在中 性条件下选择性的检测c y s ，根据探针浓度的不同，线性范围分别为2 0 1 0 0 i m l o l l 和1 0 0g m o l l 5 m m o l l ，反应时间为3 0 m i n ，其它的氪基酸( 包括甲硫氨 酸、丝氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸) 和g s h 不干扰铡定。本文提供了一种简 单快速的荧光增强型探针检测氨基硫醇，不足之处是探针的波长位于紫外区( 撇 发和发射分别为2 5 0a m 和3 8 0n m ) 。 2 8 r n h r g s h 生物体内含量最高的小分子硫醇c y s 和h c y 都是生物体内重要的氨基 酸，目前检测含巯基的氨基酸的荧光分子探针还比较有限，因此利用醛基对含巯 基氨基酸的选择性，开发长波长的荧光增强型的高灵敏度的可用于活体内检测的 荧光探针是非常有意义的。 4 其它机理检测硫醇 2 0 0 4 年c h c n 等利用3 2n m 的金纳米颗粒( g n p s ) 与尼罗红( n r ) 的非共 喾 q k h 山东师范大学硕士论文 价吸附作用设计组装了硫醇传感器- n r g n p s ，n r g n p s 可利用荧光法和比色法( 团 聚) 选择性的检测硫醇。由于n r 与g n p s 之间发生了荧光共振能量转移，n r 的 荧光被g n p s 强烈猝灭，n r g n p s 的荧光非常的弱。利用巯基