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褪黑素的电化学氧化行为及电化学测定 摘要 中文摘要 本文采用循环伏安法、恒电位电解等方法研究了褪黑素( m l ，t ) 在金电极上的不百 逆氧化。其伏安过程为受弱吸附和扩散共同控制的过程，氧化反应电荷转移数为2 。 采用线性扫描伏安法对褪黑素进行测定灵敏度很高，在2 0 x1 0 1 0 m o j 几1 0 1 0 o l 1 浓度范围内，褪黑素氧化峰电流强度与其浓度呈良好线性关系。检测_ f 限 可达1 0 。o m o l i 。数量级。可用于脑白金胶囊中褪黑素含量的测定。 在硼酸缓冲溶液( p h 6 7 ) 介质中，1 4 。0 。对鲁米诺的电化学发光有敏化作用。b l l t 因具有对氧自由基的湮灭作用而对此敏化的电化学发光具有淬灭作用，在m l t 浓度为 1 0 x1 0 1 4 7 0 x1 0 4 m o l l 范围内，体系的e c l 强度随m l t 的浓度增加而降低，且具 有良好的线性关系，检测灵敏度极高，检测下限可达到1 x 1 0 1 4 m o l l ，用于脑白金胶 囊中m l t 的测定得到满意结果，为m l t 的测定提供了另一种灵敏、可靠的测定方法。 关键词：褪黑索；电化学氧化；电化学发光：伏安法 作者：许海燕 指导教师：屠一锋 塑墨重塑皇些兰墨些笪垄墨皇些堂型塞 一塑矍 a b s t r a c t t h ei r r e v e r s i b l ee l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i o no fm e l a t o n i n ( m l t ) 9 , r a ss t u d i e db yc y c l i c v o l t a m m e t r ya n d b u l ke l e c t r o l y s i sw i t hc o u l o m e t r yi n t h i sp a p e r t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t sh a v er e v e a l e dt h a ti t se l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i o nw a sc o n t r o l l e db y w e a k l y a d s o r b i n ga n dt h ed i f f u s i o nc o r p o r a t e l y ，t h en u m b e ro fe l e c t r o nt r a n s f e re q u a l st o2t h e l i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y ( l s v ) c o u l db ea p p l i e di nt h ed e t e r m i n a t i o no fm e l a t o n i nw i t h v e r yh i g hs e n s i t i v i t y i nt h er a n g ef r o m2 0 x1 0 。m o l lt o1 o x l o 南m o l l t h ec u r r e n to f o x i d a t i o np e a ko fm e l a t o n i nl i n e a r l yr e s p o n d e du p o ni t sc o n c e n t r a t i o n t h ed e t e c t i n gl i m i t i sa sl o wa s1 0 1 0 m o l lo r d e ro f m a g n i t u d eo f t h ec o n c e n t r a t i o n t h i sm e t h o dc o u l db eu s e d i nt h ed e t e r m i n a t i o no f m e l a t o n i ni nt h ec a p s u l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i nt h eb o r a t eb u f f e rs o l u t i o no fp h 6 7 ，t h em e l a t o n i nq u e n c h e dt h eh 2 0 2e n h a n c e d e l e e t r o c h e m i l u m i n e s c e n s e ( e c l ) o fl u m i n o lb e c a u s eo ft h ea r m i h i l a t i o nt ot h eo x y g e nf r e e r a d i c a l s i tc o u l db e s e n s i t i v e l yd e t e r m i n e db y t h i sm e t h o d i nt h e r a n g e f r o m 1 0 1 0 1 4 m o l lt o7 0 xi o _ 9 m o l l ，t h ee c ll u m i n o u si n t e n s i t yl i n e a r l yd e c r e a s e du p o nt h e c o n c e n t r a t i o no fm l t t h ed e t e c t i n gl i m i ti sa sl o wa s1 0 x 1 0 。m o l l ，a n dt h ec a p s u l e s a m p l e sh a v eb e e nd e t e r m i n e dw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s i ts h o u l db ea n o t h e rs e n s i t i v ea n d r e l i a b l em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fm e l a t o n i n k e y w o r d s ：m e l a t o n i n ；e l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i o n ；e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n s e ； v o l t a m m e t r y w r i t t e nb yh a i y a nx u s u p e r v i s e db yp m y i f e n gt u 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或 撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材 料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承 担本声明的法律责任。 研究生签名 立粼、日期：2 盟吧一7 、 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国 社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一 致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论 文的拿部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名逄这薹 导炳签名：蠡二聱 日期：! 趋丝主：1 7 日期：生翌筮兰：夕 提黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 1 1 褪黑素概述 1 1 1 褪黑素的发现 褪黑素，又名松果体素，英文名m e l a t o n i n ( m l t ) ，化学名5 一甲氧基一n 一乙酰色胺， 其化学结构式为： 删柏飞一哪刚聪能b 分子式为c 1 3 h 1 6 n 2 0 2 ，分子量2 3 2 2 7 ，熔点1 1 6 。c 一1 1 8 。c “1 。 翠在1 9 1 7 年就有人发现，蛙吃了牛松果体提取物后，其皮色很快变浅变白。1 。 1 9 2 7 年m cc o r d 和a l l e n 也观察到，如果将牛松果腺提取物加进蝌蚪的培养液中，蝌 蚪的颜色也会变浅变白捌。1 9 5 3 年，a a r o nb l e r n e r 首先从牛的松果体中分离出这种 皮肤光化物。他和他的同事们先后使用了2 0 万个以上的牛松果腺来制备纯化和检验 其提取物“1 。经过四年的努力，终于成功地查明这种物质是一种吲哚化合物，其结构 是5 一甲氧基一n 一乙酰色胺。当时定名为m e l a t o n i n ，中译名为褪黑素。 1 1 2 褪黑素的存在 脊椎动物体内的褪黑素主要由松果腺分泌。在系统发育上它是一个古老的器官。 古低等脊椎动物的松果器官以松果眼的形式存在，共有两个。一个位于动物的脑颅浅 层，为光感受器；另一个位于脑颅深层，间脑背部，在动物进化过程中，逐渐向腺体 结构演变，最后成为神经内分泌器官一松果腺“1 。些鸟类、爬行类动物的松果腺既 能感光又有内分泌功能，属中间过渡类型。哺乳动物的松果腺能通过神经途径，将视 网膜接受的光暗信号转变为m u 输出。 由于分离、提纯生物活性物质技术的进步，在脊椎动物松果腺以外的组织也发现 了m l t 。它能在对光暗信号敏感的视网膜中产生。在某些营养因子存在和调节下， 也能够在胃肠道中合成与释放，通过血脑屏障参与对中枢神经系统功能的调节。此外， 唾液腺、血小板和哈德氏腺等组织中也存在m l t “1 。 褪黑索的电化学氧化行为发电化学测定 第一章褪黑紊的基本生理作用及常用分析方法 近十多年的研究表明：m l t 也广泛存在于无松果腺结构的无脊椎动物体内。 v i v i e n - - r o e l s 等首次用放射免疫法( r i a ) 检测到蝗虫复眼中存在m l t 。而后，其 他学者又相继在家秋蝇的脑部、蟑螂的脑部和视叶、甲壳类动物蟹的眼部和眼柄、对 虾的视叶、软体动物乌贼的视网膜、扁形动物涡虫的头部和腔肠动物海紫罗兰的整个 组织内均发现m l t ”3 。 m l t 在植物中发现较早，但一直未引起人们的重视。其实早在1 9 6 9 年j a c k s o n 就在绣球百合的胚乳细胞中检测出m i x 。到1 9 9 5 年为止，不同学者在不同国家和地 区的被子植物( 包括单子叶和双予叶植物) 的1 6 个科的2 9 种植物中，如与人们日常 生活密切相关的水稻、玉米、油菜、萝1 - 、姜、番茄、黄瓜、苹果、草毒、忍冬和烟 草等，应用高效液相色谱法( h p l c ) 和放射免疫法( r l a ) 检测出m l t 。不仅高等 植物，在许多藻类中，也可以检测到m l t “。 值得注意的是在不具完整细胞结构的原核生物，如需氧光合细茵长赤菌中，也检 测出了m u 栅3 。 从原始生物到最高级哺乳动物，m l t 在生物界中分布极为广泛，特别是在原核 生物中发现m l t ，有力地证明了其在生物进化的早期阶段就已存在，并伴随着生物 由低等向高等的不断进化而保留至今。 1 1 3 褪黑素的合成与分泌 松果体细胞从血液中摄取色氨酸，在一系列酶( 色氨酸羟化酶、5 一羟色氨酸脱羧 酶、n 一乙酰转移酶、羟基吲哚一氧一甲基转移酶) 的作用下合成m l t 。哺乳动物除松果 体细胞能合成m l t 外，视网膜、唾液腺、肠嗜铬细胞、红细胞、胸腺、肾脏、肝脏、 甲状腺等也能合成“，但血液中的m l t 主要来自于松果体。m l t 合成后即进入血液 循环，并经脉络膜丛浓缩后分泌入脑脊液。正常人血液的m 【t 水平高于脑脊液。m l t 的分泌具有节律性：昼夜节律性“，即夜间浓度很高，整个白天处于极低水平。 松果体腺受昼夜节律影响，主要在晚上分泌。暗时相交感神经释放去甲肾上腺素 ( n e ) ，n e 作用于松果体腺细胞的b 一肾上腺索受体，激活腺苷酸环化酶，使环磷酸 腺督( c a m p ) 生物合成增加，而c a m p 可激活n 一乙酰转移酶，使m l t 分泌增加， 因此晚上m u 水平较高。血中m l t 水平昼夜之比为l ：1 0 。由于m l t 的分泌主要 挝黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 在夜间黑暗期，有人称其为“黑暗激素”。季节节律性“，由于日照时间的改变， 夜长的冬季m l l l 分泌时间长，分泌量多，昼长的夏季分泌时间短，分泌量少。终 身性节律“，胎儿出生后的前1 2 周，不分泌m i j ；2 4 周时m l t 的分泌量为成人的 2 5 ；随着松果体腺的成熟，m l t 水平上升，青少年时m l t 分泌达到最大；人衰老 时松果体腺开始钙化、萎缩，m l t 分泌明显下降。 1 1 4 褪黑素在体内的代谢 m l t 在体内的代谢在肝和脑中进行，其中肝是主要的降解途径“。在肝细胞中， m u f 在微粒体羟化酶作用下，生成6 一羟褪黑素，丧失生物活性，而与硫酸( 约7 0 8 0 0 , 6 ) 或葡萄糖醛酸( 约5 ) 结合排除。同时也存在小部分3 位侧链氧化，形成甲氧基吲 哚乙酸。另外，还有少量m l t 的去甲基代谢途径。m l t 的脑代谢主要是2 位氧化作 用，m l t 的吡咯环打开形成n 一乙酰一5 一甲氧一犬尿酸“”。代谢过程如图1 所示： 唧翅警一一卿链扣一时妒 n 韩i 一稍- i 抻嘲d - s m i k 蛔m m 扣e j n 喇一5 科t h 假卜丰訇_ t r 悄懈k l 雌i “ b m _ t _ 幽、 岱哦】阳- i 。蜊】 图1 ：m l t 在体内的代谢过程 s - k t h o x n 函札嘣疵 聃缸 1 1 5 褪黑素的作用 褪黑索可使某些鱼类、两栖类、爬行类动物的黑色素细胞中的色素聚集，使黑 色皮肤很快转为灰白色，但褪黑素的作用并非像它的名字那样简单到只是使皮肤颜色 变浅。随着研究的不断深入，它的功能多样性渐露端倪。 ( 1 ) 清除自由基、抗氧化作用 自由基是一类独立存在的、带有一个或多个不成对电子的分子、原予、基团或离 子。自由基是许多信号传导通路的第二信使，并能杀灭细胞内的病毒和细菌。但过多 的自由基对机体组织造成损伤“”。m l t 作为一种生物进化保留分子起着清除自由基、 褪黑素的电化学氧化行为及电化学测定第一章褪黑紊的基本生理作用及常用分析方法 保护机体免受氧化损伤的作用“。m l t 防止自由基损伤可通过以下几种途径： a 、m l t 直接清除自由基。 机体内通过酶促反应和非酶促反应随时产生自由基，主要有氧自由基、羟自由基、 过氧自由基和氮氧自由基等。m l t 不仅可以抑制这些自由基的产生，而且当自由基 产生后又可及时清除“9 。羟自由基( o h ) 是公认的最活泼也是最具危害性的自由基， 它可与产生部位的任何生物分子反应，由氧化应激所造成的损害几乎全部是由o t t 中介的。t a n 等1 证实m l t 为一强o h 清除剂，其清除能力是谷胱甘肽( g s h ) 的4 倍，甘露醇的1 4 倍。m l t 清除一分子o h 后，转化为吲哚阳离子，随后它又淬灭 一分子0 。一，形成n j - 乙酰一n ：一甲酰一5 一甲氧犬尿酰胺( a f m k ) 。a f m k 比m 具 有更强的抗氧化作用，两者协同作用，进一步增强了m u 、对o h 的清除能力1 。 单线态氧( 0 2 ) 也是一种很活泼的自由基，光敏染料产生的1 0 2 引起小脑颗粒细胞的 线粒体损伤和d n a 链断裂，抑制肌酸激酶的活性，最终导致神经细胞的死亡和能量 代谢障碍。使用外源m u 对神经细胞有明显保护作用，显著减轻了线粒体和d n a 的损伤。“。 b 、m l t 抑制脂质过氧化反应。 体内产生的自由基极易侵害细胞脂质中的不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引起 脂质过氧化反应，细胞膜中由磷脂酰基链和胆固醇组成的区域在细胞中极性最小，溶 解有高浓度的氧，更有利于脂质过氧化反应的进行。脂质过氧化反应对生物膜内类脂 结构破坏极大，反应中产生的自由基可以不加区分地与细胞中其他物质如蛋白质和核 酸作用，造成酶、染色体结构和功能的破坏。过氧化脂质的代谢产物丙二醛( m d a ) 又可通过蛋白质一级氨基集团反应与蛋白质交联，造成细胞功能的破坏。衰老相关疾 病的发生及药物、毒物引起的机体损伤与此机制密切相关。业已证明，施用m l t 对 此种因素造成的组织损伤有明显拮抗作用。”“。与其他氧化剂不同，m l t 一旦被氧化， 便不能被还原，这就避免了自动氧化导致的自由基形成和氧化还原反应的毒副作用， 使m l t 的作用更具有优越性汹1 。 c 、m l t 对d n a 的保护作用。 早期研究一直认为m l t 的作用完全依赖于膜受体。但利用免疫组化技术，却发 现m l t 特异地存在于细胞核中。m l t 是高脂溶性分子，它似乎总是优先地在细胞核 攫黑索的电化学氧化行为及电化学测定 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 中积累，与其他亚细胞结构相比，核中m l t 浓度更高。m l t 很可能是在d n a 水平 卜 发挥其抗氧化作用”。致癌物黄樟素，可诱发机体自由基大量产生，进而损伤d n a 。 实验发现，给予m l t 后明显抑制了黄樟素引起的d n a 加和物的形成，并呈剂量依 赖关系。”。将人外周血细胞暴露于”7 c s 所发出的r 射线中，造成染色体损伤。这一 损伤与m l t 剂量依赖性减轻，2 m m 的m l t 即相当于5 0 0 倍浓度的自由基清除剂：甲 亚飘( d m s 0 ) 的作用”“。 另外，m l t 还能激活d n a 修复机制，使d n a 免遭各种自由基引起的损伤”。 d 、与其他氧化剂协同作用清除自由基。 细胞内存在着自由基清除系统，可及时地清除体内过剩的自由基，维持自由基的 动态平衡。细胞中自由基的清除机制，一方面通过低分子化合物，另一方面是通过酶 的作用。低分子化合物如v e 、v c 、g s h 等可及时中止自由基链反应，抑制自由基的 产生。一般认为，m l t 这种供电子的吲哚化合物与中止链反应的低分子化合物如v c 、 g s h 等共同承担着细胞内清除自由基的任务。细胞内清除自由基的酶主要有超氧 化物歧化酶( s 0 d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 。其中 g s t i p x 可及时清除脂质过氧化物( l p o ) ，亦可清除h 2 0 2 ，减少了o h 这一最具危 害的自由基的形成。m u 对g s h p x 活力有明显的增强作用汹1 。 m u 的清除自由基抗氧化作用只是其诸多作用机制中的一个方面，大量文献已 经证实，m l t 还具有其他多方面的生理与药理作用： ( 2 ) 对中枢神经系统的抑制作用 由于m l t 对中枢神经系统的广泛抑制作用，因此表现出具有强烈的导引睡眠的 作用。人体实验结果已证明。“，m 【t 对健康人、精神病人、应用b 阻滞剂者、时差 性失眠者、倒班作业者及抑郁症病人均有导引睡眠的作用。m l l 导引的是自然睡眠， 呼之可醒；与一般催眠剂不同的是，醒后无昏沉之感。 ( 3 ) 抑制性腺与性器官的活动 松果体受肿瘤破坏后，可导致幼、少年性早熟，已为人们熟知。m l t 可重现松 果腺的各种抑制性腺、性器官的功能。在性腺、下丘脑、腺垂体、性器官等都有m l t 受体，m l t 对这些器官均起抑制作用。 m l t 能与卵巢、睾丸及肾上腺细胞上的1 3 一肾上腺素受体结合，直接调节性激素 攫黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 如黄体生成素( l h ) 、催乳素、前列腺索、睾丸酮、卵泡生成素( f s h ) 等的分泌释放， 进而控制生殖器官和性的发育成熟；m l t 也可通过下丘脑一垂体一性腺轴，在下- 匠脑 水平调节垂体促性腺激素的分泌，进而影响生殖系统功能1 。 ( 4 ) 对心血管系统的作用 m l t 能降低缺血再灌注心律失常的发生率，降低冠心病的发病率，特别降低血管 阻塞患者的突然死亡率。”。在狒狒的在体实验中，m u l 可增强心脏的收缩力，增加心 输出量，降低血中胆固醇的含量及低密度脂蛋自含量，减轻心室纤颤的动物模型的心 脏损伤。去松果体的大鼠出现高血压，给予m l t 能预防去松果体大鼠高血压的形成及 减低自发性高血压大鼠的血压，m l t 也能降低血压正常大鼠脑内的5 一羟基色胺 ( 5 - h t ) 含量、动脉血压及心率。m l l 降血压的机制可能是：直接作用于下丘脑； 降低血中儿茶酚胺的含量；松弛动脉壁的平滑肌：通过抗氧化作用”。 ( 5 ) 对免疫功能的影响 m i t 对大多数器官均起抑制作用，但对免疫系统的作用则有特殊的规律。m l l 、 可直接作用于免疫组织o 。迄今，绝大多数实验均证明，m l t 对免疫组织的作用是 促进性的，无论是先天性免疫力还是获得性免疫力，均可在m l t 作用下有所提高“。 上述种种促进免疫功能的关键是：m l t 刺激了免疫细胞( 特别是t 辅助细胞) ，使淋 巴细胞释放免疫阿片肽，增加抗体生成，刺激淋巴细胞产生干扰素及白介素一2 等”“。 褪黑素及其重要生理功能的发现很快在全球兴起一阵“褪黑素热”( m e l a t o n i n m a n i a ) ，2 0 世纪9 0 年代初在欧美国家已有多种褪黑素保健食品上市。中国以褪黑索 为主要成分的保健食品亦名目繁多，诸如脑白金、美康宁、美乐通宁等。其中脑白金 依靠其强大的广告宣传和睿智的营销策略，在短短几年时间里，成为中国保健品市场 一枝独秀的奇葩。 狂热之后是冷静，在“褪黑素热”的同时，有不少学者对褪黑素的功能提出质疑。 由于褪黑素对人体的生物功能在许多方面尚不确切，迄今欧美各国对其管理仍相当严 格。美国联邦食品及药品局( f d a ) 仅将其定为能改善睡眠的保健食品，德国至今仍 不允许将其作为药品登记。我国以脑白金为代表的褪黑素保健食品上市几年来，其较 为肯定的功效是改善睡眠，尤其对有睡眠障碍的老年人效果较为显著。 褪黑素的电化学氧化行为及电化学测定第一章褪黑索的基奉生理作用及常用分析方法 综上所述，褪黑素主要是松果体分泌的一类激素，它广泛存在于自然界其他生物 体内。褪黑素在生物体内的浓度昼低夜高呈现2 4 小时的变化周期。 自2 0 世纪5 0 年代以来，科学家们在大白鼠和小白鼠身上进行过一系列实验，许 多学者认为褪黑素具有延缓衰老、抗氧化、提高免疫力、改善睡眠等一系列功效，但 褪黑素对人体的功效尚有待更精确的实验加以证实。经2 0 世纪9 0 年代至今的实际应 用，褪黑素保健食品具有改善睡眠的作用，尤其对老年性睡眠障碍效果显著。作为 种激素，儿章、孕妇及其他特殊人群对服用褪黑素保健品应持谨慎态度。健康老年人 亦可不必服用褪黑激素。 1 2 褪黑素测定方法概述 1 2 1 褪黑素胶囊紫外分光光度法测定 崔小兵、赵晓莉、茅力、练鸿振“2 1 等采用紫外分光光度法测定褪黑素原料及胶囊 含量。取对照品适量，用甲醇溶液制成5 0ug m l 溶液，于2 0 0 3 5 0 n m 波长范围内 连续扫描同时对原料及胶囊进行了扫描，结果表明，褪黑素在2 0 6 n m 、2 2 3 n m 、2 7 7 n m 处都有较大吸收，且吸收曲线完全重合，考虑到末端吸收干扰较大，故选择2 7 7 n m 作为测定波长。精密称取干燥至恒重的对照品适量制成标准储备液，精密吸取储备液 适量加甲醇稀释成每m l 含褪黑素1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 ug 的标准溶液，以甲醇为空 白，在波长2 7 7 n m 处分别测定各溶液的吸收度。以浓度对吸收度进行线性回归，得 回归方程：h ：0 1 1 3 9 + 0 0 2 8 9 x ，( r = 0 9 9 9 4 ，n = 5 ) ，结果表明浓度在1 0 5 0 “g m l 范围吸收度与浓度有良好的线性关系。标准溶液在2 7 7 n m 波长处，于0 、2 、4 、6 、8 、 1 2 、2 4 h 测定，吸收度基本无变化，说明在2 4 h 内稳定。精密称取标准品2 5 m g 和胶 囊3 2 0 m g 置1 0 m l 刻度试管中加甲醇至刻度，超声提取2 0 r a i n ，离心5m i n ( 3 5 0 0 r m i n ) ，上清液转移至2 5 m l 容量瓶，残渣加1 0 m l 甲醇，超声提取2 0r a i n ，离心5m i n ， 定量转移至2 5 m l 容量瓶，定容，摇匀，制成储备液，精密量取储备液1 、2 、3 、4 、 5 m l 分别置1 0 m l 容量瓶中，稀释至刻度，在波长2 7 7 n m 处测其吸收度，按标准曲 线方法计算，结果平均回收率为1 0 0 1 ( n = 5 ) ，r s d 为0 7 8 。该法灵敏度高、重 现性好、操作简便、结果可靠，可用于本品的质量控制。 栏黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 1 2 2 褪黑素制剂含量的h p l c 法测定 施群、易有容“等用高效液相色谱法测定褪黑素的含量。仪器：s h i m a d z u 液 相色谱仪，二极管阵列紫外检测器。色谱柱：s p h e r i s o r b c 1 8 5um c b 4 6 m m 2 5 0 m m 。 流动相a ：5 5 0 0 5 m n a 2 h p 0 4 ( 用磷酸调至p h = 3 ，经0 2 2 r a m 微孑l 滤膜过滤) ；b ： 4 5 甲醇；流速：1 m l m i n ；进样体积：2ul ；检测波长：2 2 2 n m 。准确称取5 m g 褪 黑素对照品，用5 m l 甲醇溶解，移入5 0 m l 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，此溶 液浓度为1 0 0ug m l 。经不同程度稀释后制成浓度分别为1 、3 、5 、7 、9i ig m l 的褪 黑素对照溶液。准确称取2 5 r a g 褪黑素原料样品( 预先经7 0 。c 下真空干燥4 小时) ， 用5 m l 甲醇溶解，移入5 0 m l 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，移取5 m l 此液用流 动相稀释至5 0 m l 即为待测样品溶液。研磨2 0 粒片剂使成为均匀粉末，准确称取 定量，用5 m l 甲醇溶解，并用流动相稀释，经超声波振荡溶解，过滤。将浓度分别 为1 、3 、5 、7 、9 “g m l 的标准褪黑素溶液进样2 0 u l ，所得褪黑素峰面积( a ) 对标 准溶液浓度( c ，1 2g m l ) 进行线性回归分析，得工作曲线方程为：a = 9 4 1 0 5 c + 7 2 1 0 ，r = 0 9 9 9 8 ，表明在该浓度范围内线性关系良好。取原料溶液按上述色谱条件 薰复进样6 次，以其含量测定方法精密度。标准偏差0 7 9 ，变异系数0 7 9 。 1 2 3 反相高效液相色谱法测定褪黑素胶囊的含量 陈丽宇、谢克勤等“4 1 对褪黑素制剂及其原料药的含量测定方法进行了研究，建立 了反相h p l c 定量分析方法，使用y q w c l 8 色谱柱( 4 6 m m x 2 0 0 m m ，1 0 “m ) ，流 动相：甲醇：水( 6 0 ：4 0 ) ，检测波长2 2 3 n m ，采用外标峰高法定量。该方法简便、 快速、准确，重视性好( n = 1 0 ) ，r s d = 0 3 5 1 l ，回收率( n = 5 ) 1 0 0 2 7 ，r s d = 0 0 6 ；检测线性范围2 0 n g 4 0 0 n g 。 崔小兵、赵晓莉、茅力、练鸿振等“5 1 采用r p h p l c 法，x = 2 7 7 n m ，以甲醇： 0 2 的冰醋酸水= 50 ：50 ( v ，v ) 为流动相，测定褪黑素胶囊的含量。结果表明， 褪黑素浓度在1 0 5 01 1g m e 范围线性关系良好( r = 0 9 9 9 4 ) ，方法平均回收率为 9 9 8 ( r s o = o 7 8 ，n = 5 ) 。测定3 个不同批号样品的r s d 为0 5 2 0 7 2 ( n _ = 3 ) ，与紫外法比较，本法方便，结果准确可靠。 1 2 4 美通宁片中褪黑素的含量测定 8 褪黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第一章褪黑素的基本生理作用及常用分析方法 郜迎晨等“”人，采用薄层扫描法测定美通宁片中褪黑素的含量，以苯：氯仿：甲 醇( 4 ：9 ：1 ) 为展开剂。扫描条件： = 2 9 0 r i m ，狭缝1 2 x 1 2 r a n ，s x = 3 ，a y - 0 2 ， 灵敏度：中，反射法锯齿扫描。用微量毛细管分别取标准品溶液1 、2 、3 、4 、5ul ， 点于同一硅胶g f 2 5 4 板上，展开后测定斑点面积积分值，对数据进行回归分析，得 回归方程y = 5 3 2 5 8 + 1 7 6 6 8 7 x ，r ：0 9 9 9 5 。结果表明，褪黑素在1 0 3 5 1 5pg 范围 内与吸收峰面积呈良好的线性关系。通过方法学考察，平均回收率9 8 5 。变异系 数r s d - 4 1 2 。采用薄层扫描法测定美通宁片中褪黑素的含量与原紫外分光光度法 相比，简化了原操作步骤，克服了紫外法因溶剂不同造成的吸收峰偏移，影响测定等 现象，使结果更准确可靠。本试验所选用的展开系统，可对有效成分进行有效分离， 排除了其他杂质的干扰。其薄层图谱也可作为定性的指标依据。 1 2 5 保健品中褪黑素的气相色谱一质谱分析 卫煜英等“”采用g c m s 方法对褪黑素进行定性测定，并用s i m 法进行定量。仪 器：h p 5 8 9 0 g c h p 5 7 9 0 b m s d 。色谱柱s e 5 4 弹性石英毛细管柱3 0 m 0 2 2 m m 0 2 2 u m ，进样口温度2 5 0 ，柱温2 3 0 ，接口温度2 8 0 。离子源e 1 ，7 0 e v ，载气氮 气，柱前压4 5 k p a ，扫描范围3 0 3 0 0 a m u ，倍增器电压2 8 0 0 v 。 在本色谱条件下，褪黑索在1 2 5 r a i n 开始出峰，并能明显看到有两个保留时间相 近的，未分开的峰，有可能是质谱图完全相同的同分构体峰。2 3 2 为分子离予峰，1 7 3 、 1 6 0 均为这两个同分异构体的基峰。采用1 6 0 、1 7 3 作为选择离子进行离子扫描，可 消除样品中的干扰物影响并大大提高灵敏度，使最低检测限达2 0 u 咖l 。为适应保 健品含量测定，在1 0 0 4 0 0 | lg m l 浓度范围做校正曲线，线性关系良好，r = o 9 9 9 。 同一样品迸样5 次，相对标准偏差为8 2 5 ，回收率7 5 8 9 1 8 。 上述测定方法均可有效地测定原料和胶囊中褪黑素的含量，但一般而言这些方法 的灵敏度有限，亦未见有用于生物样品中褪黑素测定方面的应用。因此，寻找一种更 为灵敏、且可应用于生物样品测定的测定方法，是很有意义的。本研究工作即着眼于 褪黑素的电化学特性及采用电化学方法测定的可行性。 9 褪黑索的电化学氧化行为及电化学测定 第二章吸附伏安法与电化学发光分析简述 第二章吸附伏安法与电化学发光分析 2 1 吸附伏安法概述 2 1 1 吸附伏安法的理论与机理 伏安法( v o l t a m m e t r y ) “”是指以电解时的电流一电位或电位时间曲线为基础建立 起来的各种电化学分析法的总称，使用的电极可以是面积固定的铂电极、金电极、石 墨电极、悬汞电极或其他材料制作的电极，也可以是表面周期性更新的滴汞电极。自 1 9 2 2 年j h e y r o v s k y 开创极谱以来，这种分析方法在理论和实际应用上发展迅速。伏 安分析法不仅可用于痕量物质的测定，而且还可用于化学反应机理、电极动力学及平 衡常数测定等基础理论的研究。 伏安法包括直流极谱法( d i r e c tc u r r e n tp o l a r o g r a p h y ) 、直流伏安法( d i r e c tc u r r e n t v o l t a m m e t r y ) 、示波极谱法( s i n g l es c a n n i n gp o l a r o g r a p h y ) 、微分脉冲极谱法( d i f f e r e n t i a l p u l s e dp o l a r o g r a p h y ) 、交流极谱法( a l t e r n a t i n gc u r r e n tp o l a r o g r a p h y ) 、方波极谱法 ( s q u a r e w a v ep o l a r o g r a p h y ) 、溶出伏安法( s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y ) 和吸附伏安法 ( a d s o r p t i o nv o l t a m m e t r y ) 等。伏安法的基本理论来源于经典极谱法，依据能斯特方 程和f i c k 扩散定律。 吸附伏安法( a d s v ) “”是8 0 年代发展起来的一种重要的电化学分析测试方法。 它是利用电活性物质通过自发扩散或强制电流手段使其在电极表面上吸附富集，有些 化合物在电极表面上具有吸附活性，可在适当电极电位或开路条件下，首先吸附在电 极上，然后再根据吸附物的电极反应特性，选择合适的扫描电位和扫描类型，记录电 位扫描过程中的电位电流曲线，即吸附伏安波，在一定的浓度区间，峰电流与被测 物浓度具有线性关系。有机化合物的电极富集反应过程，常常伴随吸附作用。另外， 有些化合物虽然无电极吸附活性，但能与其他试剂反应，生成电极吸附活性产物，亦 可用吸附伏安法间接测定。 吸附伏安法一般包括两个过程：一是富集过程，即在一定条件下使被测物以自发 扩散或强制电流吸附在电极上；二是测定过程，即采取一定的扫描电压的方式，使被 1 0 褪黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第二章吸附伏安法与电化学发光分析简述 测物在电极上发生氧化还原反应，根据所得的伏安曲线测定物质的浓度。 2 1 2 吸附伏安法的分类晴们 吸附伏安法根据电极反应的不同，可以分为阳极吸附伏安法和阴极吸附伏安法： 根据扫描电压类型的不同，分为线性扫描、示差脉冲、方波和交流吸附伏安法；也可 以根据测定对象的不同，分为两类：一类是被测物本身具有吸附能力的电活性物质， 另一类是被测物质为某些金属离子或变价离子，富集物为被测离子与溶液中某些有机 配体形成具有吸附能力的电活性络合物。 2 1 3 吸附伏安法的特点陆” 1 灵敏度高，一般可达1 0 1 m o l l ，有时可达1 0 1 0 m o l l ，甚至1 0 1 1 m o l l ，有利 于痕量金属离子、有机化合物及体液中微量或痕量物质的测定，在痕量分析中具有重 要意义。 2 简便快速，仪器结构简单，操作方法简便。不少物质本身具有电化学活性，可 直接测定；一些非活性物质经简单处理后，也可进行测定。 3 应用范围广。即可以测定无机物，又可以测定有机物。在生物、医药、环境等 领域中已获得广泛的应用，是一种很有发展前途的分析方法。 4 受共存吸附物质的干扰，常发生竞争吸附现象。这种干扰有时相当严重，必须 用萃取等分离方法加以消除；当干扰较小时，可以用标准溶液加入法得到满意的结果。 2 1 4 吸附伏安法的主要参数“” 1 温度系数。吸附作用随温度的升高而降低，温度系数随温度的升高而减小，以 至出现负温度系数。 2 吸附电流与去极剂浓度的关系。吸附电流与表面覆盖度成正比，达到饱和吸附 后，吸附电流不再随去极剂的浓度的增大而增大。 3 静止周期对吸附电流的影响。对于吸附过程建立较慢的过程，增加静止周期可 以增加表面覆盖度，从而使极谱电流增大。 4 吸附电流与扫描速度之间的关系。由r a n d l e s s e v c i k 公式知，i , o c v 以i 。对 v “2 作图，扩散电流将得到一条直线，吸附电流得到一上翘的曲线。在循环伏安图j 二。 以( i 。) 。( i ，) 。对v “2 作图可以判断是反应物吸附还是产物吸附。 褪黑索的电化学氧化行为及电化学测定 第二章吸附伏安法与电化学发光分析简述 5 瞬时电流时间曲线。由吸附电流公式( i 。) 。= 0 8 5 n f m “一t “3 可知，i t 曲线的 0 值应为一1 3 ，在表面活性物质加速电极反应的情况下，p 值可大于l 。 6 吸附电流的示波极谱性质。在常规示波图上，扩散波斜率变化前波大于后波， 吸附波则后波大于前波。因此，在导数图上，扩散波上峰高于下峰，吸附波则下峰高 于上峰。 7 起扫电位对吸附电流的影响。国产的示波极谱仪上，5 s 的静止时间和2 s 的扫 描周期是固定的，预富极时间实际上是5 s 的静止时间加上扫描开始到峰前的一段时 间，若起扫电位正移还原峰增大，则可能是吸附富集的影响。 8 循环伏安图。循环伏安图可以非常方便的区别各种吸附体系，反应物的弱吸附 使阳极峰增高，反应物的强吸附在较负的电位上产生吸附峰，而产物的强吸附在较正 的电位上产生吸附峰。增大去极剂的浓度，吸附电流与扩散电流之比减小，吸附峰正 移。 9 表面活性剂对吸附电流的影响。若催化络合物是阳离子，可用阳离子表面活性 剂，若催化络合物是阴离子，可用阴离子表面活性剂都会使吸附电流降低直至消失。 1 0 电毛细管曲线。溶液中如果存在表面活性剂时电毛细管曲线，阴离子特性吸 附使零电荷电位负移，阳离子特性吸附使零电荷电位正移，电毛细管曲线在吸附量不 受电位影响的范围内比较平坦。 2 1 5 吸附伏安法的应用 吸附伏安法的灵敏度高，可用于有机化合物9 、药物“、金属离子“”、生物 物质“”的测定。吸附伏安法还应用于水体分析和土壤分析中，还可以用于测定表面 活性剂的临界胶束浓度( c m c ) “。 2 2 电化学发光分析 电化学发光( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e c l ) 或电致( 生) 化学发光 ( e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ) 分析是指对电极施加一定的电压以使溶液 组分发生电化学反应，反应产物本身或反应产物与体系中某组分发生化学反应而使溶 液中的某种物质被激发，并以光辐射的形式释放能量而导致化学发光，用光电倍增管 槌黑素的电化学氧化行为及电化学测定 第二章吸附伏安法与电化学发光分析简述 等光学仪器测量发光光谱和强度，从而对痕量物质进行分析的一种方法。 2 2 1 电化学发光的发展 早在1 9 2 7 年，d u f f o r d 等“2 3 首次发现在g r i g n a r d 化合物的无水醚溶液中，对阴 极和阳极施加5 0 0 伏到1 5 0 0 伏的电压就可产生发光现象。1 9 2 9 年，h a v e r yn 在碱性 溶液中电解鲁米诺( l u m i n 0 1 ) 时发现了在阳极有发光现象，但是直到六十年代初 的期间三十多年，只有f r a y m a n n ”、b e r n a n a s e 。5 1 等人报道过不足十篇的文章，对电 化学发光的研究多是针对一些稠环芳烃，如红莹烯、芘类化合物、呋喃、吲哚类以及 蒽和它的衍生物等的发光机理“。 7 0 年代，电子技术的迅猛发展，随着高灵敏度的光电传感器的开发，电化学发光 技术也得到不断发展。电化学发光的研究范围有了很大的扩展，除研究某些发光体系 外，还对电化学发光的仪器和电极系统进行了改进，提高了信噪比，适用于测定更微 弱的光信号，拓展了研究领域。这期间除研究各种芳烃化合物的e c l 外，还发现了许 多新体系，如在h , s o , 和h c l o 。中u o 。2 + 的电化学发光”和h 2 s 0 4 中t b ”、d y 3 + 的e e l “。 在机理研究方面，利用磁场对电化学影响的磁光效应，进行了三重态湮灭的研究”7 ”。 同时还有人使用光谱电化学方法“”以及电子自旋共振( e s r ) 研究电极表面的产物。“。 8 0 年代以来，有关e e l 的报道逐年增加，e e l 开始进入某些实用阶段。由于它的 连续可测性，可方便地用作为液相色谱仪的检测器“7 、7 ”，开展了膜修饰电极”3 ，表 面活性剂对e c l 的影响侧等研究。美国的b a r da j 在对联吡啶钌的e c l 研究后， 于1 9 8 4 年提出用由电生联毗啶钌的方法作为免疫分析中标记物的可能性。“。印度的 i s m a i l 等人开辟了e e l 的新领域，即电生物发光( e l e c t r o b i o l u m i n e s c e n c e ) 8 。 近年来，有人提出了应用电化学发光图像法( e c li m a g i n g ) ，研究了非均相电极表面 的电化学活性物质的分布情况，还有人应用该方法研究了盘电极上非均匀性电流 密度的分布特性9 “。 目前在我国，e e l 法已引起电化学工作者的重视。福州大学的安镜如等已连续报 道了酰肼类化合物如鲁米诺及其衍生物在碱性环境中的e e l 现象及其机理研究。2 “1 。 中国科学技术大学的林祥钦等将c v 与e e l 结合，对经不同预处理的不同类型的电极 对鲁米诺e c l 的影响进行了研究，探讨了在碱性条件下，不同电极上的鲁米