（发酵工程专业论文）胡萝卜与黄芪细胞融合技术的研究.pdf

l 飞 q i 关于硕士学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的 规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至 内罗年胗月彦，日为止。 学生签名： 重! j 婆 翩虢幽 砷7 年。牛月硼 t 二 龟 、 摘要 摘要 黄芪 a s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g e 为多年生豆科( f a b a c e a e ) 植物， 其干燥根为常用滋补中药材，含有活性较强的三萜皂苷、黄酮类、多糖类、氨基酸、微 量元素以及棕榈酸、羽扇豆醇等。但由于草原荒漠化以及乱采挖等原因，药用野生黄芪 资源已十分贫乏，即使采用人工栽培的方法不仅产量不能满足市场需求，而且品质也得 不到保证。胡萝卜是植物组织培养中经典实验材料之一，也是近年来进行遗传操作的主 要材料。以胡萝卜原生质体为受体，进行外源基因导入的研究，首先要建立一套稳定、 高效的原生质培养系统。因此，用细胞融合等现代生物技术将中药黄芪的药用成分基因 转入胡萝卜中，为提高种质资源生物量、优化品质具有重要意义。 1 建立了由黄芪叶片诱导愈伤组织的技术体系。愈伤组织的诱导效果受培养基、植 物生长调节激素种类、浓度以及配比等因素的影响。将叶片接种在m s 的诱导培养基上， 获得愈伤组织；然后在添加2 ，4 - d 的m s 增殖培养基上获得增殖培养。 2 以黄芪叶片和愈伤组织为材料，对黄芪原生质体的制备分离技术进行了研究。结 果表明：采用黄芪叶片制备原生质体远远优于黄芪愈伤组织，能够获得高产量高活力的 原生质体；采用2 0 纤维素酶+ 0 5 半纤维素酶+ o 5 果胶酶的混合酶，低速( 3 5 4 0 r p m ) 恒温摇床上水解1 2 小时就能达到较好的分离效果，获得高质量的黄芪原生质体， 并且黄芪原生质体纯化时以8 0 0 r p m 离心6 8 分钟效果较好。 3 利用p e g 结合高c a 2 + 一高p h 法诱导胡萝卜的悬浮细胞系原生质体与黄芪的叶肉原 生质体融合，从p e g 不同浓度、不同处理时间以及不同原生质体密度对原生质体融合的 影响等方面优化了融合条件。6 一8 d 观察到第一次细胞分裂，2 5 3 0 d 形成多细胞团， 继续培养获得愈伤组织。 4 进行电融合时最适宜的电场参数为：交流电场强度4 0 v a m 、直流脉冲场强 7 0 0 v c m 、脉冲宽度4 0 p s ，在此参数下的电场处理不影响原生质体的活力。 关键词：胡萝l 、，黄芪，愈伤组织，悬浮细胞，原生质体，细胞融合，组织培养 a b s tr a c t a s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g ei st h ev i v a c i o u sp l a n to ff a b a c e a e h i sr o o t s a r et h eu s u a ln u t r i t i o u sm e d i c i n a lm a t e r i a l ，w h i c hc o n t a i na c t i v et r i e r p e n e 、f l a v o n o i d 、 p o l y s a c c h a r i d e 、a m i n oa c i d 、m i c r o e l e m e n t 、p a l m i ca c i da n dl u p e 0 1 b e c a u s eo f p l a i nd e s e r t i n g a n de x c e s s i v ec u t t i n gh o w e v e r , t h er e s o u r c eo fa s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g ei s v e r yn e c e s s i t o u s c u l t u r i n gb yo u r s e l v e sn o to n l yc a l l n o tm e e tt h en e e d so fm a r k e t ，b u ta l s o c a n n o tc e r t i f yt h eq u a l i t y d a u c u sc a r o t av a t s a l i v u sh o f f m i so n eo ft h ee x p e r i m e n t a l m a t e r i a lo fv e g e t a b l ec u l t i v a t i n g ，w h i c hi sa l s oac h i e fm a t e r i a lf o ri n t e d t i n g t a k i n g p r o t o p l a s tf r o md a u c u sc a r o t av a r s a t i v u sh o f f m a st h ea c c e p t o r , w ec a r r i e do u tt h es t u d yo f g u i d i n go fe x t r a s o m a t i cg e n e t h ef i r s tt h i n gi sb u i l d i n gu pas t a b l ea n de f f e c t i v es e to f p r o t o p l a s tc u l t u r e h e n c e , i ti sm e a n f u lf o re n h a n c i n gt h er e s o u r c e sa n do p t i m i z i n gp r o d u c t s t h a ts w i t c h i n gt h em e d i c i n a lc o m p o n e n tt ot h ed a u c u sc 啪幻v a t s a t i v u sh o f f m b ym e a n so f m o d e r nb i o t e c h n o l o g y , s u c ha sc e l l sf u s i o n 1 t h ec a l l u sw e r ei n d u c e df r o ml a m i n ao fa s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f i c i e n c yo fc a l l u si n d u c t i o nw a sa f f e c t e db yc u l t u r em e d i u ma n d p l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sc o m b i n a t i o na n dr a t i o ，e l ：a 1 t h el a m i n aw a si n o c u l a t e do nt h e m e d i u mo fm s ，h i g hq u a l i t yc a l l u sw e r ei n d u c e d m a n yt y p e so fc a l l u sw e r ef o r m e da f t e rt h e i n i t i a lc a l l u sp r o l i f e r a t i o no nm sm e d i u mw i t h2 , 4 一d 2 l a m i n aa n dc a l l u so ft h ea s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g ew e r eu s e dt o e x a m i n et h ec o n d i t i o n sf o r p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o n a n dc u l t u r eo ft h e a s t r a g a l u s m e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el a m i n ao ft h ea s t r a g a l u s m e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g ec o u l dr e l e a s em a s s i v ea n dv i g o r o u sp r o t o p l a s t s c o m p a r e dw i t h t h ec a l l u so ft h es p e c i e s ，t h ep r o t o p l a s t se x t r a c t e df r o mt h el a m i n aa r em o r ee f f i c i e n ti nt h e c e l lf u s i o na n dt i s s u ec u l t u r e t h eo p t i m i z e dt r e a t m e n ti s2 0 c e l l u l a s er - 1 0 ，0 5 h e m i c e l l u l a s e ，a n do 5 p e c t o l a s ey 0 2 3 h i g hy i e l da n dv i a b i l i t yp r o t o p l a s t sw e r eo b t a i n e d w h e ni n c u b a t e do nc o n s t a n t - t e m p e r a t u r es h a k e rw i t h35 4 0 r p mf o r12h o u r s a n ds p e e da n d t i m eo fc e n t r i f u g a t i o nd u r i n gp u r i f i c a t i o na l s oa f f e c t e dp r o t o p l a s t sy i e l da n dv i a b i l i t y 3 p r o t o p l a s t sb o t hf r o ms u s p e n s i o no fd a u c u sc a r o t av a r s a t i v u sh o f f m a n dm e s o p h y l l o fa s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ( f i s c h ) b u n g ew e nf u s e dw i t hp e g ：d e n s i t yo fp r o t o p l a s t s ， c o n c e n t r a t i o na n dt r e a t e dt i m eo fp e ga f f e c t e df u s i o nr e s u l t s t h ef i r s td i v i s i o nw a so b s e r v e d i ns i xt oe i g h td a y sa n dm u l t i c e l lc o l o n i e si nt w e n t yf i v et ot h i r t yd a y s ，a n dt h e nc u l t u r e d 4 t h eb e s tp a r a m e t e r so fe l e c t r o - f u s i o nw e r ea c 4 0 v c m , d c 7 0 0 v c m , p w 4 0 l a s w i t h t h o s ep a r a m e t e r so fe l e c t r o - f u s i o n , n os i d ee f f e c tw a sf o u n do nt h ep r o t o p l a s tv i a b i l i t y k e yw o r d s ：d a u c u sc a r o t av a r s a t i v u sh o f f m 。a s t r a g a u sm e m b r a n a c e u s ( f is c h ) b u n g e 。c a li u s ，s u s p e n s i o no e ii s ，p r o t o p i a s t ，o e iif u s i o n ，t i s s u eo u i t u r e 。l 目录 目录 摘要o o o ood oooooooooooodoo i a b s t r a c t l l 目录b oo ooooooooooooo o o eoooo o 缩写词目录 第一章绪论1 1 1 植物细胞融合研究概况l 1 1 1 植物细胞融合l 1 1 2 植物原生质体的制备与纯化2 1 1 2 1 植物基因型的选择0 0 0000000 2 1 1 2 2 制取原生质体的材料选择2 1 1 2 3 植物原生质体的预处理3 1 1 2 4 植物原生质体的酶解4 1 1 2 5 植物原生质体的纯化5 1 1 2 6 植物原生质体的活力鉴定o o 6 1 1 3 植物细胞融合技术6 1 1 3 1p e g - 高c a 2 + 高p h 诱导融合法7 1 1 3 2 植物原生质体电场诱导融合法8 l 。l 。4 植物杂种细胞筛选鉴定8 1 1 5 植物原生质体的培养l l 1 1 5 1 原生质体培养基1 1 1 1 5 2 植物原生质体的培养方法1 2 l - 1 5 3 植物原生质体的发育和植株再生1 4 1 2 黄芪1 6 1 2 1 本草考证1 6 1 2 2 植物资源研究1 6 1 2 3 化学成分研究1 6 1 2 3 1 皂苷类1 6 目录 3 2 多糖类 4 药理作用 4 1 增强机体免疫功能 4 2 对心脑血管系统作用 4 3 抗肾炎和降血糖 4 4 对中枢神经的双向调节作用 4 5 护肝 4 5 他功能 1 3 胡萝卜”“”1 8 l 。3 。l 本草考证1 8 1 3 2 植物资源研究1 8 1 3 3 化学成分研究1 9 1 3 4 药理作用1 9 l - 3 5 组织培养1 9 1 4 实验设计的目的和意义2 0 第二章材料与方法o oo booo00 0 00000 000 2 1 2 1 实验材料2 1 2 1 1 植物材料2 l 2 1 2 培养基2 1 2 1 3 实验仪器与器材2 l 2 1 4 实验主要试剂2 l 2 。l 。5 实验条件2 2 2 2 实验方法2 2 2 2 1 胡萝卜再生体系的建立”2 2 2 2 1 1 胡萝卜愈伤组织的诱导2 2 2 2 1 2 胡萝卜悬浮细胞培养2 2 2 2 2 黄芪再生体系的建立2 2 2 2 2 1 黄芪愈伤组织的诱导2 2 2 2 3 细胞悬浮生长曲线的测定2 3 2 2 4 悬浮细胞数目的测定2 3 2 2 5 原生质体的制备与分离、纯化2 3 v 7 7 7 7 7 8 8 8 2 2 2 2 2 2 2 2 目录 2 2 5 1 叶肉原生质体的制备2 3 2 2 5 2 愈伤组织原生质体的制备2 4 2 2 5 3 悬浮物原生质体的制备2 4 2 2 5 4 原生质体的分离与纯化2 4 2 2 5 5 原生质体存活率、密度和产量的测定2 4 2 2 6 胡萝卜与黄芪细胞融合及培养2 5 2 2 6 1 p e g 结合高c a 2 + 一高p h 诱导融合法2 5 2 2 6 2 原生质体电场诱导融合法2 6 第三章结果与讨论2 7 3 。l 胡萝卜离体再生体系的建立2 7 3 1 1 不同激素配比对胡萝卜悬浮细胞生长的影响2 7 3 1 2 悬浮细胞系生长曲线2 7 3 2 黄芪离体再生体系的建立2 8 3 2 1 不同激素配比对黄芪愈伤组织诱导率的影响2 8 3 2 2 1 黄芪愈伤组织的诱导2 9 3 2 3 黄芪愈伤组织增值培养与其生长曲线的测定2 9 3 3 黄芪原生质体分离3 0 3 3 1 酶液组成对原生质体分离效果的影响3 0 3 3 2 酶液浓度对原生质体分离的影响3 0 3 3 3 渗透压对原生质体分离的影响3 l 3 3 4 酶解时间对分离原生质体的影响3 2 3 。3 。5 黄芪取材原料不同对分离原生质体的影响3 3 3 3 6 纯化离心对原生质体产量和活力的影响3 3 3 。4 黄芪与胡萝卜的细胞融合及愈伤组织培养3 4 3 4 1 p e g 结合高c a 2 + 一高p h 诱导融合法3 4 3 4 1 1p e g 浓度对融合率的影响3 4 3 4 1 2p e g 处理时间对融合率的影响3 5 3 4 1 3 原生质体密度对融合率的影响3 5 3 4 2 原生质体电场诱导融合法3 5 3 4 2 1 不同交流场强和频率对细胞成串及融合率的影响3 5 3 4 2 2 不同直流场强和幅宽对细胞融合率的影响3 6 目录 3 4 3 黄芪与胡萝卜细胞融合过程及愈伤组织培养3 7 第四章结论3 8 参考文献3 9 致 射一4 3 k 缩写词目录 缩写词目录 l 第一章绪论 1 1 植物细胞融合研究概况 1 1 1 植物细胞融合 第一章绪论 植物细胞融合( p l a n tc e l lf u s i o n ) 是指两种异源( 种、属间等) 原生质体，在诱导剂诱发 下相互接触，从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种 植物体。如取材为体细胞，则称体细胞杂交( s o m a t i ch y b r i d i z a t i o n ) 。 植物原生质体( p r o t o p l a s t ) - - 词始自h a n s t e i n ( 1 8 8 0 ) ，即指“通过质壁分离，能够和细 胞壁分开的那部分物质 。换言之原生质体就是除去全部细胞壁的“细胞 ，或是一个原 生质膜所包围的“裸露细胞。 1 8 9 2 年，k l e r c k e r 把藻类细胞先放到糖液中，让细胞质壁分离，原生质体缩成球形， 然后把藻体破碎掉，当渗透压稍降低后就有少量完整的原生质体释放出来。这是第一次 用机械方法得到原生质体【l 】，这种机械法一直延续到2 0 世纪5 0 年代。由于用这种方法 分离原生质体，获得的完整原生质体数目极少，并且只能从液泡化了的薄壁细胞或球茎 类的储藏组织中分离，因此在应用上受到很大限制。1 9 6 0 年，英国诺丁汉大学的 e c c o c k i n g 首次用纤维素酶分离番茄幼苗的根得到原生质体，从此开创了用酶法来分 离植物原生质体时则2 1 。1 9 7 1 年，n a g a t at 等首次由烟草原生质体得到再生植株，证明 了原生质体具有的全能性。1 9 7 2 年c a r l s o n 等人用烟草种间原生质体融合获得第一例体 细胞杂种。这些结果极大的激发了研究者在原生质体培养及体细胞杂交方面的兴趣。利 用根癌农杆菌感染由原生质体再生的细胞，或将分离的t i 质粒d n a 直接导入原生质体 以及用农杆菌的球质体与植物原生质体融合将t - d n a 转入植物细胞，获得转化植物的 成功，则促进了原生质体作为受体系统进行导入外源d n a 的试验，加上利用原生质体 进行摄取叶绿体、细胞核、根瘤菌、噬菌体的试验，使之成为利用原生质体进行遗传操 作的一个重要方面。 由于有性杂交技术不亲和性的障碍，使可利用的基因资源十分有限。基因工程技术 固然有很强的目的性，但目前对于控制作物的许多重要农艺性状的多基因系统还无能为 力。植物细胞融合技术虽然有其随机性的缺陷，但由于可转移细胞核中的染色体组、染 第一章绪论 色体片段，或者细胞质中的叶绿体d n a 及线粒体d n a ，因而使可利用的基因资源十分 广泛。植物细胞融合配合常规育种技术，可望选育出优良材料，加之体细胞杂种来自双 亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是改良作物所期望的。 植物细胞融合的意义在于从细胞水平上，提供遗传物质交换的一种新方法，通过异源原 生质体的融合，广泛地重组植物界优良性状，为植物育种开辟一条全新的途径。 原生质体融合技术中的主要步骤为：植物原生质体的制备和纯化、植物原生质体融 合、杂种细胞筛选鉴定、植物原生质体的培养。关于原生质体融合技术中的四个主要内 容的研究进展概述如下。 1 1 2 植物原生质体的制备与纯化 原生质体制备就是植物细胞脱去细胞壁形成原生质体，它是细胞融合的第一步，同 时也是非常关键的一环，原生质体的产量和活力直接影响着细胞融合的成功与否。从理 论上说，只要用适当的酶处理，就能从任何植物的任何活的组织或其培养的细胞系都可 分离得到原生质体。但对于原生质体培养来说，要得到产量高、活性强、能进行分裂， 形成愈伤组织或胚状体，最后能再生成完整植株的原生质体，则受许多因素的影响。就 影响原生质体分离时的产量与活力来说，主要应考虑到植物基因型、制取原生质体的材 料、酶的种类及其组合、酶制剂的纯度、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间 与温度、分离与纯化的方法等。 1 1 2 1 植物基因型的选择 研究表明，基因型与原生质体培养及形态分化有一定的关系，同一植物不同基因型 的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不一样，造成不同品种在相同条件下的再生能 力也会不同。原生质体的产量很大程度上取决于基因型和外植体。在相同的条件下，有 的基因型能够顺利地完成原生质体游离、再生细胞持续分裂成愈伤组织及器官分化的全 过程，而有的品种则不能。因此在选择制备原生质体材料时，往往需要借鉴组织培养和 细胞培养的经验和规律，它不仅影响原生质体的产量和活力，而且还影响植株的再生【3 1 。 1 1 2 2 制取原生质体的材料选择 从理论上讲，植物任何组织和器官都可以作为分离原生质体的材料。但在实际工作 中，只有生长旺盛、生命力强的组织和细胞才是获得原生质体的最佳起始材料。这些材 料主要包括植物幼嫩的叶片、茎尖，双子叶植物萌发种子的子叶、胚根和胚轴，花粉和 2 第一章绪论 雌配子体等性细胞，以及由外植体诱导来的处于生长旺盛期的愈伤组织和悬浮细胞等。 目前，用于培养和细胞工程研究的植物原生质体主要来源于各种植物的叶片、愈伤组织 及悬浮培养细胞，次之为茎尖、根尖、子叶及胚性组织细胞。 从植物叶肉细胞得来的原生质体具有取材容易的特点，但栽培的肥水条件、生长季 节及植物的年龄、叶龄都会明显地影响到原生质体的产量和活力。如：冬季栽培的烟草， 增施钙肥可增强原生质体的稳定性，但施钙肥对于春、夏栽培的植株无明显影响1 4 1 。不 过，现在很少有人再用大田的植株作材料，而是用可以控制温度、湿度、光照等条件的 植物培养箱或培养室来培养植物。 现在越来越多的人采用试管苗的叶片来分离原生质体，这样，小苗在试管中容易管 理，实验也可重复【5 ，6 l ，对一些木本植物种来说其有利性就更加明显，如桦木的试管苗 可排除一年一度的生长周期性休眠，并可诱导其幼年期的生长f 7 1 。 根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可以从各种植物的种子萌发后取得，但 一次分离往往需要较多的根尖材料，有些来自植物根尖的原生质体易于再生。植物的花 粉经特异性酶处理也能得到原生质体，由于花粉是单倍体细胞，因此，产生的单倍体原 生质体在遗传工程中有特殊的用途。 原生质体可从组织培养的材料中大量获得，由于组织培养的条件严格，使得材料的 重复性好，并可长年供应，组织培养的材料可以用继代几次后，质地较疏松的愈伤组织， 但更多地是采用各种悬浮培养的细胞，一般选用继代培养3 - - 一5 d 的悬浮细胞作为材料。 在这种细胞群体中，主要是单细胞或小细胞团，细胞壁容易解离，但植物组织培养中， 愈伤组织经长期继代后分化能力的保存及遗传稳定性问题，一直是细胞工程研究的重要 课题【8 ，9 j 。目前培育成功的大多数植物所使用的是叶肉细胞或悬浮培养细胞的原生质体。 1 1 2 3 植物原生质体的预处理 为获得良好状态的供体材料，必要时应对植株或离体材料进行预处理和预培养，其 主要目的是为了提高原生质体产率和代谢活力；逐步降低植物细胞水势，增强原生质体 在进行培养时对培养基高渗透压不利影响的耐受力；使游离的原生质体更能适应新的培 养条件。如：预质壁分离将愈伤组织或悬浮培养细胞置于1 7 , - 一2 0 。c 酶液中静置3 0 m i n ， 再于2 8 - - - , 3 4 下保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中进行预培养l h 左右， 再浸于酶液中消化即可达到质壁分离的目的；暗处理将于室温下生长5 , - - - 7 周的植物材 料于黑暗中放置3 0 h 以上，然后再取其叶片制备原生质体，所得的原生质体更有活力； 低温处理夏季应用的实验材料，其萌动种子应于4 。c 过夜后再播种，从其植株叶片上分 3 第一章绪论 离的原生质体培养效果较佳。 制备原生质体前的预处理无规律可循，需根据具体材料和经验进行摸索。除要求无 菌培养外，所选材料均需用消毒液作表面消毒，其后操作也均于无菌条件下进行。 1 1 2 4 植物原生质体的酶解 植物原生体的分离制备有机械法和酶消化法。机械法分离原生质体，获得的完整原 生质体数目极少，并且只能从液泡化了的薄壁细胞或球茎类的储藏组织中分离，因此在 应用上受到很大限制；酶解法可以从许多植物的各种组织及培养的细胞系分离出大量有 活力的原生质体。 1 1 2 4 1 分离原生质体常用的酶 高等植物细胞壁主要成分为纤维素，其次为半纤维素、果胶质和蛋白质。细胞生长 的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构也有差别，木质化及次生加厚的细胞壁不容 易被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体的关键。 常用的酶类有： ( 1 ) 纤维素酶 纤维素酶e a 3 8 6 7 ( q a 国科学院上海植物生理研究所) ； c e l l u l a s eo n o z u k ar 一1 0 ( k i n k iy a k u l tm a n u f c o l t d ，n i s h i n o m i y a , j a p a n ) ； c e l l u l a s eo n o z u k ar s ( r d n k iy a k u l tm a n u f c o l t d ，n i s h i n o m i y a , j a p a n ) ； m e i c e l a s ep ( m e i j is e r k ak a i s h al t d ，t o k y o ，j a p a n ) ； c e l l u l y s i n ( c a l b i o c h e m ，c a l i f o r n i a9 2 0 3 7u s a ) ； c e l l u l a s e ( s i g m ag e r m a n y ) ； d r i s e l a s e ( k y o w ah a k k ok o g y oc o j a p a n ) ； ( 2 ) 果胶酶 p e c t o l y a s ey - 2 3 ( k i k k o m a ns h o y uc o ，j a p a n ) ； m a c e r o z y m eg - 1 0 ( k i n k iy a k u l tm a n u f c o l t d ，n i s h i n o m i y a ，j a p a n ) ； m a c e r o z y m e ( y a k u l tb i o c h e m i c a l sc o ，j a p a n ) ； p e c t i n a s e ( s i g m au s a ) ； p a t e ( p e c t i c - a c i d a c e t y l t r a n s f e r a s e ) ( h o e c h s t ，g e r m a n y ) ； p e c t i n a l ( r o h ma n dh a a sc o i n d ep e n d e n c eh a l lw e s tp h i l a d e p h i a p a 1910 5u s a ) ； ( 3 ) 半纤维素酶 4 第一章绪论 h e m i c e l l u l a s eh - 21 2 5 ( s i g m au s a ) ； r h o z y m eh p 一1 5 0 ( r o h ma n dh a a sc o p h i l a d e l p h i a , p e n n s y l v a n i a l 9 1 0 5u s a ) ； ( 4 ) 崩溃酶( d r i s e l a s e ) ：它是一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活力； ( 5 ) 蜗牛酶：它主要用于体细胞原生质体的制备。 在商品酶制剂中通常含有一些杂质，影响酶的活性及原生质体的质量。因此在使用 前多将酶液在4 c 下通过b i o g e lp 6 或s e p h a d e xg - 2 5 ( 2 0 0 - 4 0 0 孔) 进行脱盐纯化。酶制 剂中也常含有核糖核酸酶影响原生质体活力，因此要适当降低酶解的温度或缩短酶解的 时间，来提高原生质体活力。 1 1 2 4 2 分离原生质体常用的渗透压稳定剂 植物细胞壁对细胞有着良好的保护作用，除去细胞壁后如果酶液中的渗透压和细胞 内的渗透压不平衡，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同或接近，一般渗透压略大些有利于原生质体的稳定，过大会 使原生质体收缩，并阻碍原生质体的启动分裂。 在配制酶液、洗液和培养液中广泛使用的渗透压调节剂主要有山梨醇、甘露醇【1o ，n j ， 浓度约在0 3 o 8 m o l l 。其它一些碳水化合物，如：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖都具有相同 的稳定渗透压的作用。当用非金属离子作渗透压稳定剂时，常在酶液中加入一定量的盐。 例如，加c a c l 2 ( 5 0 - 1 0 0 m m o l l ) 可以大大提高细胞膜的稳定性。葡聚糖硫酸钾，k h 2 p 0 4 及m e s 都可以提高原生质体的稳定性和活力。另外，牛血清蛋白可减少或防止降解细 胞壁过程中细胞器的破坏。 酶液p n 也相当重要，纤维素酶及果胶酶单独使用时，其p n 分别以5 4 及5 8 为宜， 混合使用时以p u s 4 5 6 为宜。p u 降至4 8 以下时，易造成原生质体破裂，酶液配制 后需以0 2 - 一0 4 5 p m 无菌微孔过滤器过滤除菌，不能采用加热灭菌。 1 1 2 5 植物原生质体的纯化 酶消化后的原生质体混合液中常含有多种杂物，如未去壁的细胞、细胞团、细胞器 以及细胞碎片等，需用不锈钢网或尼龙网( 1 0 0 - 4 0 0 耳) 滤出较大杂物，然后将含有酶液 的原生质体混合物收集在离心管中，于5 0 0 1 0 0 0 r p m ( 1 0 0 9 ) 离心5 一1 0 m i n ，使原生质 体沉于管底，弃去上清液，再用洗液( 除不含酶外，其他成分和酶液相同) 反复离心洗涤 3 - - 4 次，最后用原生质体培养液洗涤，备用。经过纯化的原生质体可以配成一定的浓度 用于培养。 5 第一章绪论 1 。1 2 6 植物原生质体的活力鉴定 在原生质体培养前，需对原生质体的活性进行检测。一般根据形态特征即可判断原 生质体的活力。如果把形态上完整、富含细胞质、颜色新鲜的原生质体放入低渗透压洗 涤液或培养基中，可见到分离后缩小的原生质体复原。若成为正常膨大的，一般是有活 力的原生质体。来源于叶片者，呈绿色及圆而鼓者为活原生质体；来源于愈伤组织及悬 浮细胞者，胞质内原生质环流及布朗运动活跃者活力较高。 此外，也可采用特异的染色方法来确定。用0 1 酚番红或伊文思蓝染色，不着色 者为活原生质体，染色者为无活力原生质体。目前比较可靠而方便的是采用荧光素双醋 酸醋f f d a ) 染色法。f d a 本身无荧光，无极性，它能自由透过完整的原生质体膜，一旦 进入原生质体后，便会受到细胞内醋酶的分解，产生有荧光的极性物质一荧光素，它不 能自由透过细胞膜而滞留于原生质体中。如在显微镜下观察，有活力的原生质体带有荧 光，无活力的不产生荧光。 1 1 3 植物细胞融合技术 诱导异源原生质体融合产生异核体即杂种细胞是细胞融合中最关键的环节，原生质 体融合大致可分为离子诱导融合法、高聚分子诱导融合法、电场诱导融合法。 1 9 7 0 年，p o w e r 和c o c k i n g t l 2 l 利用n a + 诱导融合的作用，第一次使玉米和燕麦的根 尖原生质体融合在一起。融合频率仅有1 。李向辉等【1 3 】曾在1 9 7 4 年用0 2 5 m o l ln a n 0 3 诱导蚕豆和红花原生质体间的融合，其频率也只有4 ，由于离子诱导融合法融合率低， 现己不多用。k e l l e y 和m e l c h e r l l 4 1 用0 1 m o l lc a c l 2 和p h 为l o 5 的溶液在3 7 下处理 烟草不同品种的原生质体，使融合频率提高到1 0 左右，并且杂种细胞能再生植株。他 们认为c a 2 + 能促进两种原生质体表面膜的结合，高p h 能改变质膜的表面电荷排列，从 而促进了质膜间的融合，但单独使用这种方法的也不多。目前应用最多的是p e g 结合 高c a 2 + _ 高p h 诱导融合法与电场诱导融合法。 1 1 3 1p e g 结合高c a 高p h 诱导融合法 高国楠等【1 5 1 首先使用p e g 融合法，使大豆和小麦原生质体融合频率明显提高，后 来他又把p e g 法和高c a 2 + 高p h 法结合起来使用，使大豆和粉蓝烟草的原生质体融合频 率达到了1 0 - 3 5 。g l e b a l l 6 1 用此法获得了烟草体细胞杂种植株。黄永胜掣1 7 悃p e g 的“小规模融合法 诱导了玉帘、莺尾、唐营蒲、黄花菜和朱顶红5 种植物同种精细胞 6 第一章绪论 之间、唐菖蒲( g l a d i o l u s g a n d av e n s i sv a n h o u t t e ) 与朱顶红( h i p p e a s t r u mv i t t a t u mh e r o 异种 精细胞之间，黄花菜( h e m e r o c a l l i sm i n o rm i l l ) 精细胞与同种小孢子原生质体之间、朱顶 红精细胞与萱草( h e m e r o c a l l i sf u l v al ) 小孢子原生质体之间以及唐萱蒲精细胞与同种花 瓣原生体之间的融合，均获得了具有生活力的同核体或异核体。李昌功等【1 8 l 用p e g 对 从青菜( b r a s s i c ac h i n e n s i sl ) 花粉分离出的原生质体与甘蓝型油菜( b n a p u sl ) 下胚轴原 生质体融合。钱迎倩等【1 明用p e g 诱导了大豆和烟草融合。f o w k e 2 0 , 2 1 1 用p e g 法分别诱 导了大豆和三叶草及大豆和豌豆之间的融合。肖尊安等1 2 2 1 用p e g 法分别诱导了中华猕 猴桃似d e l i c i o s av a t ：d e l i c i o s a ) 以及与狗枣猕猴桃似k o l o m i k l a ) 间原生质体融合。孙蒙祥 等1 2 3 1 用p e g 法成功地进行了雌性细胞间，雌、雄性细胞间，雌性细胞与体细胞间各种 组合的融合实验。卢萍等【2 4 】用p e g 结合高c a 2 + 高p h 法诱导了烟草( n i c o a a n at o b a c u ml ) 花粉原生质体和烟草( r u s t i c al ) 叶肉原生质的融合。辛化伟等1 2 5 】用p e g 法诱导了水稻 ( o r y z as a t i v al ) 原生质体与无融合生殖大黍( p a n i c u mm a x i m u mj a c q ) 原生质体融合。夏光 敏等1 2 6 1 将普通小麦( t r i t i c u ma e s