（环境科学专业论文）脂肪酶与手性苯氧丙酸类除草剂的对映选择性相互作用.pdf

浙江大学博士学位论文 反应速率下降；而s 2 ，4 d p m 接近酶催化活性中心更加容易，反应速率上 升。以上结果证明，硅藻土对脂肪酶的吸附，引起酶构象变化，优先与 s 一2 ，4 一d p m 对映异构体发生催化作用，是酶促反应的对映体选择性增强的 主要原因。有关环境中吸附行为如何影响酶降解手性农药的对映选择性还 未见类似的报道。 利用上述脂肪酶促水解手性农药2 , 4 一d p m 反应体系，考察了土壤组分 ( 高岭土、腐植酸、不同粒径土壤颗粒) 和氨基酸等小分子对2 , 4 一d p m 对映 选择性水解的影响。高岭土和钙离子对脂肪酶降解手性农药2 , 4 一d p m 的活 性和对映选择性都有显著增强作用。当在反应体系中添加2 0 m g 高岭土时， 对映体比例e r 值从1 3 5 增加到8 3 3 ，酶活也提高了4 9 。腐植酸则对脂 肪酶的对映选择性几乎没有影响。l 精氨酸、l 一谷氨酸对脂肪酶的对映选 择性也没有影响。而带非极性r 基的l 色氨酸与脂肪酶之间存在一定的疏 水相互作用，脂肪酶的对映选择性由1 3 3 下降到了1 2 2 。实验结果还显示， 2 1 t i n 和 以s 型对映体为主要底物的体系 以2 ，4 d 为主要底物的体系。也就是说，当各种化合物与m h 共同培养时， 2 , 4 - d 先被降解，再是s - 2 ，4 d p 和s - m c p p ，最后才是r 2 。4 d p 和r m c p p 。 但m h 和a d e n i t r 咖c a d s 对m c p p 作用的差异性是否表明，后者菌细胞中 不存在以s 型对映体为底物的酶活性体系，还是两种菌的作用方式有着本 2 2 浙江大学博士学位论文 质的差别? s a a r i ( s a a r i ，1 9 9 6 ) 研究了苯氧丙酸类除草荆d i c h l o r p r o p ( 2 ，4 一d p ) 的立 体选择性降解。他们发现来自r a s c 和j m p l 3 4 菌株的2 , 4 d a k g 双氧化 酶( t f d a ) 对2 , 4 一d p 降解的立体选择性完全不同。但对菌株d n a 的p c r 扩 增产物显示，在r a s c 和j m p l 3 4 中，编码t f d a 氨基酸序列的基因相似 性分别达到9 5 和8 6 。这一结果表明，与除草剂降解有关的基因有可 能表现出相反的立体化学降解的能力。 k a l l e n b o r n ( k a l l e n b o r n 。1 9 9 1 ) 首次给出了绒鸭体内酶对a h c h 对映体 选择性降解的实验数据。他们利用手性g c 检测了a h c h 在绒鸭的肝脏、 肾脏和肌肉组织中的存在情况。结果表明，( + ) 一位一h c h 在三种器官中都有 明显的富集，其中肝脏中几乎就是纯的单一对映体，可以认为在肝脏中 ( ) 旺一h c h 比( + ) 一h c h 更易于被酶降解。 在有机磷类化合物对映选择性降解的方面的研究和报道较多， m o n r o y n o y o l a ( m o n r o y n o y o l a ，1 9 9 9 ) 研究了鸡肝细胞中提取的微粒体对 此类化合物的对映体选择性水解，发现该酶促过程中，当反应溶液中配比 为5 m g 组织中提取的微粒体2 5 m m 钙时，r 一异构体与s 一异构体水解速度 接近或稍快：而当微粒体用量在1 0 2 0 m g 时，s 异构体水解速度较快。 细胞色素p 4 5 0 是一类与金属结合的配体形成的酶，在生物细胞中通 过可逆变化而进行电子传递，它与c o 结合后，在4 5 0 n m 处有吸收蜂，因 此得名。在生命过程中，外源化合物的活化和降解都需要细胞色素p 4 5 0 酶系的催化与调控。s c h n e i d e r ( s c h n e i d e r ，1 9 9 8 ) 利用含有细胞色素 p 4 5 0 b m 3 单加氧酶的e ，c o l ik 2 7 ( p c y p l 0 2 ，p g e c 4 7 ) 重组体的十五烷酸对 手性羟基长链脂肪酸进行整个细胞生物催化。结果证实，利用细胞色素 p 4 5 0 b m 3 单加氧酶进行的氧化具有高度的立体选择性。 k i s h i m o t o 等( k i s h i m o t oe ta 1 ，1 9 9 5 ) 和h u 等( h ue ta 1 2 0 0 2 ) 研究了 鼠和人肝脏中农药甲氧滴滴涕( m e t h o x y c h l o r ) 的氧位脱甲基化过程，发现这 一酶促反应具有对映体选择性。 l a n d s i e d e l 等( l a n d s i e d e le la 1 ，1 9 9 8 ) 研究了单一细胞色素p 4 5 0 ( v 7 9 ) 在l 一乙基芘形成1 一羟乙基芘( 1 h e p ) 过程中以及从白鼠和人体组织中提取 的酶在1 一乙酰芘形成1 羟乙基芘过程中的对映体选择性。 近年来，刘维屏教授课题组在国内率先丌展了这一领域的工作。他们 2 3 浙江大学博士学位论文 在有机磷、拟除虫菊酯的手性拆分( l i ue ta l ，2 0 0 4 c ；l i ue ta 1 ，2 0 0 4 b ) 、对 映体异构体稳定t 陛( l i u e ta 1 ，2 0 0 5 ) 、对映选择性降解( l i ue ta 1 ，2 0 0 4 d ；l i u p ，2 0 0 4 a 1 、毒理的对映体差异( l i ue t a l ，2 0 0 4 b ) 方面进行了开刨性的工 作，不仅获得了实验室的和现场的对映选择性降解资料，也推动了手性农 药的环境行为的研究向纵深方向发展。 1 5 本文研究内容和意义 手性农药的大量生产和广泛使用，不可避免地使其进入水体、土壤等 环境。在目前外消旋体农药仍占据大多数的情况下，有必要对农药各个对 映异构体在环境中的毒性、致畸、内分泌干扰等进行仔细研究。应该指出 的是，虽然在手性农药与生物体相互作用的对映体差异方面进行了大量工 作，但从酶与手性农药的相互作用等分子层面上进行探讨的研究报道还比 较少。此外，酶作为生物友好的环境污染修复剂，研究其降解手性农药的 机理与动力学，在手性农药的污染修复方面有着重要的现实意义。虽后， 酶的手性催化机理研究在手性药物的不对称合成与拆分方面有着重要的 理论价值，同时也是当今化学领域最热门和最前沿的领域之一f t o o ne ta 1 2 0 0 3 ) 。 因此，本文选择了手性苯氧丙酸类除草剂和脂肪酶作为研究对象，研 究了农药对酶抑制动力学的对映体差异和酶对农药的手性水解。在此基础 之上，我们对吸附作用、土壤组分、环糊精等影响农药手性水解的各种因 素进行了讨论。最后，还首次利用化学修饰技术鉴定了脂肪酶分子中的几 种氨基酸侧链基团在手性催化过程中的功能。 2 4 浙江大学博士学位论文 参考文献 段文贞，张均田，1 9 9 8 中国药理学与毒理学杂志，1 2 ( 1 ) ：1 6 1 9 高修功，曹淑桂，章克昌，1 9 9 7 生物化学与生物物理学报，2 9 ：3 3 7 3 4 1 刘军民，许建和，刘幽燕，许学书，袁勤生，1 9 9 8 c h e m i c a lj o u r n a lo f c h i n e s eu n i v e r s i t i e s ( i nc h i n e s 叫，1 9 ( 1 2 ) ：1 9 5 9 1 9 6 3 刘鹏飞，刘西莉，马安捷等，2 0 0 3 农药学学报，s ( 3 ) ：4 5 4 9 聂尧，徐岩，王栋，2 0 0 2 过程工程学报，2 ：5 7 0 5 7 6 宋欣主编，2 0 0 4 现代微生物技术丛书一一微生物酶转化技术，现代 生物技术与医药科技出版中心，p p l 2 3 - 1 5 3 唐徐痴，李煜昶编，1 9 9 8 农药化学，南开大学出版社 许建和，刘军民，许学书等，1 9 9 9 生物工程学报，1 5 ：2 6 7 2 6 9 杨光富，袁继伟1 9 9 9 农药译丛，2 l ( 2 ) ：1 - 1 2 a b u c h o w s k i ，a ；v a n ，e t ；p a l c z u k ，c n ，e ta 1 ，l9 7 7 ，b i 0 1 c h e m ，2 5 2 ： 3 5 7 8 3 5 8l a n d e r s o n ，a j ；d a w e s ，e a ，19 9 0 m i c r o b i 0 1 r e v ，5 4 ：4 5 0 4 7 2 b a l e a o ，vm ；p a i v a ，a ，l ；m a l c a t a ，f x ，1 9 9 6 e n z y m em i c r o b t e c h n 0 1 ， 1 8 ：3 9 2 - 4 1 6 b a s r i ，m ；a m p o n ，k ；y u n u s ，w m z ，e la 1 ，1 9 9 2 ，a m o i lc h e ms o c ， 6 9 ：5 7 9 - 5 8 3 b j o r k l i n g ，f ；d a h l ，a ；p a t k a r ，s ；z u n d e l ，m ，1 9 9 4 b i o r g a n m e d c h e m ，2 6 9 7 - 7 0 5 b o r g s t r o m ，b ；b r o c k m a n ，h l ，e d ，1 9 8 4 “l i p a s e s ”，a m s t e r d a m ：e l s e v i e r , p p 3 - 4 6 b r a d y ，l ；a n d r z e i ，m ；b r z o z o w s k i ，e ta 1 ，19 9 0 n a t u r e ，3 4 3 ：7 6 7 - 7 7 0 b r a n c o ，l ；d a b u l i s ，k ；k i l i b a n o v a m ，1 9 9 0 p r o c n a t la c a d s c i 8 7 ： 2 7 4 2 7 7 c a r d e n a s ，f ；a l v a r e z ，e ；c a s t r o a l v a r e z ，m s ，e ta 1 ，2 0 0 1 ，m o l e c u l a r c a t a l y s i sb e n z y m a t i c 1 4 ：1 1 1 1 2 3 c a r r i s o n ，a w ；s c h m i t t ，p ；m a r t e n s ，d ，1 9 9 6 e n v i r o n s c i t e c h n o f ，3 0 ： 2 4 4 9 2 4 5 5 浙江大学博士学位论文 c a v a l i e r ，j f ；r a n s a c ，s ；v e r g e r ，r ；b u o n o ，q ，l9 9 9 c h e m i s t r ya n d p h y s i c so f z i p i d s ，1 0 0 ：3 - 3 1 c y g l e r , m ；g r o c h u l s i ，p ；k a z l a u s k a s ，r j ；s c h r a g ，r d ；b o u t h i l l i e r , f ； r u b i n ，b ；s e r r e q i ，a n ；g u p t a ，a k ，19 9 4 a m c h e m ，s o c 1 1 6 ： 3 1 8 0 - 3 18 6 d o r d i c k ，j s ；m a r i e t t a ，m ，a ，；k l i b a n o v , a m ，19 8 6 。p r o c n a t t a c a d s c i ， 8 3 ：6 2 5 5 6 2 5 7 e g l o f f , m p ；m a r g u e t ，f ；b u o n o ，g ；v e r g e r ，r ；c a m b i l l a u ，c ；v a n t i l b e u r g h ，h ，1 9 9 5 b i o c h e m i s t r y , 3 4 ：2 7 5 1 - 2 7 6 2 f e r n a n d e z l a f u e n t e ，r ；a r m i s e n ，p ；s a b u q u i l l o ，p - ；f e r n a n d e z l o r e n t e ，g ； g u i s a n ，j m ，1 9 9 8 c h e m i s t r ya n d p h y s i c s 三咖i d s ，9 3 ：1 8 5 1 9 7 g u o ，z w ；s i h ，c j ，1 9 8 9 ，a m c h e m ，s o c ，1 1 1 ：6 8 3 6 6 8 4 1 h e ，b ；z h a n g ，y ；z h a n g ，t ；w a n g ，h r ；z h o u ，h m ，l 9 9 5 ，p r o t e i n c h e m 1 4 ：3 4 9 3 5 7 h o r v a t h ，m g ；d i t z e l m u l l e r ，m l ，e ta 1 ，19 9 0 a p p l m i c r o b i 0 1 b i o t e c h n 0 1 3 3 ：2 1 3 2 1 6 h u ，y ；k u p f e r ，d ，2 0 0 2 d r u gm e t a b d i s p o s ，3 0 ：1 3 2 9 1 3 3 6 h u a n g ，a h c ，1 9 8 4 “l i p a s e s ”( b o r g s t r o m ，b a n db r o c k m a n ，h l ，e d s ) e l s e v i e r a m s t e r d a m ，p p 3 6 5 - 4 1 6 i n a d a ，y t ；n i s h i m u r a ，h ；t a k a h a s h i ，k ，e ta 1 ，1 9 8 4 b i o c h i mb i o p h y s r e s c o m m u n ，1 2 2 ：8 4 5 - 8 5 0 k a d e r a ，y ；t a k a h a s h i ，k ；n i s h i m u r a ，h ，e ta t ，1 9 8 6 b i o t e c h n o tl e t t ，8 ： 8 8 1 8 8 8 k a i m a l ，t n b ；s a r o j a ，m ，1 9 8 9 b i o t e c h n o ll e t t ，1 1 ：3 1 k a l l e n b o r n ，1 9 9 1 ，a n g e mc h e m ，i n t 磁e n 9 1 ，3 0 ( 3 ) ：3 2 0 - 3 2 l k a n j i ，n ，19 9 7 e n z y m em i c r o b t e c h n o l ，2 0 ：3 3 3 - 3 3 9 k a w a s e ，m ；t a n a k a ，a ，1 9 8 9 e n z y m em i c r o b t e c h n o l ，1 1 ：4 4 k i s h i m o t o ，d ；o k u ，a ；k u r i h a r a ，n ，1 9 9 5 ，p e s t b i o c h e m p h y s 5 1 ：1 2 一1 9 k i t a g u c h i ，h ；l t o h ，i ；o n o ，m ，1 9 9 0 c h e ml e t t ，1 2 0 3 1 2 0 6 k l i b a n o v a ，m ，1 9 9 0 a c o t s c h e mr e s 2 3 ：1 1 4 1 2 0 k o u i c h i ，m ：、，a s u s h i ，n ；m a s a h i r a ，n ，1 9 8 7 e p 0 2 1 0 7 6 1a 1 浙江大学博士学位论文 l a n d s i e d e l ，1 9 9 8 t o x i c o l o g yl e t t e r s ，9 5 ( 1 ) ：9 4 9 7 l e e ，s y ；l e e ，y ；w a n g ，f ，1 9 9 9 b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，6 5 ：3 6 3 3 6 8 l i n ，g ；t s a i ，yc ；l i u ，h c ；l i a o ，wc ；c h a n g ，c h ，19 9 8 b i o c h i m b i o p h y s a c t a , 1 3 8 8 ：1 6 1 1 7 4 l i n d e r m a n ，r j ；r o e ，r m ；h a r r i s ，s v ；t h o m p s o n ，d m ，2 0 0 0 i n s e c t b i o c h e m i s t r ya n d m o l e c u l a r b i o l o g y , 3 0 ：7 6 7 7 7 4 l i u ，w p ；g a n ，j j ；s c h l e n k ，d ；j u r y ，w a ，2 0 0 4 a p n a s , 1 0 3 ：7 0 1 7 0 6 l i u ，w p ；g a n ，j j ，2 0 0 4 b ，a g r i c f o o dc h e m ，5 2 ：7 3 6 7 4 1 l i u ，w p ；g a n ，j j ，2 0 0 4 c ，a g r i c f o o dc h e m ，5 2 ：7 5 5 - 7 6 1 l i u ，wp ；g a n ，j ；l e e ，s j ；w e r n e r ，i ，2 0 0 4 d ，a g r i c f o o dc h e m ，5 2 ： 6 2 3 3 6 2 3 8 l i u ，w p ；q i n ，s j ，g a n ，j j ，2 0 0 5 t ，a g r i c f o o dc h e m ，5 3 ( 1 0 ) ： 3 8 1 4 3 8 2 0 l i u ，yy ；x u ，j h ；h u ，y ，2 0 0 0 j o u r n a lo fm o l e c u l a rc a t a l y s i s b j e n z y m a t i c ，1 0 ：5 2 3 - 5 2 9 l u n d b l a d ，r l ，1 9 9 5 “t e c h n i q u e s i np r o t e i nm o d i f i c a t i o n ”c r cp r e s s ， b o c ar a t o n ，f l l u t h i - p e n g ，q ；m a r k i ，h p ；h a d v a r y , p ，1 9 9 2 f e b s , 2 9 9 ：1 1 1 m a n n e s s e ，m l m ；b o o t s ，j w p ；d i j k m a n ，r ；s l o t b o o m ，a 。j ；v a nd e r h e i j d e n ，h t w m ；e g m o n d ，m r ；v e r h e i j ，h m ；d eh a a s ，gh ， 1 9 9 5 b i o c h i m b i o p h y s a c t a ，1 2 5 9 ：5 6 6 4 m e a n s ，g e ；f e e n e y ，r e ，1 9 6 8 b i o c h e m i s t r y , 7 ：2 1 9 2 m o n r o y n o y o l a ，a ，1 9 9 9 t o x i c o l o g yi nv i t r o ，1 3 ：6 8 9 - 6 9 2 m u l l e r , m d ；b u s e r ，h r ，1 9 9 7 e n v i r o n s c i t e c h n 0 1 ，3 1 ：1 9 5 3 1 9 5 9 m u r a k a m i ，m ；k a w a s a k i ，y ；k a w a n a r i ，m ，e la 1 ，1 9 9 3 ，a m ，0 i ic h e m s o c ，7 0 ：5 7 1 n i c k e l ，k ；s u t e r , m j f ；k o h l e r ，h p e ，1 9 9 7 ，o f b a c t e r i o l o g y ，1 7 9 ： 6 6 7 4 6 6 7 9 o k a h a t a ，y ；f u j i m o t o ，y ；l j i r o ，k ，1 9 9 5 ，o r g c h e m ，6 0 ：2 2 4 4 2 2 5 0 p a t k a r ，s ；b j o r k l i n g ，f ，“l i p a s ei n h i b i t o r s ”，i n ：w o o l e y ，p ；p e t e r s e n ，s b ( e d s ) ，19 9 4 ，“l i p a s e s t h e i rs t r u c t u r e ，b i o c h e m i s t r ya n da p p l i c a t i o n ”， 2 7 c a m b r i d g eu n i v e r s i t yp r e s s ，c a m b r i d g e ，u k ，p p 2 0 7 2 2 4 r a d i o n o v a ，m v ；b e l o v a ，a b ；m o z h a e v ，vv r ，1 9 8 7 m e t h o d se n z y m o l ， 1 3 5 ：5 8 6 5 9 0 r a n s a c ，s ；d e v e e r ，a m ；r i v i e r e ，c ，e ta 1 ，1 9 9 2 b i o c h i m b i o p h y s a c t a ， 1 1 2 3 ( 1 ) ：9 2 1 0 0 s a a r i ，r e ，1 9 9 6 ，m o l e c u l a rc a t a l y s i s 口je n z y m a t i c ( 6 ) ：4 2 1 4 2 8 s a r a s w a t h i ，s ；k e y e s ，m m ，1 9 8 4 e n z y m em i c r o b t e c h n 0 1 ，6 ：9 8 1 0 3 s a r d a ，l ；d e s n u e l l e ，p ，19 5 8 b i o c h i m b i o p h y s a c t a , 3 0 ：5 13 s c h n e i d e r ，1 9 9 8 t e t r a h e d r o n ：a s y m m e t r y , 9 ( 1 2 ) ：2 8 3 3 - 2 8 4 4 s c h n e i d e r h e i n z e ，j m ；a r m s t r o n g ，d w ；b e r t h o d ，a ，1 9 9 9 c h i r a l i t y , ( 11 ) ： 3 3 0 - 3 3 7 s c h r a g ，j d ；y u n g e ，l ；s h a n ，w ，e ta 1 ，1 9 9 1 n a t u r e ，3 5 1 ：7 6 1 7 6 4 s h i ，q q ，1 9 8 1 m i c r o b i o l o g y , 8 ( 3 ) ：1 0 9 - 1 1 0 s t a d l e r ，p ；z a n d o n e l l a ，g ；h a a l c k ，l ；s p e n e r ，f ；h e r m e t t e r ，a ；p a l t a u f , f ， 19 9 6 b i o c h i m b i o p h y s a c t a ，1 3 0 4 ：2 2 9 2 4 4 t a m a u r a ，y ；t a k a h a s h i ，k ；k o d e r a ，y ，e ta 1 ，1 9 8 6 b i o t e c h n 0 1 l e t t ，8 ： 8 7 7 8 8 2 t a n g ，z y ；y u ，j y ；z h o u ，q ；h e ，b ；z h o u ，h m ，1 9 9 5 ，b i o c h e m ，1 1 8 ： 7 0 6 7 0 9 t e t t ，v a ；w i l l e t s ，a j ，1 9 9 4 m i c r o b i a l e c 0 1 ，1 4 ：1 9 l 一2 0 0 t o m o d a ，h ；o h b a y a s h i ，n ；k u m a g a i ，h ；h a s h i z u m e ，h ；s u n a z u k a ，t ； o m u r a ，s ，1 9 9 9 b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n ，2 6 5 ：5 3 6 5 4 0 t o o n ，t p ；j a c o b s e n ，e n ，2 0 0 3 s c i e n c e ，2 2 9 ( 1 4 ) ：1 6 9 1 - 1 6 9 3 t s o u ，c l ，1 9 6 5 a c t ab i o c h i mb i o p h y ss i n ( i nc h i n e s e ) ，5 ：3 9 8 4 1 7 t s u z u k i ，w ；s u z u k i ，t ，1 9 9 1 b i o c h i m b i o p h y s a c t a ，1 0 8 3 ：2 0 1 2 0 7 v a n t i l b e u r g ，h ；s a r d a ，l ；v e r g e r ，r ，e la l ，19 9 2 n a t u r e ，3 5 9 ：15 9 16 2 v e r g e r ，r ，19 9 7 t 1 b t e c h , 1 5 ：3 2 w a n g ，h r ；z h a n g ，t ；z h o u ，h m ，1 9 9 5 b i o c h i mb i o p h y sa e t a , 1 2 4 8 ： 9 7 1 0 6 w a n g ，z x ，；t s o u ，c ，l ，19 8 7 ，t h e o rb i o l ，1 2 7 ：2 5 3 。2 7 0 w u ，s g ；x i e ，x d ，；h u a n g ，j z ；s h i ，q q ，1 9 9 7 a c t am i c r o b i o l o g i c a 浙江大学博士学位论文 s i n i c a ，3 7 ( 1 ) ：3 2 3 9 w u ，s h ；g u o ，z w ：s i h ，c j ，1 9 9 0 ，a m c h e m s o c ，1 1 2 ：1 9 9 0 1 9 9 5 y a o ，q z ；l i a n g ，s j ；t i a n ，m ；t s o u ，c ，l ，1 9 8 5 s c i s n ，2 8 b ：4 8 4 - 4 9 3 y a o ，q ，z ；t i a n ，m ；t s o u ，c l ，19 8 4 b i o c h e m i s t r y , 2 3 ：2 7 4 0 2 7 4 4 y o s h i m o t o ，t ；m i h a m a ，t ；t a k a h a s h i ，k ，e ta 1 ，1 9 8 7 b i o c h i m b i o p h y s r e s c o m m u n ，1 4 5 ：9 0 8 914 z h a n g ，y ；c h e n ，p r ，；h e ，b ；z h o u ，h m ，1 9 9 4 s c i e n c ei nc h i n a , 3 7 b ： 1 4 7 1 一1 4 7 8 z i p p e r c ；s u t e r , m j f ；h a d e r t e i n ，s b ，e la l ，1 9 9 8 e n v i r o n s c i t e c h n o l ，3 2 ：2 0 7 0 2 0 7 6 z i p p e r ，c ；b o l l i g e r ，c ；f l e i s c h m a n n ，t ，e ta 1 ，1 9 9 9 b i o d e g r a d a t i o n 1 0 ： 2 7 1 2 7 8 z i p p er ，c ；n i c k e l ，k ；a n g s t ，w ，e ta l ，1 9 9 6 a p p l e n v i r o n m i c r o b i 0 1 6 2 ： 4 3 1 8 4 3 2 2 z i p p e r ，c ；b u n k ，m ；z e h n d e r ，a j b ，e ta l ，1 9 9 8 ，b a c t e r i 0 1 1 8 0 ：3 3 6 8 3 3 7 4 z i p p e r ，c ；f l e i s c h m a n n ，t ；k o h l e r ，h p e ，1 9 9 9 m i c r o b i o l o g ye c o l o g y , 2 9 ： 19 7 2 0 4 浙江大学博士学位论文 第二章材料与实验方法 2 1 试剂与药品 试剂名称纯度来源 青霉扩展菌脂肪酶 1 0 0 0 0u g l e v e m n gb i o l o g ye n g i n e e r i n gc o ，l t d 牛血清蛋白生化试剂 s i g m a 考马斯亮蓝g 2 5 0超纯a m r e s c o 分装 荧光素二乙酯分析纯 s i g m a 荧光素分析纯上海生工生物工程有限公司 2 , 4 - 二氯苯氧丙酸甲酯 9 9 课题组合成 2 , 4 一二氯苯氧丙酸 9 9 课题组合成 2 - 甲基- 4 壕【苯氧丙酸 9 9 课题组合成 甲醇色谱纯中国医药集团上海化学试剂公司 正己烷分析纯 浙江杭州萧山化学试剂厂 乙酸乙酯分析纯浙江杭州萧山化学试剂厂 丙酮分析纯 浙江杭州双林化工试剂厂 磷酸二氢钾分析纯浙江湖州湖试化学试剂有限公司 磷酸氢二钠分析纯浙江湖州湖试化学试剂有限公司 磷酸分析纯汕头市化学试剂厂 硝酸钙分析纯 浙江杭州萧山化学试剂厂 b 一环糊精 9 9 上海伯奥生物科技有限公司 高岭士分析纯奉贤丰城化学试荆公司 硅藻土分析纯u s p 进口分装 腐殖酸化学纯上海试n - - 厂 l 谷氨酸层析纯上海康达氨基酸厂 l 色氨酸层析纯上海康达氮基酸厂 l 精氨酸层析纯上海康达氨基酸厂 对氯汞苯甲酸分析纯c a r lr o t hk g d 7 5k a r l s r u h e 2 1 溴乙酸分析纯 中国医药集团上海化学试剂公司 乙酰丙酮分析纯 中国医药集团上海化学试剂公司 甲醛分析纯 上海试剂总厂 n 溴代琥珀酰弧胺分析纯 中国医药集团上海化学试剂公司 浙江大学博士学位论文 2 2 实验仪器与设备 仪器名称型号 气相色谱仪 岛津g c 2 0 1 0 气相色谱仪安捷伦6 8 9 0 n 手性气相色谱柱 b g b 1 7 2 手性气相色谱柱 b g b 1 7 6 普通毛细管气相色谱柱 d b 5 紫外可见光谱仪岛津u v - 2 4 0 1 p c 荧光光谱仪 日立f 2 5 0 0 p c 低速离心机l d 5 2 a 数控恒温振荡器 z h d 一5 a 数控超级恒温槽s c 1 5 p n 计 p h s 9 v 电子天平m e l t l e ra e 2 0 0 超低温冰箱 s a n y o m e d i c a lf r e e z e r 2 3 实验方法 一、m c i - p 、2 , 4 d p 及其甲酯和p c d 及其衍生物的制备 1 手性除草剂m c p p 、2 , 4 d p 及其甲酯的合成 2 , 4 一d p 和m c p p 的合成参照专利文献( u s4 6 2 2 4 1 5 ) 。 称取2 , 4 二氯苯酚8 9 加入三口烧瓶，加t h f 溶解，然后加入n a 2 c 0 3 6 9 ，搅拌半小时，滴加2 氯丙酸，加毕，回流1 2 h 。冷却，酸化，用二氯 甲烷萃取，水洗，干燥，重结晶得2 , 4 一d p 。 m c p p 合成方法类似。 2 2 ，4 一d p m 的合成( w e n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 取l gn 甲基n 亚硝基对甲苯磺酰胺倒入1 0 0 m l 三口圆底烧瓶，加 1 0 m l 甲醇，在一个瓶口插入氮气导管，向烧瓶鼓泡，中间瓶口插盛有5 0 o n a o h 的1 0 0 m l 恒压分液滤斗，慢慢滴加n a o h 溶液，产生的重氮甲烷， 通过氮气导入盛有2 m l2 , 4 d p 的小烧瓶中，对2 , 4 - d p 进行甲基化，用h p l c 监测2 4 d p m 的合成情况。 3 b c d 及其衍生物的合成 羧甲基1 3 环糊精( c m 邛c d ) 参照文献报道方法合成( 于淑丽等，2 0 0 1 ) 。 羟丙基b 一环糊精( h p b c d ) 参照文献报道方法合成( 冯呜等，1 9 9 7 ) 。部分甲 浙江大学博士学位论文 基化一b 一环糊精( p m 1 3 c d ) 参照文献报道方法合成( 高士祥等，1 9 9 9 ) 。 4 6 c d s 与2 ，4 一d p m 包结物的制备 c d s 2 4 d p m 的化学合成方法参照文献( x ue la 1 ，2 0 0 2 ) 。将o 2 4 9 9 2 , 4 一d p m 溶于2 m l 浓度为9 5 的乙醇中，然后将其缓慢滴入1 0 0 m l 溶有 1 1 3 5 93 - c d 的水溶液中，6 0 。c 微波振荡5 小时。4 c 保温1 2 h 后用0 4 5 p m 的微孔滤膜过滤，沉淀物6 0 。c 干燥。c m - 1 3 一c d - 2 ，4 - d p m 的合成步骤是将 0 2 4 9 92 , 4 d p m 溶于2 m l9 5 的乙醇中，然后缓慢滴入到1 0 m l 溶有2 o g c m b c d 的水溶液中，6 0 微波振荡5 小时。4 保温1 2 h ，过滤，6 0 干燥。p m p 。c d 一2 ，4 一d p m 的合成与c m p c d 2 ，4 d p m 的合成方式相同。 二、( r ，s ) 2 ，4 d p m 的气相色谱拆分及绝对构型鉴定 1 b g b l 7 6 手性柱上的拆分( f a n g e la 1 ，2 0 0 5 ) 安捷伦6 8 9 0 n 气相色谱仪和微池电子捕获检测器( e c d ) 用于手性气 相色谱分析，手性色谱柱为b g b l 7 6 。无分流模式进样，进样量为l u l 。柱 温1 4 0 ，载气为氮气，流量为1 2 m lr a i n 。在上述条件下，限s ) 2 ，4 一d p m 的对映异构体得到很好的分离。对映体比例( e r 值) 定义为r 型异构体峰面积除 以s 型异构体峰面积的比值( h e n ke la 1 ，2 0 0 0 ) 。r 2 ，4 d p m 保留时问为 3 2 6 m i n ，s 2 ，4 d p m 保留时间为3 5 0 m i n 。 2 绝对构型的鉴定 利用手性合成的r 一2 ，4 d p m 和s 一2 ，4 d p m 单一对映体，对气相色谱 中的峰进行了构型鉴定，结果如图( f i g 2 一1 ) 所示。 f i g 2 - 1 c h i r a lc h r o m a t o g r a p h yo f ( r ，s ) 一2 ，4 - d p me n a n t i o r c t e r s 浙江大学博士学位论文 3 b g b l 7 2 手性柱上的拆分( w e ne ta 1 ，2 0 0 4 ) g c 一2 0 1 0 气相色谱和电子捕获检测器( e c d ) 用来进行2 , 4 一d p m 对映异 构体的分析。e c d 温度为2 3 0 。c ，检测器补充气为n 2 ( 6 0 m lr a i n 。1 ) ；进样口 温度2 0 0 ，进样量1 9 l ，分流比为3 0 ；载气( h e ) 流速为1 2 m lm i n 。 手性分离柱为3 0 m o 2 5 m m x 0 2 5 9 m 的b g b 一1 7 2 柱。柱温为：1 4 0 5 0 m i n 。在上述条件下，( r s ) 一2 ，4 d p m 的对映异构体得到很好的分离。 s 一2 ，4 一d p m 保留时间为4 3 5 m i n ，r 一2 ，4 。d p m 保留时间为4 4 1 m i n 。 三、脂肪酶活性测定方法 1 脂肪酶蛋白含量测定 蛋白含量测定采用b r a n d f o r d 法( b r a n d f o r d ，1 9 7 6 ) ，以牛血清蛋白( b s a ) 为标准蛋白质。标准b s a 溶液：称取2 5 m g 牛血清蛋白，用去离子水定容 为2 5 0 m l ，浓度为】0 0 m gl 。染料试剂：称取考马斯亮蓝g 一2 5 01 2 0 m g ， 溶于2 0 0 m l3 高氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，贮于棕色瓶中。 测定步骤：以一系列不同浓度的标准b s a 溶液2 m l ，分别加入染料试 剂2 m l ，立即混匀，测定6 2 0 n m 波长处的吸光度a 6 2 0 。以去离子水加染料 试剂2 m l ，作为比色空白对照，绘制标准曲线。用上述方法，测定样品溶 液中的a 6 2 0 值，然后查得蛋白质浓度。 2 脂肪酶活力的测定 酶活性测定以荧光素二乙酯( f d a ) 作为脂肪酶的水解底物( l i ue ta l 1 9 9 3 ) ，在h i t a c h if 2 5 0 0 荧光光谱仪上进行。比色池用s c 15 型超级恒温 槽进行电子控n ( 2 5 c ) 。p a l 可以将f d a 转化成荧光素和乙醇。荧光素最 大激发波长为4 9 2 n m ，最优发射波长为5 1 4 n m 。总体积为5 m l 的反应液中 包括以下一些组分：5 0 m m p h 7 0 0 磷酸缓冲溶液，0 5 m mf d a 和含有0 8 m g p a l 的样品。由于f d a 的水解，溶液荧光强度的逐渐增强，记录反应进 行2 0 0 秒的荧光强度对时间的变化率。每个处理水平设置三个平行，并以 不含酶的溶液作为空白对照。 3 脂肪酶对映选择性的测定 酶促水解实验参照文献报道的方法( f a n ge ta l ，2 0 0 5 ) ，并略有改进。 修饰前后的p a l 的对映选择性酶促反应在无光照条件f 进行。在5 0 m l 具 塞三角瓶中移入1 0 h a l 缓冲溶液，再依次加入含有5 m gp a l 的样品和0 2 m l ( r ，s ) - 2 4 一d p m 储备液( 1 0 m gm l “) 。混合液置于2 5 的恒温振荡器中反应， 浙江大学博士学位论文 振荡速度为1 2 0 r p m 。反应结束后，定量移取2 0 0 p 1 反应液，将残留的底物 萃取到2 m l 正己烷中，经无水硫酸钠干燥后，用手性气相色谱进行分析。 每个处理样品重复三次，以不含酶的溶液用于酶活力空白实验。 四、脂肪酶抑制动