（应用化学专业论文）萘基喹啉嵌入型T·AT三链DNA荧光探针研究.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 三链d n a 技术具有可选择性调控基因的表达、基因的定点突变、基因的修 复、原位染色体的标记和基因分予诊断等作用，因此以三链d n a 为背景的反基 因战略提供了治疗某些疾病的“新型药物”概念。以反基因战略为背景的各种三 链d n a 工具无论从化学、生物学和药物学的角度都具有重大的理论及现实意义， 已经成为近几年来的研究热点之一。本文以4 - 氯2 一( 2 一萘基) 喹啉为嵌入团，设计 合成了类含有三链d n a 嵌入剂、连接臂和荧光团的新型t a t 三链d n a 荧光 探针，同时设计合成了一些三链d n a 双嵌入剂。 设计并合成了一系列以j _ 双一( 3 氨基丙基) 甲胺为连接臂，以丹磺酰胺和萘 酰亚胺为荧光团的三链d n a 荧光探针。其原理是荧光探针与三链d n a 结合后， 由于嵌入剂嵌入到三链d n a 中引起淬灭团和荧光团之间距离的变化，从而造成 荧光探针光谱的变化。研究发现这些化合物嵌入到三链d n a 后都可明显引起三 链d n a 解链温度的升高，而对双链d n a 解链温度几乎没有改变，显示出这类化 合物对于三链d n a 具有很好的选择性。设计的大多数荧光探针对于t a t 三链 d n a 都有明显的荧光增强。 设计并合成了一系列以m 双( 3 氨基丙基) 哌嗪为连接臂，以丹磺酰胺、 萘酰亚胺和菁染料为荧光团的三链d n a 荧光探针，使探针的柔性长链连接臂具 有某种程度的刚性。研究发现，当d n a 与这类化合物以5 ：1 的摩尔比结合时，t a t 三链d n a 的为2 6 3 0 。c ，明显高于对应的a t 双链d n a 的值( 2 。c 左右) ， 结果与m - 双( 3 氨基丙基) 甲胺连接臂的探针类似。而以m 一双一( 3 一氨基丙基) 哌嗪为连接臂的探针对t a t 三链d n a 则有更大的荧光增强( 4 1 0 倍) 。论文 提出用荧光法测量2 a 与三链d n a 复合物的解链温度，通过和紫外吸收法的对照 验证，证明荧光法是一个可靠的测量2 a 与三链d n a 复合物解链温度的方法，并 用s m a r tc y c l e rd n a 扩增仪验证了荧光法与紫外吸收法的一致性。最后用a m l 半经验量子化学计算模拟l a 和2 a 的分子构型，就两个探针分子对三链d n a 具 有不同的荧光增强给出了解释。 依据嵌入剂嵌入到三链d n a 中引起光诱导电子转移( p e t ) 造成荧光强度变 化的机理，合成了3 a ，3 c2 个未见报道的以乙二胺为连接臂，以丹磺酰胺、萘酰 亚胺为荧光团的三链d n a 荧光探针。化合物3 a 对于t a t 三链d n a 有很明显的 荧光增强，并通过测量化合物3 a 对p h 的响应验证了p e t 的作用机理。 设计合成了双嵌入剂n 1 一n 8 及单嵌入剂n o ，通过紫外可见光谱测定了化合 蔡基噻啉嵌入型t a t 三链d n a 荧光探针研究 物对不同d n a 解链温度的影响，同时着重考察了化合物n 6 的浓度对d n a 的解 链温度的影响。证实经过适当的设计，双嵌入剂能够对t - a t 三链产生选择性的 稳定作用，并且它对三链d n a 的识别作用和稳定作用均要大于相应的单嵌入剂。 关键词：三链d n a ，t t a t 三链d n a 荧光探针，萘基喹啉，三链d n a 稳定性 双嵌入剂。 i l 夫连理工大学博士学位论文 a b s t r a c t d n a t r i p l e h e l i xf o r m a t i o ni s o fg r e a tp o t e n t i a l i n c l u d i n gs e l e c t i v ec o n t r o lo f g e n ee x p r e s s i o n ，s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，g e n er e p a i r ，i ns i t uc h r o m o s o m el a b e l l i n g a n do t h e rm o l e c u l a rd i a g n o s t i c s ，t h u st h e a n t i g e n es t r a t e g yb a s e do nt r i p l e xd n a o f f e r sn e wt h e r a p e u t i ca p p l i c a t i o n s t r i p l e xd n at o o l so nt h i sb a s i sa r eo fg r e a t i n t e r e s tf r o mt h es t a n d p o i n to fc h e m i s t r y ，m e d i c i n ea n d b i o l o g y i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，a s e r i a lo ft a tt r i p l e xd n a p r o b e sc o m p o s e d o f t r i p l e xd n ai n t e r c a l a t o r ，s p a c e ra n d f l u o r o p h o r e w e r e s y n t h e s i z e d a n de v a l u a t e d s o m e t r i p l e x d n ab i s i n t e r c a l a t o r l i g a n d sw e r ea l s os y n t h e s i z e da n d e v a l u a t e d as e r i a lo f t r i p l e x d n a p r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d i nt h e p r o b e ， n - b i s 一( 3 - a m i n o p r o p y l ) a m i n ew a su s e d a s s p a c e r ，d a n y lo r4 - a m i n o n a p h t h a l i m i d e w a su s e da sf l u o r o p h o r e t h ef l u o r e s c e n c eo ft h ep r o b ei sw e a kb e c a u s et h ed i s t a n c e b e t w e e nt h ei n t e r c a l a t o ra n dt h e f l u o r o p h o r e i s v e r y c l o s ei nf r e e s t a t e u p o n i n t e r c a l a t i n gi n t oat r i p l e xd n a ，h o w e v e r ，t h ep r o b ee m i t sg r e a t e r ，f l u o r e s c e n c ed u e t o t h ei n c r e a s eo ft h ed i s t a n c eb e t w e e nt h et w om o i e t i e s w ef o u n dt h a tt h e s ep r o b e s w e r et r i p l e xs e l e c t i v eb e c a u s et h e yc o u l dh i g h l ye n h a n c et h et mo ft 。a tt r i p l e x ，b u t h a r d l ye n h a n c et h e o f a t d u p l e x m o s tc o m p o u n d sh a df l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t t ot h et a tt r i p l e x a n o t h e rs e r i a lo ft r i p l e xd n ap r o b e sw e r e s y n t h e s i z e d ，w h o s es p a c e r w a s m 一b i s - ( 3 - a m i n o p r o p y l ) p i p e r a z i n e ，f l u o r o p h o r e w a sd a n y l ，4 - a m i n o n a p h t h a l i m i d e a n d c y - 7d y er e s p e c t i v e l y t h i ss p a c e r i sal i t t l em o r e r i g i d t h a n n - b i s 一( 3 - a m i n o p r o p y l ) a m i n e t h e t mw a s 2 6 3 0 0 ct ot a tt r i p l e x b u to n l ya b o u t2 0 ct oa t d u p l e x c o m p a r e dw i t h ，n - b i s 一( 3 a m i n o p r o p y l ) a m i n es p a c e r ，m n 一b i s 一( 3 一a m i n o p r o p y l ) p i p e r a z i n es p a c e r h a d b i g g e r f l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n t af l u o r e s c e n c e m e l t i n gm e t h o dw a sb r o u g h tf o r w a r dt o m e a s u r et h et mo ft h ec o m p l e xo f2 aa n d t a tt r i p l e x t h i sm e t h o dw a sad e p e n d a b l em e t h o dp r o v e db yu v m e l t i n gm e t h o d w ef u r t h e rp r o v e dt h i sm e t h o db ym e a s u r i n gt h et mo ft h ec o m p l e xo f2 aa n da t d u p l e xt h r o u g h as m a r t c y c l e ra p p a r a t u s a ne x p l a n a t i o n f o r t h ed i f f e r e n t f l u o r e s c e n c er e s p o n s et ot a tt r i p l e xb e t w e e nl aa n d2 aw a sp r e s e n t e db yu s i n go f s e m i e m p i r i c a lc a l c u l a t i o nm e t h o d a m t an o v e lt r i p l e xd n af l u o r e s c e n tp r o b e ，w h i c ht a k e s4 - a m i n o n a p h t h a l i m i d eo r d a n y la sr e p o r t i n gg r o u p ，e t h y l e n eg r o u p a sas p a c e ra n da t r i p l e x - s e l e c ti n t e r c a l a t o r i i i 萘基瞳啭嵌入型t a t 三链d n a 荧光探针研突 a sr e c o g n i z i n gg r o u p ，w a ss y n t h e s i z e db a s e do np h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ( p e t ) f l u o r e s c e n c er e s p o n s eo fp r o b e st od i f f e r e n td n aw a ss t u d i e dt h r o u g hf l u o r e s c e n t s p e c t r a ，w ef o u n dt h a tp r o b e3 aw a sv e r ys e n s i t i v et ot a tt r i p l e x ，t h ef l u o r e s c e n c e r e s p o n s eo f 3 at op ha l s op r o v e dt h ep e tm e c h a n i s m s o m et r i p l e xd n ab i s - i n t e r c a l a t o r l i g a n d s ( n 1 n 8 ) a n d am o n o i n t e r c a l a t o r l i g a n d ( n 0 ) w e r e a l s os y n t h e s i z e d t h e v a l u e sw e r es t u d i e dt h r o u g ht h eu v m e l t i n ge x p e r i m e n t s t h ee x p e r i m e n t sc o n c e r n i n g t h ee f f e c t so fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fn 6t ot a tt r i p l e xa n da td u p l e xs u g g e s t e dt h a ta p p r o p r i a t e l y d e s i g n e d b i s - i n t e r c a t a t o r l i g a n d s w e r eb e t t e rt h a nm o n o i n t e r c a t a t o r t i g a n d s i n s e l e c t i v e l ye n h a n c i n g t h es t a b i l i t yo ft a tt r i p l e x k e y w o r d s ：t r i p l e xd n a ，n a p h t h y i q u i n o l i n e ，t 。a tf l u o r e s c e n c ep r o b e ，s t a b i l i t y o ft r i p l e xd n a ，b i s i n t e r e a l a t o r 独创性说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：日期： 大连理工大学博士学位论文 1 1 概述 第一章绪论 以三链d n a 为背景的反基因战略为治疗某些疾病提出了“新型药物”豹概念。 在理论上任何由基因或基因组表达所引起的疾病都有可能作为三链d n a 技术的 应用对象1 。随着人类基因组项目研究的开展，对人和病毒基因组的基因序列和功 能信息的获得已经取得爆炸性进展，不断涌现出各种新的药物标靶。三链d n a 作 为药物的潜在应用包括治疗病毒感染、癌症和免疫疾病等。当前的研究已经拓展 到更广泛的领域，如选择性调控基因的表达2 4 、基因的定点突变5 、基因的修复6 、 原位染色体的标记和基因的分子诊断等7 。 荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其作为分 子探针在生命科学8 。”、超分子光化学”。7 等方面的研究在全世界倍受瞩目，是目 前热门的研究课题之一。在分子识别的过程中，如何将识别的信息通过有目的设 计的分子器件以可以捕捉的信号反馈给观察者是设计分子器件的关键。荧光信号 以其高灵敏度、高分辨率在分子器件的研究中具有重要的地位。因此，人们试图 通过荧光信号把有机小分子和生物相关分子有机地联系在一起，以解决生物中的 问题。2 0 。通过对分子水平上微观过程的探测与研究，人们就有了从宏观世界通 向微观世界的渠道，使人们对微观世界的认知变为可能，对人类认识整个世界有 极其重要的意义。经过特殊设计的生物荧光分子探针具有高灵敏度、高选择性、 安全方便等特点，并且可以实现实时单分子检测。 d n a 荧光探针领域包含很多方面，如d n a 分子的识别机制、d n a 的荧光标示技 术、探针的分子设计原理和荧光团的选取等。由于目前对于三链d n a 荧光探针的 报道很少，而目前广泛应用的双链d n a 荧光探针的设计原理对于本文设计的三链 d n a 荧光探针具有指导和借鉴意义，因此就本论文研究的重点，本章将主要在三 链d n a 的小分子识别、当前广泛应用的双链d n a 荧光探针发光原理和d n a 探针的荧 光发色团等方面进行综述。 1 2 分子识别与d n a 的识别 1 21 分子识别 分子识别可理解为底物与给定受体选择性地键合，并可能具有专一性功能的 过程。识别过程可能引起体系的电学、光学性质及构象的变化，也可能引起化学 荣基睦嘛嵌入型下。a t 三链d n a 荧光探针研究 性质的变化。这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理。因此，分子识别在信 息处理及传递，分子及超分子器件制备过程中起着重要作用1 4 。 互补性( c o m p l e m e n t a r i t y ) 及预组织( p r e o r g a n i z a t i o n ) 是决定分子识别过程的两 个关键原则。前者决定识别过程的选择性，后者决定识别过程的键合能力2 0 。互 补性包括满足氢键的形成，静电相互作用( 如盐桥的形成) 、n 堆积相互作用，疏 水相互作用等。这要求受体及底物的键合位点及电荷分布能很好地匹配。预组织 原则是指受体与底物分子在识别之前将受体中容纳底物的环境组织得越好，其溶 剂化能力越低，则它们的识别效果越佳，形成的络合物越稳定。 受体的设计在分子识别中具有关键性的作用。受体的设计须遵循的一些基本 原则是： l 、为了达到高的识别效果，受体与底物应有大的接触面积，受体应具有包 容底物的空腔以产生较多的非共价相互作用，井能与底物很好地互补。 2 、受体设计必须遵循刚性与柔性的平衡，它关系到受体及受体同底物识别 过程的动力学特性。受体结构的稳定性需要刚性的分子结构，但是识别过程中的 变换、调控、协同及变构过程需要一定的柔性。特别是对于生物体系，受体的柔 性是非常重要的，因此受体设计应兼顾受体的动态及静态性质。 3 、氢键的形成在分子识别过程中起非常重要的作用，许多的分子结构是通 过氢键形成的。 4 、7 1 堆积相互作用是提供识别平面杂环底物( 如核苷酸) 的有利途径。根据n 堆积相互作用而设计的受体对生命科学研究有一定的意义与价值2 1 2 2 。 1 2 2 核酸分子的识别及d n a 嵌入剂 对d n a 序列识别的机制有三神：一种是d n a 杂交严格遵守的w a t s o n c r i c k 碱 基配对原则，即c 与o 、a 与t 形成碱基对；一种是通过h o o g s t e e n 氢键形成三链体 寡聚核苷酸，即双螺旋d n a 的a t 碱基对可与t 形成t a t 三碱基体，g c 碱基对可与 质子化的碱基c ( c + ) 形成c g c 三碱基体；另一种则是在d n a 测序等研究的基础 上，实现人工合成的分子与d n a 特定碱基序列的识别和结合，它是化学、分子生 物学及生物医学等领域关注的焦点之一。 一些人工合成的小分子由于对核酸的识别能力而成为潜在的新药设计研究 对象，这些人工合成的小分子对d n a 的分子识别主要有三平电方式，即静电结合 ( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) 、沟区结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌入结合( i n t e r c a l a t i v e b i n d i n 9 1 。普遍认为三种方式中静电结合没有选择性( 如图1 1 所示) 。 大连理工大学博士学位论文 霞。 扩髫州c 吲 g t o o , , o t t ：n d i r i i k f a a t ；? c g i n d i n l f i g 1 1t h r e ei n t e r a c t i o nm o d e s o fs m a l ll i g a n d sw i t hd n a 图1 1 小分子对d n a 识别的五种作1 j ；j 方式 这些人工合成的小分子种类非常多，相关的综述也非常多2 n 2 8 ，在此不作主 要介绍。主要种类包括有： l 、会属络合物，如金属嵌入剂( m e t a l l o i n t e r c a l a t o r ) 、会属锌大环四氨络合物、 二价铜、铁离子的络合物等；2 、基于吲哚的化合物，如氮丙啶基吲哚烯亚胺 ( a z i r i d i n y l e n e i m i n e ) 和环戊吲哚甲基化合物( c y c l o p e n t 【b 】i n d o l e m e t h i d e ) ；3 、天然 小分子及其衍生物，如偏端霉素( d i s t a m y c i n ) i 类似物；4 、苯并咪唑类分子，如被 广泛用来作dna 荧光标记的h o e c h s t3 3 2 5 8 ；5 、二苯脒类分子；6 、寡糖的衍生 物；7 、多羟基氮杂环庚烷类化合物；8 、寡聚酰胺；9 、氧杂葸组合物质等。 嵌入结合模式最早是由l e r m a n 在1 9 6 1 年研究吖啶与小牛胸腺d n a 的相互作 用时提出的。它是指分子的平面稠环部分插入两个d n a 堆积的碱基对中间。第一 次直接的证据是在研究吖啶与b d n a 的嵌入时，通过x 射线衍射和水合作用研究 得到的2 9 ，3 0 。今天，这种结合模式不仅被n m r 等光谱分析所证实，而且有三十多 个小分子与寡聚核苷酸嵌入复合物的晶体被x 射线衍射及理论计算所确定川。 从分子力学角度看，嵌入结合主要来源于四种力：兀堆积作用力、水合力、 范德华力和静电作用力。一般来讲，嵌入结合会带来d n a 结构的变化，嵌入前后 d n a 的一级和二级结构保持不变。三级结构( 双螺旋) 被加长，嵌入两对碱基对 之间的距离会从3 4 a 增加到7 - 8 a ，从而改变d n a 的拓扑结构。 小分子嵌入到d n a 的特性变化很明显，主要表现为： 1 在嵌入过程中，嵌入剂分子与d n a 碱基对发生作用，或是破坏原有氢键， 使极性嵌入剂分子的两极分别与碱基对结合；或是不破坏原有氢键，极性的嵌入 剂分子直接与碱基对作用。破坏氢键要吸热，药物分子与碱基对结合要放热。利 用测定热力学参数的变化，可分析嵌入剂分子结构对d n a 亲和力的影响。 2 嵌入剂和d n a 双螺旋内碱基对之间的电性相反。嵌入；f l j d n a 的小分子与 碱基对形成有序的堆积，化合物表面紧挨着d n a 碱基对的芳香杂环，在双螺旋链 萘基噻啉嵌入型t a t 三链d n a 荧光探针研究 中以兀一兀共轭，偶极与偶极相互作用，从而使电荷分布上达到稳定。这些变化可以 通过一些光谱现象。如紫外减色效应、荧光淬灭、1 h n m r 光谱的化学位移向高 场移动等光谱现象来说明。 般来说，对于典型的双链d n a 嵌入过程，小分子的平面部分必须至少具有 2 8 a 的表面积，即最佳是3 4 个环。三链d n a 是一条含多聚嘧啶或多聚嘌呤的寡核 苷酸( t r i p l e x f o r m i n go l i g o n u c l e o t i d e ，t f o ) 在靶基因双链d n a 局部形成h o o g s t e e n 或反h o o g s t e e n 键，在靶基因的大沟区缠绕而形成的。因此对于设计三链d n a 的 嵌入剂来说，含有更大的平面结构是非常有利于三链d n a 的碱基堆积的。具有弯 月形的稠环类b e p i 系列就是很好的例子，类似的稠环系列已扩展到五元环。 1 3 三链d n a 及三链d n a 的识别 1 3 1 三链d n a 研究背景及反基因战略 1 9 5 7 年，d a v i e s ，r i c h 和f e l s e n f e l d 在研究p o l y r a 和p o l y r u 】的相互作用时， 发现它们能形成一种三螺旋r n a p o l y ( r a ) 2 p o l y ( r u ) 结构，并首次基于实验结 果提出了三螺旋核酸的概念3 2 。但由于后来未获得足够的证据证实三链核酸能在 体内存在且具有实际的生物学意义，而沉寂了近2 0 年。直到1 9 8 7 年，m i r k i n 等进 一步证实了在一种组织的酸性溶液中三螺旋d n a ( 称为h d n a ) 的形成，这为三链 d n a 能在体内形成提供了较强有力的证据”。从此，对三链d n a 的成为研究的热 点之一。 三链d n a 是一条含多聚嘧啶或多聚嘿呤的寡核苷酸( t r i p l e x f o r m i n g o l i g o n u c l e o t i d e ，t f o ) 在靶基因双链d n a 局部形成h o o g s t e e n 或反h o o g s t e e n 氢键， 在靶基因的大沟区缠绕而形成的。依第三条链与靶基因含多聚嘌呤链的取向不 同，三链d n a 可分为平行与反平行三链。平行三链主要有t a t ，c + g c ( 如图1 2 所示) ，反平行三链主要有t a t 、a a t 、g g c 。( 如图1 3 所示) c + g c t a t f i g 1 2s t r u c t u r e so f t w op a r a l l e lt r i p l e xd n a 圈1 2 两种平行三链d n a 的结构图 “吖 一带 x 潞飞。 大连理工大学博士学位论文 g g ca a t t a t f i g 1 3s t r u c t u r e so f t h r e ea n t i p a r a l l e lt r i p l e xd n a 图1 3 三种反平行三链d n a 的结构图 由于在双螺旋到三螺旋的转换中同时 半随着d n a 结构的改变，并且这种改变 可能会影响d n a 蛋白质问的相互作用，形成三链结构的寡核营酸与靶基因的结 合将可能阻断r n a 聚合酶或转录因子与d n a 的作用，从而抑制基因的转录3 4 。3 6 。 这一设想被称为反基因策略，以区别于在翻译水平抑制基因表达的反义策略”4 。 对于三链d n a 的兴趣主要在以下两个领域： ( 1 ) 虽然对于多聚嘌呤序列形成的分子内三螺旋d n a ( h d n a ) 的生物学 作用的了解并不是很精确，但是它具有控制基因转录的作用。因此合成出具有特 定性识别h d n a 的小分子，就可以把它应用于药物分子控制基因的转录，从而起 到对某些疾病的治疗作用”4 4 。 ( 2 ) 在反基因治疗的策略中，t f o 可被选择性地作用于某些靶基因，从而形 成分子内的三链。这些三链d n a 的形成能够影响基因的生物学功能，而能够特异 性识别这些三链d n a 的小分子和它作用，可以作为“增强子”来稳定t f o 一双链 d n a 的复合物，加强它们的生物学功能。由此，t f o 发展出一种治疗某些疾病的 “新型药物”概念纷4 8 。 1 3 2 三链d n a 的稳定性 三螺旋d n a 的稳定性与双螺旋d n a 相比要差了很多，并且对于c + - g c ，则需 要p h 低于6 o 的环境才能稳定存在4 9 ，5 0 。特别是在生理条件下，三螺旋d n a 比双螺 萘基睦啉嵌入型t a t 三链d n a 荧光探针研究 旋d n a 的稳定性相差大约2 4 个数量级5 3 。这样势必会影响反基因战略中t f o 作 为潜在药物的效果，为此，人们对于如何提高三螺旋d n a 的稳定性展开了更加深 入地研究。 影响三螺旋d n a 稳定性的因素有很多，主要有：三碱基体的性质、碱基堆积、 p h 效应、水合效应、离子强度和专一性阳离子作用、h d n a 链的极性、d n a 改 性及错配效应等。 为了改善在生理条件下三螺旋d n a 的稳定性，人们尝试对能形成三螺旋的寡 聚核酸进行了各种各样的改性，这些方法主要包括： 1 核糖基修饰； 2 磷酸骨架的改性； 3 碱基改性： 4 三链d n a 嵌入剂。 1 33 三链d n a 的分子识别 采用人工合成的小分子配体特异性地识别三链d n a ，与三链d n a 结合后可显 著提高它的稳定性。其原理是基于静电作用、沟区间结合、嵌入作用的一种或几 种作用模式。近年来，基于对三链d n a 这些高度有序的碱基体系结构信息( 如溶 液n m r 、x 晶体射线、分子模型) 和相关分子模型的不断认识，已设计出许多对 于三链d n a 具有稳定作用，而对于双链d n a 分子具有很小或不起作用的新型配 体。但它们对于三链的稳定作用并不是越大越好，过大则会造成t f o 对于双链的 选择性降低。 1 33 1 三链d n a 嵌入剂 经典的双链d n a 嵌入剂对于三链d n a 的稳定作用并不明显，甚至还会降低三 链d n a 的稳定性。例如溴乙锭对于含有t - a t 型的三链具有定的稳定作用，而对 于c + - g c 则会降低其稳定性5 4 。能特异性地稳定三链d n a 的嵌入剂主要有以下几 种。 芳香稠环类系列( 如图1 4 所示) ：b e n z o 【e 】p y r i d o i n d o l e ( b e p i ) 4 8 是第一个报 道对三链d n a 有选择性的嵌入剂。这一类型的化合物对于t a t 的选择性大于 c + g c ，可能是因为分子内所带的正电荷对质子化胞嘧啶有排斥作用。它对于三 链d n a 的选择性，是由于它所具有的大芳香环平面对于周围三链碱基的堆积作 用，而这个大的芳香环平面对于双链d n a 的碱基来说则太大，不能形成良好的堆 积。分子模型研究表明，b e p i 的侧链位于大沟区内的双链d n a 多聚嘧啶链与第三 大连理工大学博士学位论文 条链之间，b e p i 可使三链d n a 的值增加2 0 以上。h e l e n e 等5 5 的研究表明， b e n z o g p y r i d o i n d 0 1 e ( b g p i ) 具有同样好的三链稳定性，与b e p i 不同的是，虽然 b g p i 的侧链对整个分子具有非常重要的作用，但是它对于三链d n a 的稳定是不 利的，可能是因为它位于双链d n a 多聚嘌呤链和第三条链之间的位景有关。b e p i 具有弯月形的结构，而b g p i 更趋近于直线型，这意味着b g p i 具有较少的碱基堆积 作用，这些损失可能是通过更为重要的静电作用补偿的。更加深入的研究证明， b e n z o f p r i d o q u i n o x l i n e 也是一个好的三链嵌入剂5 6 。这种类似的稠环系列已扩展 到五元环，例如b e n z o 【妇q u i n o q u i n o x a l i n e ( b q q ) ”，d i b e n z o b , j p h e n a n t h r o l i n e ”。 b q q 被认为是目前这个系列最有效的三链d n a 嵌入剂，它的单取代衍生物比双取 代衍生物的作用更有效。d i b e n z o b , j p h e n a n t h r o l i n e 是喹吖啶的衍生物，它不仅具 有很好的三链d n a 的稳定作用，而且具有荧光及光诱导切断质粒d n a 的作用。利 用这些特点，t e u l a d e f i c h o u ，m p 等5 9 将它用于进行直接光诱导切断三链 h i v d n a 。 + ( c 2 h 5 ) 2 d i b e n z o b , j p h e n a n t h r o l i n eb q q f i g 1 4s t r u c t u r e so fe x a m p l e sw i t hf u s e dr i n g s 豳1 4 一些稠环类嵌入剂的结构 h 3 葸醌( a n t h r a q u i n o n e ) 类衍生物：另一个广泛应用的嵌入剂是双取代蒽醌类 衍生物。由于其毒性较小，曾用于替代抗肿瘤药如d a u n o m y c i n ，m i t o x a n t r o n e 及 a d r i a m y c i n 等。大量的生物物理、光谱与分子模拟等研究表明，蒽醌侧链取代基 的位罱对于三链d n a 的稳定作用有显著不同的影响。例如：线状分子 ( t h r e a d i n g t y p e ) 2 ，6 一二取代蒽醌衍生物( 如图1 5 所示) 可特异性地促使三链d n a 保持稳定；而矛状分子( s p e a r t y p e ) 1 ，4 - 二取代蒽醌衍生物只能稳定双链d n a ， 萘基瞳啉嵌入型t - a t 三链d n a 荧光探针研究 对三链d n a 反而会破坏它的稳定性”。这可能是由于嵌入剂的荧光团与三链d n a 碱基n 电子堆积及沟区间对两个取代基的结合方式不同造成的。1 ，4 一异构体破坏 三链的稳定是出于两个侧链基团在d n a 双链的大沟区竞争空间，这样势必会影响 第三条链的空间位置，净的作用结果是熵的增加；而2 ，6 异构体的侧链比较灵活， 在能量上没有受到损失。这种能量上的分析被认为是提供了种为将来设计新型 药物非常关键的信息。 实验证明，蒽醌的衍生物除了a q l 4 ( 指葸醌的t ，4 - 取代衍生物) 外，其余大 部分单取代或双取代葸醌都是平行t a t 嵌入型稳定剂，大致的顺序是a q 2 7 a q l5 a q l8 a q 2 6 a q l a q 2 ，对于双链和三链d n a 的增加分别为o 2 3 和0 , 4 2 4 ”。同样，根据不同形式的取代基在结构和性能上与三链d n a 的嵌 入作用影响不同，从分子模型上可定性得出如前所述相同顺序的结论。但是能量 最小化的结构似乎表明，碱基与发色团的堆积并不是主要的因素，沟区间的可容 纳能力、碱基干扰、溶剂化的影响可能更加重要”。 c h 3 h n v n c h 3 m 认段 d i s u b s t i t u t e da m i d o a n t h r a q u i n o n e n a p h t h y 】q u i n o 【i n e f i g 1 5s t r u c t u r e so f d i s u b s t l t u t e da n t h r a q u i n o n ea n dn 8 p h t h y l q u i n o l i n ed e r i v a t i v e 浏1 5 双取代蒽醌类及茶基喹啉类衍生物嵌入剂的结构 萘基喹啉( n a p h t h y l q u i n o l i n e ) 衍生物：在寻找潜在有效的抗h i v 药物的过程 中，发现4 ，氨基喹啉衍生物是一种抗h i v 很有潜力的化合物“，后来实验证明其2 位被b 萘取代后成为一个有选择性的三链d n a 嵌入型稳定剂( 如图1 s 所示) ，可 以使三链d n a 的值增加3 5 6 2 。这种非稠环类嵌入剂对t - a t 序列的稳定作用要 大于c + o c 的序列，对平行三链的稳定作用大于对反平行圈三链的稳定作用”，并 且对于人类细胞相对来说没有毒性”。 这类化合物具有这样一些特点：( 1 ) 侧链含有正电荷以补偿三链d n a 上很 高的负电荷密度：( 2 ) 大的芳香环平面可以优化与之相邻三个碱基的堆积作用； ( 3 ) 三碱基的相互堆积形成两个扭转的接触点，萘基喹啉所具有的非稠环特性 可使它有一定的扭转自由度与之相协调。 c h a i r e s 等6 4 合成了一系列的萘基喹啉衍生物，深入地讨论了化合物的结构和 大连理工大学博士学位论文 三链d n a 作用性能的关系，并利用q s a r 定量计算了这类偶联荆的结构与三链 d n a 亲和性的关系。认为萘基喹啉的侧链取代基也具有非常重要的作用：是萘 基喹啉的侧链与三链d n a 的一个或多个沟区间的结合对于提高它和三链d n a 的 选择性和亲和力具有重要的作用；二是侧链应是具有灵活柔顺的长链，以便于它 可以方便的进入三链d n a 的沟区间。 1 3 32 沟区间结合型三链d n a 偶联剂 一些沟区间偶联剂作为三链d n a 的稳定剂，如b e r e n i l 、d i s t a m y c i n 、n e t r o p s i n 、 d a p i 等与嵌入型三链d n a 嵌入剂相比，它们的作用要逊色一些。一般来说，这 类偶联剂受赫浓度的影响很大，在其作用下，沟区间进行调整，进而导致三链d n a 与偶联荆相互作用并造成排斥。t f o 存在于双链的大沟区，形成了另外两个新的 沟区( m m ，m m ) ，原来的小沟( m ) 未受影响。新的沟区m m 没有显著的特点， 而m m 则与m 很相似。m m 平面上具有两个氮键中心而在沟区间具有憎水的性质， 根据这个特性发展了一类薪型的沟区间结合的三链偶联剂，并且合成出一系列对 位或间位1 ，3 二芳基三氮烷的衍生物( 如图1 6 所示) ，可以偶联在三链的m m 沟区。 它具有这样的特点：( 1 ) 三氮烷与芳环的内表面形成了个凹处，有利于偶联 剂穿过三链的m m 沟区；( 2 ) 反式的连接具有柔性；( 3 ) 氢键的受体部分位于 沟区的平面上：( 4 ) 在表面每个臂上，亲油性的钩状结构可以固定与之相邻的 分子到磷酸酯上或邻近的沟区口处，这种性质使它对三链d n a 具有很好的稳定作 用。经测定解链温度及等温滴定量热法等研究证明，对于双链及三链d n a 的丁。 值的改变分别为2 和2 0 2 5 ”。 f i g 1 6s t r u c t u r e so f1 ，3 - d i a r y l t r i a z e n e 圈1 61 , 3 二芳基三氦烷衍生物的结构 1 3 33 嵌入剂与寡核苷酸( t f o ) 相连 r = h r ；m e 第一种是将t f o 的3 端或5 端与双链d n a 嵌入剂共价相连，从而使三链d n a 保持稳定。嵌入剂能定点嵌入三链双链链节处，这种稳定作用比较强，但是没有 选择性。吖啶( a c r d i n e ) 母体( 通常为2 甲氧基吖啶，6 一氯吖啶，9 一氨基吖啶) 是一个应用较多的嵌入剂，实验证明嵌入作用发生在5 端是比较有利的，对三 链的稳定作用大于在3 端6 6 。因为它可以在三链双链的连接处识别5 一嘧啶嘌 呤一3 序列，这正是许多多环芳香族分子强的嵌入位点”。通常多环芳香化合物 9 萘基建啉嵌入型t a t 兰链d n a 荧光探针研究 由于具有大的刚性平面可以与d n a 的碱基形成比较好的堆积作用，也比较常用， 如1 ，4 ，5 ，8 双萘酰亚胺“，芘”等。其它连接在t f o 上的嵌入型偶联剂有p s o r a l e n e 、 o r t h o 口h e n a n t h r o l i n e 、a n t h r a q u i n o n e 衍生物2 吏e l l i p t i c i n e 等。将具有三链选择性的嵌 入剂接在5 端或t f o 的内部来稳定三链d n a ，其稳定的效果比5 端接吖啶或单 独使用三链d n a 嵌入剂明显。值得一提的是，每个共价连接在t f o s 上的嵌入剂只 能使一个三链d n a 保持稳定，而自由状态下的几个嵌入剂分子可以同时与一个三 链d n a 发生作用”。对于苯并吡啶并吲哚稠环衍生物系列来况，将 b e n z o h q u i n o q u i n o x a l i n e 接在t f o 的5 端，对于三链d n a 的稳定作用最好；而在 t f o 的内部，b e p i 的稳定作用最好”。h e l e n e 小组将b e p i s d b g p l 的衍生物通过不 同的链和寡核苷酸连接，并将它置于链中的不同位置上，结果表明当柔性链与 b e p i 连接在寡核昔酸的5 端时，较短的链可使三链d n a 的值的提高3 0 c “。同 样，将n a p h t h y l q u i o n l i n e 连接在5 端比在相同浓度下单独作用对三链d n a 的稳定 作用要明显许多“。 第二种是将小沟区偶联剂与t f