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摘要 细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 摘要 由木醋杆菌a c e t o b a c t e rx y l i n u m 发酵产生的细菌纤维素具有比植物纤维更为优越的 特性。由于其具有独特的三维网络结构、高纯度、高结晶度、高杨氏模量、易于生物降 解性等特点，使其广泛应用于各个领域。本文主要进行了细菌纤维素膜应用于固定化微 生物细胞及音响膜方面的初步研究。 以细菌纤维素膜为载体，采用静态共培养和动态摇瓶培养两种方式分别对黄孢原毛 平革菌和白腐真菌z _ 4 进行固定化，进行了静态共培养固定化方式中接种方式、接种时 间和动态培养固定化方式中载体大小、数目等条件对固定化效果的影响试验，得到了固 定化效果较好的固定化黄孢原毛平革菌和白腐真菌z 4 ，进行了固定化菌和游离菌对孔 雀石绿染料的降解试验。发现固定化菌与游离菌球相比不仅提高了脱色效率，而且在培 养液初始p h 值和染料初始浓度变化的情况下，仍能保持稳定的脱色率。脱色前后的紫 外可见吸收光谱分析表明，可见光区吸收峰消失，染料结构发生变化。表明细菌纤维素 膜是一种优良的固定化载体。 自组装了一套测试细菌纤维素膜片动态杨氏模量和损耗因子的试验装置，进行了静 态、动态培养产生的细菌纤维素膜的动态杨氏模量、损耗因子等音响膜基本参数的测定 与计算。由静态培养产生烘干得到的膜杨氏模量最大值为2 7 9 8 4 6g p a ，声音传播速度 为4 7 1 4 8m s ，损耗因子为0 0 5 5 2 ；比动态法和经静态培养热压处理得到的膜的杨氏模 量均高出一倍以上，反映了培养及后处理方式对膜性质有较强影响。表明细菌纤维素膜 作为音响膜的优越性在于其同时具有的高杨氏模量和较大的损耗因子。 关键词：细菌纤维素，固定化，降解，音响膜，杨氏模量，损耗因子 a b s t r a c t细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 a b s t r a c t b a c t e r i a lc e l l u l o s eo b t a i n e df r o mf e r m e n t a t i o nb yt h ea c e t o b a c t e rx y l i n u mi so fs u p e r i o r p r o p e r t i e si nc o m p a r i s o n 、 ，i t l lp l a n tc e l l u l o s e b a c t e r i a lc e l l u l o s eh a sb e e nu s e df o rav a r i e t y o fa p p l i c a t i o n sd u et oi t sp a r t i c u l a rn e t w o r ks t r u c t u r e ，h i l g hp u r i t y , h i g hc r y s t a u i n i t y , h i 曲 y o u n g sm o d u l u sa n db i o d e g r a d a b i l i t y t h ep r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o ni ni m m o b i l i z a t i o no f m i c r o o r g a n i s ma n da c o u s t i cd i a p h r a g m sw e r ei n v e s t i g a t e d a p p l i c a t i o no fb a c t e r i a lc e l l u l o s em e m b r a n ei ni m m o b i l i z a t i o nc a r r i e ro f p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u ma n dw h i t er o t 舡n 香z - 4w e r ei n v e s t i g a t e db ya d o p t i n gt h em e t h o d so f s t a t i c c u l t u r ea n ds h a k ef l a s kc u l t u r er e s p e c t i v e l y t h ei n o c u l a t i o nm e t h o d ，i n o c u l a t i o nt i m ef o rt h e s t a t i cc u l t u r ea n dt h ec a r r i e rs i z ea n da m o u n tf o rt h es h a k ef l a s kc u l t u r ew e r es t u d i e d r e s p e c t i v e l y t h ep r e f e r a b l ei m m o b i l i z a t i o ne f f e c tf o rt h ep h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u ma n d w h i t er o t 曩m 酉z - 4w e r eo b t a i n e d 。a n dt h ee x p e r i m e n t so fd e g r a d i n gm a l a c h i t eg r e e nw i t h i m m o b i l ep h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u ma n dw h i t er o t 觚昏z - 4w e r ei n v e s t i g a t e d c o m p a r i n g 谢廿lf r e ec e l l s ，i m m o b i l i z a t i o nn o to n l yi n c r e a s e dt h ea b i l i t yt od e c o l o r i z ed y eb u t a l s ok e p tt h es t a b l er a t eo fd e c o l o r i z a t i o ni nt h ec o n d i t i o no fd i f f e r e n tc u l u t u r em e d i u mp h v a l u e sa n dd y ec o n c e n t r a t i o n s t h ed i f f e r e n c e so fs p e c t r aa s s a ys h o w e dt h a tt h ea b s o r p t i o ni n v i s i b l er a n g ed i s a p p e a r e d a n dt h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h es t r u c t u r e so fd y e sh a dc h a n g e d t h eb a c t e r i a lc e l l u l o s es h o w e di t sf a v o r a b l ep r o p e r t i e si ni m m o b i l i z a t i o nc a r r i e r an e wa p p a r a t u sf o rm e a s u r i n gt h ed y n a m i cy o u n g sm o d u l u sa n di n t e r n a ll o s si s d e s i g n e d t h ed y n a m i cy o u n g sm o d u l u sa n di n t e r n a ll o s so fs t a t i cc u l t u r ea n ds h a k ef l a s k c u l t u r em e m b r a n e sh a sb e e nm e a s u r e d t h eh i g h e s ty o u n g sm o d u l u s2 7 9 8 4 6g p aw a s o b t a i n e du s i n gt h es t a t i cc u l u t u r em e t h o da n dd r i e dw i mo v e n t h es o n i cv e l o c i t ya n dt h e i n t e r n a ll o s sw e r e4 7 1 4 8m s 1a n d0 0 5 5 2i n t h i sm e t h o d h o w e v e r , t h ed y n a m i cy o u n g s m o d u l u sd e c r e a s e da b o u t5 0 w h e nt h em e m b r a n e so b t a i n e df r o ms h a k ef l a s kc u l t u r ea n d h o t - p r e s sm e t h o d b yv i r t u eo fi t sh i 。g hd y n a m i cy o u n g sm o d u l u sa n dh i g hi n t e r n a ll o s s ，t h e b a c t e r i a lc e l l u l o s es h e e ti se x p e c t e dt ob eu s e f u lf o ra c o u s t i cd i a p h r a g m s k e yw o r d s ：b a c t e r i a lc e l l u l o s e ，i m m o b i l i z a t i o n ，d e g r a d a t i o n , a c o u s t i cd i a p h r a g m s ， y o u n g sm o d u l u s ，i n t e r n a ll o s s 声明尸明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本学 位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或公布 ， 过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文中作了明 确的说明。 研究生签名： 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上 网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并授权 其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对于保密论文， 按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：朱鲞遗 加口易年多月彳日 l 硕士论文细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 1 引言 纤维素是地球上最为丰富的一类生物大分子，它不但是植物体最主要的组成部分， 而且也是微生物胞外大分子物质的代表。它不仅是纺织工业和造纸工业的主要原料，而 且还可用来制造新型高性能功能材料和高分子复合材料，在许多技术领域中发挥着重要 作用。 1 1 细菌纤维素的产生 目前，工业用纤维素主要通过树木、棉花等植物光合作用合成，称之为植物纤维素 ( p l a n tc e l l u l o s e ，缩写为p c ) 。不过，人们也发现某些微生物也可高效地合成纤维素。 第一篇报道由醋酸菌产生的以及很多年来在许多国家被称之为v m e g a rp l a n t 的这种特殊 物质的科学论文早在1 2 2 年前就已经由英国科学家a j b r o w n 发表【l 】。人们为了区别于 植物来源的纤维素，称微生物合成的纤维素为微生物纤维素( m i c r o b i a lc e l l u l o s e ) 或细 菌纤维素( b a c t e r i a lc e l l u l o s e ，缩写为b c ) 2 1 。 1 1 1 细菌纤维素产生茵及其产纤维素特点 b c 是由醋杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 、根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 、土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 以及八叠球菌属( s a r c i n a ) 等一些属的细菌合成的，b c 产生菌情况如表1 1 1 1 所示【3 1 。 表1 1 1 1b c 产生菌及其产纤维素的结构 属名产生纤维素的结构 醋杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 无色杆菌属( a e h r o m o b a c t e r ) 气杆菌属( a e r o b a c t e r ) 土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 产碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 假单胞茵属( p s e u d o m o n a s ) 根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 八叠球菌属( s a r c i n a ) 动胶菌属( z o o g l o e a ) 由带状物构成的胞外薄膜 细纤维 细纤维 短的小纤维 细纤维 无明显的小纤维 短的小纤维 无定形纤维素 未知 其中醋杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 中的木醋杆菌( a c e t o b a c e rx y l i n u m ) 合成纤维素的能 力最强，最具有大规模的生产能力。它是一种革兰氏阴性菌，常用作纤维素基础性以及 应用性研究适于的模式菌株【4 】。近几年，又将木醋杆菌与其它一些种( gh a n s e n i i ，g e u r o p a e u s ，go b o e d i e n s 及gi n t e r m e d i u s ) 重新划分到新属葡萄糖酸杆菌属 1 引言硕士论文 ( g l u c o n a c e t o b a c t e r ) 中，并定名为gx y l i n u s 5 , 6 】。 1 1 2 细菌纤维素的发酵生产 影响b c 发酵生产的主要因素除了菌株本身的性质外，还包括发酵培养时所用的碳 源、氮源、p h 值、温度及培养方式等。在碳源、氮源对b c 的产量影响方面，国内外 已进行大量的试验研究，值得注意的一点是国外的研究学者用数学方法及计算机分析方 法设计出来的合适的培养基组分，能够使b c 产量大大提高( 达2 5g l ) 1 7 , 8 】。最适p h 值对b c 产量的影响随菌株的不同而有所差异，一般在4 0 7 0 之间变化；而最适温度的 变化范围一般在2 8 * ( 2 3 0 ( 2 之间【9 ，l o l 。 b c 的合成可以分别在静置和动态培养条件下进行，具体选择哪一种培养条件，主 要依赖于此高聚物的用途和目的。静态培养时b c 的产量主要依赖于面积体积比，目前， 文献报道的面积体积比值变化范围2 2c m 1 到0 7c m 1 不等【l l 】。由于静态培养时形成了 一层菌膜，因此对其p h 值等参数的连续控制就比较困难；而使用专门的发酵罐进行动 态培养，则可以对b c 的合成进行较好的控制。静态培养时的产量较高，但周期长、占 地面积较大；动态培养时因供氧充足利于菌体生长，发酵周期短，生产效率高，但产量 较低【1 2 】。结合静态、动态发酵的特点，s a k a i r 等设计了静置连续培养的方法来生产 b c ，可收集到超过5m 的纤维素，显示了其巨大的生产潜力。 1 2 细菌纤维素的结构与性质 1 2 1 不同培养方式产细菌纤维素的形态与结构 不同的培养方式产生的b c 在结构、性质方面有明显差异。在产生的b c 的形态方 面，静态培养得到的纤维素经纯化等处理后为白色半透明凝胶状膜，而动态发酵培养得 到的纤维素以颗粒状、放射状和纤维状条带的形式分散在培养基中1 7 ，经提取纯化处理 后为白色产物，烘干后成片状。 j o h s o n 等1 1 4 】在扫描电镜下观察发现，动态和静态培养得到的纤维三维结构有明显差 异，静态的纤维更加伸展一些，并且以相互交错的方式堆积在一起，而动态培养得到的 纤维丝带相互卷曲缠绕在一起，同植物来源的纤维素相比，b c 的直径仅为植物纤维的 1 1 0 0 左右。 通过对两种培养方式培养得到的b c 进行f t - i r 、x r d 、t g 及d t a 等分析后【1 5 】， 发现两种方式培养得到的b c 的化学结构相同、晶型均为纤维素i 型，但静置培养得到 的b c 具有比动态培养得到的b c 更高的i 口含量、更高的结晶指数和更大的晶粒尺寸。 1 2 2 细菌纤维素的基本特性 正是由b c 的结构决定了它是一种高度不溶于水、具有弹性及伸缩性的高聚物。其 2 硕士论文细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 基本特性总结如下1 2 , 1 2 , 1 6 ： ( 1 ) 高纯度，可达9 9 以上，分子取向好，以单一纤维存在； ( 2 ) 高结晶度，静态培养的b c 可达7 1 ，动态培养的b c 可达6 3 ： ( 3 ) 高拉伸强度、高杨氏模量，一般为植物纤维的数倍至十倍以上； ( 4 ) 高吸收特性及结合水能力，经干燥成纸状片层后仍具有一定的吸水、持水能 力； ( 5 ) 高弹性、高回弹性、高韧性及高形状维持能力； ( 6 ) 生物合成时的可调控性，在b c 的培养过程中或结束后对其进行修饰，如将 木素磺化盐加入到培养基中时，提高了b c 产量，同时发现生产的b c 条更加粗糙，相 互间的缠结更少，而且宽度和厚度都增加了。 ( 7 )良好的生物相容性及生物降解性，为环境友好型产品。 1 3 细菌纤维素的应用概述 1 3 1 细菌纤维素的应用领域 b c 属于一种公认安全( t h eg e n e r a l l yr e c o g n i z e da ss a f e ，缩写为g r a s ) 的多糖，因 此被广泛应用于各个领域。表1 3 1 1 总结了b c 主要的潜在应用f 切，从中可以看出b c 的应用领域广阔。 表1 3 1 1 细菌纤维素的应用 领域应用 化妆品 纺织业 旅游及运动 采矿及废料处理 污水纯化 广播 林业 造纸工业 机械工业 食品工业 医药 实验室研究 作为乳化剂如乳膏、指甲护理、上光剂的稳定剂；人造指甲的成分 人造皮肤及织物；高吸收性物质 运动装、帐篷及野营装备 用于收集外溢石油的海绵制品、吸收毒素的材料、矿物及石油的再循环 城市污水纯化及水超滤 麦克风及耳机的灵敏振动膜 人工木材的替代品、多层胶合板以及重物箱 特种纸、档案文件的修复、耐用的银行支票、尿布及餐巾纸 汽车车体、飞机部件、修复火箭裂缝 食用纤维及 n a t ad ec o c o ” 用于治疗褥疮、烧伤及溃疡的暂时性人造皮肤 蛋白质固定、色谱技术、体外组织培养的培养基成分 目前，已经或正在开发的b c 的应用主要包括食品、造纸和无纺织物、生物医学材 料、渗透汽化膜分离、声学器材振膜、燃料电池质子交换膜、电子纸张、固定化酶以及 3 1 引言硕士论文 b c 改性的研究等。 1 3 1 1 在食品工业中的应用 b c 不易为人体消化吸收，食后可增加饱食感，可作为低热量的减肥食品以及具有 预防便秘和结肠癌、排毒美容、降低胆固醇等功能的保健品。在日本和菲律宾，b c 作 为食品的一个成功的商业应用是“n a t ad ec o c o ”。此外，由于b c 的高保水性、粘稠性和 稳定性，在食品工业中可作为增稠剂、分散剂、胶体填充剂、抗溶化剂，同时利用发酵 产物醋酸、醇脂和乳酸等混合物的特殊风味合成人造肉、人造鱼、人造禽类等【1 8 1 。 1 3 1 2 在造纸工业中的应用 b c 添加到纸浆中，利用纤维素大分子上的羟基产生氢键结合，使纸张达到很好的 湿强度、干强度、耐用性、吸水性等，并且解决了废纸回收再利用时纸纤维强度下降的 问题。b c 可用于流通货币制造的特级纸，字典和词汇手册的印刷纸，可减轻重量，提 高印刷性能；而制造吸收有毒气体的碳纤维纸板，通过添加适量的b c ，可提高碳纤维 板的吸附容量，减少纸中填料的泄漏【1 6 】。 1 3 1 3 在生物医学材料中的应用 用b c 制成人工皮肤、纱布、绷带、缓释药物的载体和“创口贴”等伤口敷料商品， 在潮湿情况下机械强度高，多空、有弹性及良好的通透性，与皮肤相容性好，能防止细 菌感染，易于吸收渗出物，促使创面的愈合和康复等。如由x y l o s 公司生产的b c 产品 p r i m ac e l l m 已经在临床试验中用作治疗溃疡的创伤敷料，效果令人满意。8 周之后，5 4 的病人恢复健康，剩余的溃疡患者也基本痊愈【3 】。其它的b c 应用于皮肤移植物的商品 如b i o f i l 和b i o p r o c e s s 广泛用作外科和齿科材料。 日本n a k a y a m a 1 9 】用b c 制备了具有高机械强度的双面网水凝胶，在重复施压后仍 然有可逆溶胀能力，非常适合制造关节软骨和其他组织的替代物。亲水性高聚物b c 和 白明胶组成了双面网结构，压缩断裂应力和弹性模量比白明胶凝胶体高几个数量级，几 乎等同于真正的关节软骨。同时摩擦因数很低，只有0 0 0 1 。 天津大学材料科学与工程学院用仿生途径以b c 作基质，制备了新型的羟基磷灰石 ( h a ) b c 生物复合材料，作为天然骨头的替代品。相比胶原质、丝素蛋白和壳聚糖 等高聚物，b c 具有更高的机械强度、更多的微孔、优异的生物可降解性、良好的原位 形状可铸性以及较高的与骨头结合能力 2 0 , 2 1 1 。 1 3 1 4 在渗透汽化膜方面的应用 由于b c 膜具有很强的亲水性、机械性能及热稳定性良好等特性，因此可以将其应 用于含水的有机溶液的渗透汽化分离。 在渗透汽化方面的应用最早是由印度学者d u b e y 等1 2 2 】进行的乙醇水二元体系的渗 透汽化分离研究，发现b c 膜对水有高选择性；之后p a n d e y 等【2 3 】将分离体系扩展到丙 酮水、甲醛水、乙二醇水、丙三醇水等二元有机溶液。 4 硕士论文细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 在对细菌纤维素膜的改性研究方面，2 0 0 4 年，d u b e y 等【2 4 j 进行了用脱乙酰壳多糖浸 渍得到的复合纤维素膜与脱乙酰壳多糖聚乙烯醇混合膜进行乙醇水共沸物的渗透汽化 分离，结果表明脱乙酰壳多糖细菌纤维素膜对乙醇水有较好的分离效果，并且与脱乙 酰壳多糖聚乙烯醇混合膜相比具有更好的机械性能和热稳定性。此外，r a m a n a 等【2 5 】 进行了用海藻酸盐或者海藻酸盐聚乙烯吡咯烷酮涂覆、戊二醛交联后得到的复合细菌 纤维素膜的渗透汽化实验研究，并用复合后得到的膜对丙酮水、异丙醇水以及乙醇 水体系进行了渗透汽化实验，结果表明在细菌纤维素膜复合后其表面结构发生了明显改 变，并且对丙酮、异丙醇、乙醇与水的分离效果有明显差异。 1 3 1 5 在燃料电池方面的应用 由于b c 膜具有的纳米纤维三维网状结构可以沉积金属离子，并且具有低气体透过 性、机械强度高、热稳定性好等特点，使其可以应用于质子交换膜燃料电池。2 0 0 6 年发 表的美国专利【2 6 】，报道了通过金属沉积将b c 金属化并用于燃料电池和其它电子电器设 备的制造。b c 是一种可再生的天然纤维素资源，由这种原料制备的燃料电池生产价格 低，容易回收再利用。 1 3 1 6 在电子纸张方面的应用 b c 应用于电子纸张的研究目前处于起步阶段，相关的报道研究较少。2 0 0 5 年，s h a h 等【2 7 】将b c 应用于高清晰度动态显示器件的试验研究取得了实质性的进展，已可以清楚 地显示出特定的字母，并具有断电源后的记忆功能。用b c 制备的电子纸张具有高反射 率、高对比度、高柔韧性、低成本和可生物降解性，因此，b c 可作为新型的可便携式 携带的如电子书籍、可写地图等的电子载体。 1 3 1 7 在复合材料方面的应用 韩国的y o o n 等【2 8 j 利用b c 的超细三维网状多孔结构，结合碳纳米管制成导电b c ， 克服了传统碳纳米管易团聚，很难在聚合物材料中分散均匀的缺点。并利用b c 的超细 网状多孔结构，将其看作纳米级的过滤器，把液体中的碳纳米管均匀吸附并牢牢结合到 其表面和内部后，电导率达0 1 4 妣m ，这对研究导电材料具有重要意义。 此外，通过b c 与某些特定的化学物质进行生物、物理和化学作用制备得到的b c 复合材料的性能更为优良，如提高b c 膜的杨氏模量等，在后续章节中将有介绍。 1 3 2 细菌纤维素膜应用于固定化技术研究进展 1 3 2 1 固定化技术基本概念 固定化技术是指利用化学或物理手段将游离的细胞( 微生物) 或酶，定位于限定的 空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术【2 9 j 。其包括固定化酶技术与固定 化细胞技术两种。2 0 世纪中期已有应用固定化技术，人们通过有目的地将酶包裹于聚合 基质或连接于载体分子而限制酶的移动；也可采用酶的交联，通过蛋白质交联或无活性 1 引言 硕士论文 材料的加入，从而产生了无数不同材料的固定方法【3 0 1 。固定化细胞技术是在固定化酶的 技术上发展起来的，由于该技术既不需要把酶从细胞中提取出来，细胞可以为酶提供良 好的反应环境，可提供能量，有多种辅因子与酶成分参与，代谢途径完整，也不需要加 以纯化，酶活力损失比较小。该技术可大幅提高参加反应的微生物浓度，催化效率高； 减少所用微生物数量：耐环境冲击；产物分离提取容易，操作稳定性好因而备受关注 口l 】 0 1 3 2 2 固定化酶的方法及特点 目前已报道的酶固定化方法超过百种以上，归纳起来大致可以分为三种方法：表面 担载法、交联法和包埋法【3 引。 表面担载法是通过物理或化学过程，将酶担载到非水溶性载体上的方法【3 3 】。它在固 定化酶的制备中是使用最早的方法，但使用时必须按酶的种类和性质，选择合适的载体 和固载方法。因为所选用的载体种类和固载方法对酶的担载量和反应性能影响很大。载 体的化学组成、表面形貌、颗粒度、孔径和孔结构、表面积、亲水性基团等是主要考虑 因素。一般而言，载体的亲水性基团越多，表面积越大，担载的酶量就越高，所制得的 固定化酶活性也就越高。根据结合形式不同，担载法又可分为共价结合法，离子结合 法及物理吸附法。 交联法是采用双功能团试剂或多功能团试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双 功能团试剂或多功能团试剂之间形成共价键，得到三维的交联网状结构。除了酶分子之 间发生交联外，还存在一定的分子内交联，根据使用条件和添加材料的不同，可制备不 同物理性质的固定化酶。此法的优点是酶之间连接牢固，具有良好的稳定性及重复使用 性，缺点是有时难以很好地控制反应条件，反应剧烈时，常常引起酶蛋白的高级结构发 生变化，并导致活性中心受到破坏，从而难于保证每次都能制得高活力的样品。 包理法是将酶包裹于凝胶形成的网络结构中，或半透膜聚合物的超滤膜内使其固定 化。包埋法可分为网络型和微囊型两种，前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网络内；而 后者是将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸 残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶 的固定化。但是包埋法制备的固定化酶，只适合用于小分子底物和产物的酶催化反应， 因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子凝胶的网格进行扩散。此外，由这 种固定化方法产生的扩散阻力，还会使固定化酶的动力学行为发生改变，从而降低酶活 力。 1 3 2 3 固定化细胞方法及特点 细胞的固定化方法很多，王建龙【3 4 】把目前经常采用的细胞固定化方法分为4 类：载 体结合法、交联法和系统截留法、载体分隔法。现常用的是载体分隔法中的包埋法、载 体结合法中的吸附法和交联法。 6 硕士论文细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 吸附法包括物理吸附和离子吸附两类。物理吸附是使用具有高度吸附能力的硅胶、 活性炭等吸附剂将微生物吸附到表面使之固定化；离子吸附则是根据微生物在解离状态 下因静电引力的作用而固着于带有相异电荷的离子交换剂上。吸附法将细胞固定在非水 溶性载体上，细胞活性损失小、载体可以反复使用，但所能固定的细胞数量有限，与载 体结合牢固程度低。废水处理中的生物膜法是其代表性例子。 包埋法是使细胞扩散进入多孔性载体内部或将细胞包裹在凝胶网格结构或半透性 聚合薄膜内，小分子底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围的介质中去的 一种方法。根据载体材料不同，可以分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是将 细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物 制成的小球内。包埋法操作简单，对细胞活性影响小，固定化细胞球强度高，但包埋材 料会一定程度地阻碍底物和氧扩散，对大分子底物不适用。目前工业应用上以凝胶包埋 法固定细胞最为广泛。 交联法是利用具有两个以上功能团的试剂直接与微生物细胞表面的反应基团如氨 基、羟基等进行交联，形成共价键来固定微生物【3 5 1 。该方法结合菌体牢固度高、生物浓 度高，但化学反应剧烈，对细胞活性影响大，常与其它方法结合使用。 1 3 2 4 固定化酶载体的材料及特性 应用于固定化酶的载体主要包括天然高分子载体、合成高分子类载体、磁性高分子 微球类载体和无机载体等 3 0 3 。 其中天然高分子载体的典型代表是壳聚糖及其复合物。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳 素的脱乙酰化产物，是一种氨基多糖。由于其具有良好的机械性能、稳定的化学性质， 同时又易于接枝而改性，再加上其来源丰富、成本低廉、制备简单、因此广泛应用于固 定化酶载体材料的开发及研究。 合成高分子类载体材料主要有聚碳酸乙烯撑脂( p v c a ) 、甲基丙烯酸类及其他共聚 物高分子类等。合成高分子类载体固定化酶的性能方面比天然高分子载体更加优越，且 使用寿命较长，同条件下保存时间更长，固定化酶活性较高，可多次使用。 磁性高分子微球是内部含有磁性金属或金属氧化物( 如铁、钴、镍及其氧化物) 的 超细粉末而有磁响应性的高分子微球，其制备方法有包埋法、共沉淀法、单体聚合及化 学转化法。如利用喷雾干燥法制得粒径分布在1 0g m 1 5 “m 之间，磁含量约为1 5 的 聚苯烯腈的磁性聚丙烯腈微球，作为固定化酶的载体，实验结果显示固定化酶的量与磁 性微球的量成正比1 37 。 无机载体材料主要类型有无机硅藻土、多孔玻璃等。如可以通过烷基胺与对甲基苯 甲酸反应直接生成芳胺的衍生物，然后用重氮化法固定木蛋白酶，酶量为2 4 0 m g g 载 体。其特点是比有机载体更耐微生物降解、具有更高的热稳定性和更低的价格，操作稳 定性及产率也比较理想。 7 l 引言硕士论文 1 3 2 5 固定化细胞载体的材料及特性 适用于固定化技术的常用载体材料包括有机载体、高分子载体和无机载体等【3 8 】，其 中高分子材料因其诸多良好的性能往往成为人们首选的载体材料。高分子载体一般可分 为天然高分子材料和人工合成高分子材料两大类。天然高分子材料主要包括卡拉胶、明 胶、琼脂、甲壳素、壳聚糖、海藻酸钙、醋酸纤维素和血纤维蛋白等；人工合成高分子 材料主要包括聚丙烯酰胺( p 枷) 、聚乙烯醇( p v a ) 、聚氨酯、光敏树脂、聚乙烯氧化 物等高聚物。 在选择高分子载体材料时应考虑下列关键因素：载体材料的稳定性( 包括对温度、 p h 值、微生物试剂和化学试剂的稳定性) 及生物相容性；制备固定化细胞的方法及 成型的难易；较好的机械强度并能长时间重复使用；毒性( 包括对人和对细胞的存 活性) 的影响；培养基的来源和成本【3 4 】。 1 3 2 6 细菌纤维素应用于固定化技术的研究进展 b c 具有的较高的机械强度、热稳定性、良好的生物相容性以及无毒性使得其可广 泛应用于固定化酶及固定化细胞技术。而目前国内外有关b c 固定化方面的研究较少， 且主要集中于固定化酶的研究。如丁振等【3 9 】以细菌纤维素为载体，先将b c 膜进行胺化， 之后采用吸附交联的方法将海藻糖合酶固定化。在最适固定化条件下，1 5 吸附2 0h ， 然后与6 戊二醛在1 5 交联2 0h 。与游离酶相比，b c 膜固定化酶能提高酶的酸碱稳 定性、热稳定性，有较好的操作稳定性和重复使用稳定性。s e n g c h iw h 等【4 0 】通过将葡 糖淀粉酶用戊二醛交联的方法固定化至不同大小的b c 小球上发现，固定化后的葡糖淀 粉酶对反应的p h 值和温度的变化适应性比未经固定化的葡糖淀粉酶的适应能力更强， 特别是在较低温度区域( 低于2 0 ) 差别则更加明显。且在b c 小球上固定化后，葡糖 淀粉酶的相对活性在p h 值2 0 时可达7 7 ，为文献报道的最高值。由此，可以看出b c 小球在固定化酶方面的工业应用的潜能。 目前，b c 应用于固定化微生物细胞方面的研究尚未见报道，但根据b c 的基本特 性，如稳定性好、机械强度高、具有三维网状多孔结构、具有良好的生物相容性、对微 生物无毒性等，以及b c 应用于固定化酶方面的效果分析来看，将其应用于固定化微生 物细胞是可行的，但需要进行大量的、深入的试验研究及探索，并与其它固定化微生物 细胞载体的各性能进行对比分析，总结其固定化微生物细胞的特点，探索其使用条件、 适合固定化微生物细胞的种类等。 1 3 3 细菌纤维素膜应用于扬声器振膜的研究进展 1 3 3 1 扬声器振膜的特性及基本要求 振膜是扬声器发声的主要部件，它决定扬声器的有效频率范围、失真和音质。而振 膜的性能又取决于振膜的几何形状、振膜的材料和振膜的加工工艺。经过大量实验证明， 8 硕士论文细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 扬声器频响曲线等客观指标主要由振膜的几何形状决定，而扬声器的音质、听感等主观 指标主要由振膜的材料决定【4 1 1 。 对振膜的要求主要包括以下三个方面：从稳态振动方面考虑；从瞬态振动方面考虑； 从可靠性角度考虑1 4 2 j 。 从稳态振动方面考虑。对振膜的基本要求在物理特性方面有如下三点： 一、为使扬声器重放频带尽可能宽，要求比弹性率酬p 尽量大。其中e 代表振膜材 料的弹性模量，指材料应力增量与应变增量之比，亦称杨氏模量或弹性系数；p 代表振 膜材料的密度。扬声器的频带宽度，与扬声器的高频上限、低频下限和扬声器振膜几何 尺寸关系最大，增加弹性模量和减小密度都会提高频率上限。对一般材料而言，弹性模 量高的材料如各种金属，其密度也较高，所以要求z p 比值也较高。 二、要求扬声器失真小，因此要求振膜的弯曲刚性大。即要求振膜挺，不产生或减 少振膜的分割振动。对于一个振膜来说，在频率比较低时，可以近似地将振膜看成一个 活塞( 刚体) 的振动，随着频率的升高，从振膜中部到边缘的振动传播时间就不能忽略 不计。此时，振膜本身也产生共振，它就不能认为是一个刚体，而要分割成若干部分， 每部分以不同振幅振动，即为分割振动。因此，刚性好的物体，就不易产生分割振动【4 3 】。 三、要求振膜有适当的内阻尼。内阻尼，亦称内摩擦，它的产生因为振膜在受到不 断涨落的应力后，机械能转化为热能。 ， 适当大的内阻尼可使频率响应曲线比较平滑，改善音质 4 4 , 4 5 1 。阻尼大小可以用损耗 因数t a n 8 表示，它是指应力与应变之间相位角的正切值，表明了声波在材料内部传播 时所受到的阻碍大小。因此阻尼太大，声音传播损失就太大；而阻尼太小( 如小于1 0 。3 ) ， 则各种有害的谐波会使音质变坏。金属类材料内阻尼比较小；钢锰合金、镁合金的阻尼 较高；普通材料如锯末、于沙和软木阻尼较大；而纸浆材料内阻尼也较大。 从瞬态振动方面考虑，将一个脉冲信号加到扬声器，在起始阶段，扬声器的振动会 有一个上升时间；而在终止阶段，扬声器的振动不会同步停止，而要滞后一段时间。这 种性能分别称之为“前沿瞬态特性”和“后沿瞬态特性”。这两种瞬态特性与振膜材料有密 切关系。金属类振膜前沿瞬态特性好，而后沿瞬态特性差；相反，纸浆类振膜后沿瞬态 特性好，而前沿瞬态特性差。 从可靠性角度考虑，需要振膜具有如下性能：防潮性能、湿强度性能、防霉性能及 外观、色泽较好、经久耐用等。 1 3 3 2 扬声器振膜材料的研究进展 目前，已用于扬声器振膜的材料种类很多，大致可以分为纸系振膜材料和非纸系振 膜材料j 。其中，纸系振膜材料可分为硝酸盐浆、亚硫酸浆、植物纤维、动物纤维、人 造纤维和强化纤维等；非纸系振膜材料可分为高分子系振膜材料、液晶聚合物振膜、高 弹性纤维振膜、金属系振膜材料、陶瓷系振膜、b 4 c ( 碳化硼) 振膜、金刚石振膜和生 9 1 引言 硕士论文 物纤维素类振膜等。每种振膜都有其各自的特点，如金属系振膜具有高的杨氏模量，但 是内阻尼小、密度大，限制了其广泛应用；而大部分的纸系振膜虽然具有较高的内阻尼， 但是杨氏模量相对较低。金刚石等振膜作为振膜材料虽然较为理想，但是目前其大批量 生产工艺仍有待改进t 删。而生物纤维素作为一种新型的振膜材料，目前已经得到了日本 s o n y 等公司青睐。日本s o n y 等公司研发中心的研究人员i 侧通过利用一种产纤维素的细 菌静态发酵产生的膜，经过后处理，得到一种性能优良的声音振动膜。其杨氏模量e 最 高可接近3 0g p a ，而密度p 仅为1 3g c m 3 左右，损耗因子t a n g ；高达0 0 4 ，声波在连续 介质中的传播速度c 接近5 0 0 0m s e c 1o 而普通的锥形纸盆的e 和c 值则分别只有1 5g p a 和1 6 0 0m 8 e c ；金属材料类振膜如铝、钛等杨氏模量虽高，但是损耗因子t a n 8 只有 0 0 0 1 。 正是由于各振膜都有其优势和不足，才使得复合振膜的研制得到了许多研究者的重 视。如张保军等 4 7 1 利用化学气相沉积方法得到了一种金属类金刚石复合高频振膜，该 振膜整体刚性高，没有应力变形，明显提高了扬声器的灵敏度和高频响应性能；林润惠 等【4 8 】的研究则表明复合型纸盆的性能优于用单一纸浆制作的纸盆。 而细菌纤维素膜作为一种新型的生物纤维素类振膜虽然其性能相比于普通的纸盆 和金属类振膜比较优越，但是在其杨氏模量方面还有进一步提高的空间，在处理工艺等 方面仍需深入探讨。如j o h n s yg e o r g e 等1 4 9 探讨了用不同碱液处理细菌纤维素膜后，其 物理机械性能的差异；k e s h k 5 0 】研究了发酵液中木质素磺酸盐的添加对产生的细菌纤维 素膜的结构及物理性能的影响，结果表明木质素磺酸盐的添加导致膜的丝带变宽，提供 了更好的单面取向，产生了更高的拉伸强度和杨氏模量；n a k a g a i t o 等【5 l j 通过研究发现 经过不同浓度酚醛树脂浸泡过的细菌纤维素膜比未经浸泡的膜具有更高的拉伸强度和 杨氏模量，经过浸泡酚醛树脂的膜的杨氏模量最高可达2 8g p a ，而未经浸泡处理的膜杨 氏模量最高仅为1 9 g p a 。在细菌纤维素膜的发酵方式对杨氏模量的影响方面，也有学者 对其进行了研究，如k u n i h i k ow a t a n a b e 等【5 2 】通过研究发现静态发酵产生的细菌纤维素 膜的杨氏模量是3 3 3g p a ，而动态发酵产生的膜的杨氏模量是2 8 3g p a ，表明了不同的 发酵方式对细菌纤维素膜的杨氏模量是有一定影响的。 1 3 3 3 扬声器振膜参数测试方法研究进展 可以看出，在分析扬声器振膜的性质及进行振膜的设计时，必须测量振膜材料的多 项物理指标，主要有杨氏模量、损耗因数( 内阻尼) 、密度、厚度、泊松比等。特别是 杨氏模量和损耗因数同其音响特性有着很密切的关系，它们对扬声器的谐波是否失真及 程度、频响曲线的平坦程度、音色的纯真及清晰度等都有影响【5 3 1 。而动态杨氏模量较之 静态杨氏模量能更好地反映扬声器工作时振膜材料的内在特性，因此，建立准确、简便、 快速的扬声器振膜材料动态杨氏模量的测试方法，对于指导扬声器的设计研究工作以及 在生产中选择新材料、鉴定新工艺或制定各振动部件的材料标准，都有及其重要的意义 1 0 硕士论文 细菌纤维素膜应用于固定化微生物细胞及音响膜的初步研究 【5 4 1 。目前，主要的动态杨氏模量测试方法有德国c b o r d o n c - s a c e r d o t e s s 的动磁式复弹性 模量测试法、根据m o r s e l 5 6 】的振动与声中提到的棒振动模式而由关爱光1 5 ”提出的快 速傅立叶变换( f f t ) 测试弹性模量和损耗因数的方法、光电法p m 以及南京大学沙家正 等教授【5 4 1 在1 9 9 8 年4 月提出的一种基于悬臂梁的自由振动的动态弹性模量测试方法。 上述的每一种测量方法在测量振膜的杨氏模量时，都会存在一定的测量误差【4 2 j ，其 原因是多方面的，如每一种测量方法本身有一定的测量误差、各种测量方法之间存在误 差、振膜的各部分之间的杨氏模量可能是不同的等等。 1 4 课题的主要研究内容及意义 主要研究内容包括以b c 膜为载体进行固定化微生物细胞的条件、方式的初步探索 及将固定化的细胞与游离菌球应用于染料废水处理的对比试验，并将b c 膜与其它固定 化载体进行了相关特性的比较与分析；以不同方式得到的b c 膜在音响振动膜方面的相 关特性及其应用于音响膜的性能、特性测试及分析。 在固定化微生物细胞的试验中，主要选取了白腐真菌z 4 和黄孢原毛平革菌进行固 定化细胞试验，研究了微生物细胞在b c 膜上的固定化方式、条件对其固定化效果的影 响，对固定化后的菌处理染料废水进行了相关试验，并与其它材料的固定化载体的固定 化性能及其它相关特性进行了对比分析。 在研究b c