（物理电子学专业论文）混浊介质的多光子激发荧光显微成像研究.pdf

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 o n m u lt i- p h o t o n e x c it e d f lu o r e s c e n c e m ic r o s c o p ic i m a g i n g t h r o u g h t u r b i d m e d i u m abs tract m u l t i - p h o t o n e x c it e d fl u o re s c e n c e s c a n n i n g m ic ro s c o p y ( m p e , 1 , 2 , 3 - p ) h o l d s t h e p r o p e rt i e s o f s u p e r - re s o l u t io n a t la t e r a l d i r e c t i o n a n d s t r o n g o p t i c a l s e c t i o n i n g a b i l i ty a t a x i a l d ire c t io n . i t h a s b e e n a n im p o rt a n t t o o l i n l i f e s c i e n c e t o s t u d y b i o l o g i c a l m i c r o s t r u c t u re in v i v o . i n s p e c i a l , 2 - p a n d 3 - p , c o m p a r e d w it h i - p , g i v e d e e p e r i m a g i n g d e p t h a n d l o w e r p h o t o- t o x i c i t y a n d p h o t o- b l e a c h i n g , b e c a u s e l o n g e r w a v e - l e n g t h i l lu m i n a t i o n l i g h t i s u s e d t o e x c i t e fl u o r e s c e n c e . t h e r e f o r e , th e y s h o w m o re p ro m i s i n g in b i o l o g i c a l a p p l i c a t i o n a n d h a v e b e e n t h e h o t s p o t i n m ic r o s c o p y r e s e a r c h r e c e n t l y . s i n c e b i o l o g i c a l t i s s u e s a m p l e i s t u r b i d t o i l l u m i n a t i o n l i g h t a n d fl u o re s c e n c e o f mp e , s c a tt e r in g a n d a b s o r p t io n d e g r a d e m p e m ic r o s c o p ic i m a g in g s e r i o u s l y . a s a r e s u lt i n i m a g i n g d e e p la y e r u n d e r t h e s u r f a c e o f t h e b i o l o g i c a l s a m p l e , t h e p r a c t ic a l r e s o l u t i o n o f mp e i s m u c h l o w e r t h a n d i f f r a c t i v e l i m it t h a t i s p r o p o s e d b y c o n f o c a l m i c r o s c o p y . t o a c h i e v e h i g h e r r e s o l u t i o n , a v a r i e ty o f t e c h n iq u e s h a s b e e n d e v e l o p e d a n d re p o rt e d i n r e f e r e n c e s , w h il e f e w s t u d i e s f o c u s e d o n t h e m e c h a n is m f o r f o r m in g a n i m a g e . c o n s id e r in g t h a t , t h e mp e m i c r o s c o p i c i m a g i n g t h r o u g h t u r b i d m e d i u m w a s s e l e c t e d a s t h e t o p i c o f t h i s t h e s i s b e s i d e s , it i s l a c k in g v a l i d m e t h o d s f o r a n a ly z i n g t h e i n t e g r a t e d e ff e c t o n m p e i m a g i n g o f t is s u e o p t i c a l p ro p e rt i e s a n d o p t ic a l d e v i c e s p a r a m e t e r s . u s u a l ly , s c a la r d i ffia c t i v e t h e o ry is u s e d t o s t u d y m i c ro s c o p i c a l o p t i c s . d i f f u s e t h e o ry i s u s e d t o s t u d y t h e l ig h t t r a n s p o r ta t io n i n t u r b i d t is s u e . e a c h o f t h e m i s i n e ff i c i e n t t o s o l v e t h e a b o v e p r o b l e m . t h e r e f o r e , d e v e l o p i n g t h e r ig h t s t u d y m e t h o d i s a n o t h e r t o p i c o f t h i s t h e s i s . a t f u s t , w e d e v e l o p e d t h r e e m e t h o d s t o c o n s i d e r t h e s e t o p ic s : s o lv i n g t h e tr a n s p o rt e q u a t i o n w i t h d e l t a - e d d i n g t o n p h a s e f u n c t i o n a p p r o x i m a t i o n , mo n t e c a r l o m e t h o d c o m b i n e d w i t h g e o m e tr ic a l r a y t r a c i n g a n d m o d e l e x p e r i m e n t s . b a s e d o n t h e s e , e ff e c t s o n mp e i m a g i n g o f t is s u e o p t i c a l p ro p e rt i e s a n d d e v ic e s p a r a m e t e r s i n m ic r o s c o p i c a l o p t i c s w e re s t u d i e d . s o m e s ig n i f i c a n t c o n c l u s i o n s w e re ma d e . t h e m a in c o n t e n t s a n d c o n c l u s io n s 血 l i s t e d a s f o l l o w i n g : ( 1 ) t h e o r e t i c a l m o d e l i s p r o v i d e d f o r t h e re s e a r c h o f l ig h t t r a n s p o r ta t i o n i n t u r b i d s a m p l e w it h s m a l l s o u r c e - d e t e c t o r s e p a r a t i o n , w h i c h i s b a s e d o n t h e a n a l y t i c a l s o l u t i o n o f t r a n s p o rt e q u a t i o n u s i n g d e l ta - e d d i n g t o n p h a s e f u n c t i o n a p p ro x i m a t i o n . t h e m o d e l w a s a p p l i e d t o a n a ly z e t h e e ff e c t s o f o p t i c a l p r o p e rt i e s o f t u r b i d m e d i u m o n mp e i m a g i n g . t h e r e , w e c o n c l u d e d t h a t re s o l u t io n o f mp e i m a g in g t h r o u g h t u r b i d m e d i u m d e c r e a s e s a s t h e s c a t t e r i n g c o e f f i c i e n t i n c r e a s e s , a n d i n c r e a s e s a s t h e a b s o r p t i o n c o e ff i c ie n t i n c r e a s e s . ( 2 ) a p ro g r a m i s d e v e l o p e d t o s i m u la t e t h e m p e m ic ro s c o p i c i m a g i n g t h ro u g h t u r b i d m e d i u m , w h i c h c o m b i n e s mo n t e c a r l o a n d g e o m e t r i c a l o p t i c s . c o n s i d e r i n g t h a t t h e n o t a b le d r a w b a c k o f mo n t e c a r l o i s i t s p o o r e f fi c i e n c y , w e d e v e lo p e d t w o t e c h n i q u e s t o e n h a n c e it : a . r a p id m o d e l i n g m e t h o d b a s e d o n p o i nt s p re a d f u n c t i o n , a n d p a r a l l e l mo n t e c a r lo a l g o r it h m b a s e d o n p a r a l l e l v i r t u a l ma c h i n e ( 四阅. t h e i r h i g h e ff ic i e n c i e s w e r e p ro v e d b y c a l c u l a t io n s . ( 3 ) e ff e c t s o f s c a tt e r in g c o e ff i c i e n t , a b s o r p t i o n c o e f fi c i e n t , a n is o t r o p y p a r a m e t e r , re f r a c t i v e i n d e x o n m p e i m a g i n g a r e a n a ly z e d s y s t e m a t i c a l l y . w e c o n c l u d e d t h a t t h e f u n d a m e n t a l re a s o n o f mp e i m a g e d e g r a d a t i o n b y t u r b id m e d iu m i s s c a tt e r i n g , w h i l e a b s o r p t i o n a c t s a s a g a t e m e c h a n is m t o m p e i m a g i n g r e s o lu t i o n a n d in t e n s i ty , a n d r e fr a c t i v e i n d e x m i s m a t c h i n g b r i n g s d e g r a d a t io n t o im a g i n g . f u rt h e r m o re , w e p o in t e d o u t t h a t t h e d e g r a d a t i o n i n im a g e re s o l u t i o n a n d s i g n a l i n t e n s ity p u t l i m i t a t i o n s o n i m a g in g d e p t h i n l - p a n d 2 - p m ic r o s c o p y re s p e c t i v e ly . ( 4 ) c o n f o c a l p in h o le a n d n u m e r i c a l a p e rt u r e ( n a ) a re d is c u s s e d t h o r o u g h ly . a c c o r d i n g t o t h e a n a ly s e s o f re s o l u t i o n , s e c t i o n in g a b i l i t y a n d s ig n a l i n t e n s i t y , s o m e c o n c l u s io n s s u p p l e t h e g a p t h i s r e s e a r c h i s f u n d e d 切n a ti o n a l n a t u r a l s c i e n c e f o u n d a t i o n o f c h i n a , g r a n t n o . 3 9 8 7 0 2 0 5 a n d 6 0 0 2 5 5 1 4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 汗石卜.1 in addition, two re storation algorithm s to correct the absorption and scattering attenuation of deeplayer im age are discussed: iterative m ethod and w iener de-convolution m ethod. in addition, som epractical experiments proved the above conclusions. m easured images are given. k e y w o r d s : m u lt ran sp o rt e q u atio n ,盎on ex c ited fl uo rescen ce m icro sco p y, t u rb id m e drec o v ery , p a ra lle l v irtu a l m ach in e，一 “ 。 ， c arlo m eth o d , 讥 -一-一 -一 一 一 ， t尸1 下 下 -一 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 谨以此文献给 我的父母 为了 我， 他们忍受着贫穷 和妻子 为了我，她忍受着孤独 感谢他们的爱与支持1 -.式 l.阴jl产|es、肠 一_ 乙厂 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 m ii吕 yr 生命科学的研究需要活体观察微观生命特征。非光学显微成像术如电子显微镜、 场离 子显微镜、扫描隧道显微镜、原子力显微镜等纵然可以提供极高的分辨率，但是均难以观 察活体特征，而且成像大多仅仅限于样品表面的形貌信息。古老的光学显微术则对生命活 体的观察相当方便，然而它的分辨率受衍射极限的制约。 八十年代， 共焦扫描显微成像术的提出 有效地解决了 这一问 题。 它依靠共焦针孔降低 视场获得超衍射限的分辨率，同时它还具有三维成像能力。三维成像能力给了生物显微观 察一个新的天地，这意味着可以 无损地观察样品内部特征。因此，共焦扫描显微术在生物 医学研究中获得了 广泛的应用。特别是和荧光标记技术相结合的共焦荧光显微术 ( 因为荧 光团每吸收一个照明光子后激发一个荧光光子， 因而俗称单光子) ， 因为引入荧光标记作为 特征选择手段.更能有效地获取生命特征信息。由 于受荧光探针紫外波段吸收峰的限制， 单光子显微成像术带来的对样品的光漂白、 光毒性很强， 因而难以长时间地观察活体样品， 而且对样品表面以卜 成像的深度也非常有限。 九十年代初， 第一个实用化的双光子激发成像系统见诸报道。 双光子激发显微术通常 具有和单光子成像相同光学系统。其最重要的区别在于采用较长 波长的光来激发荧光。荧 光每吸收两个照明光子激发出一个荧光光子，激发出的荧光波长接近照明光波长的一半。 这就惫味着，可以采用近红外光激发紫外波段的荧光。这一特点使样品受到的光漂白、 光 毒性大大减少。同时生物样品对长波长光表现为高散射低吸收的特征，这就意味着入射深 度，进而成像深度增加。 此外，双光子激发现象对照明 光子时空特征的要求使激发几率很 低。 通常只有聚焦点处才具有足够高密度的照明 光子， 可以 激发能为探测器探测到的荧光。 这一激发特征使双光子带来固有的空间选择性。因此，它往往无需共焦针孔也可以提供高 分辨率的三维成像。由于这些特点，双光子以 及以 后的三光子成为目 前生命科学研究中 最 先进、也最重要的研究手段。 采用其进行生命科学研究得出的成果也因此分外引入关注。 我们简略地将双、三光子统称多光子。 事实上， 对生物样品进行多光子激发显微成像， 特别是对表面下深层成像时. 成像远 远未能达到衍射限。生命科学研究总不断提出 对更高分辨率、 更深成像深度的要求。因而 近年来显微成像研究也着重于怎样采用新的措施提高多光子激发显微成像术的分辨率与成 像深度，苦如引入偏振、 相干、多物镜等手段。并且多光子作为一种新的显微技术，有很 多 地方还需要研究，对有些问题也存在争论。 考虑到很少有研究侧重于样品 特性对成像的 影响分析，本文对生物样品光学特性参数如散射系数、吸收系数、各向异性因子、折射率 对成像的影响进行了较为完整的研究，同时也探讨了共焦针孔、 数值孔径对成像的影响。 作者采用的研究手段包括求解传输方程、 蒙特卡罗模拟、以 及样品实验的方法。 研究 的结果表明，正是生物样品的散射特性导致了多光子成像能力的下降。而吸收对成像表现 为门机制:提高分辨率的同时降低成像强度。共焦针孔和数值孔径则分别表现为空间门与 角度门。此外作者还就与此相关的一些问 题进行了 研究， 譬如提高蒙特卡罗模拟效率的快 速模型，提高计算效率的并行蒙特卡罗算法，深层图像恢复算法等。此外还得到很多有意 义的结论，铸如共焦双光子具有比共焦单光子更高的分辨率，单光子成像深度的制约主要 来自 于分辨率的丧失， 而双光子成像深度的制约则来自 于信号强度的锐减等等。 这些结果 不但澄清了一些研究上的争论，而且为生物实验中改进多光子激发成像系统、全面发挥多 光子激发显微成像术的优势提供了理论依据和方法。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第一章 绪论 1 . 1光学显微成像的研究动态 1 . 1 二 显微成像术 生命是大自 然的 伟大创 造物。 科学 研究， “ 判天 地之美， 析万 物之理” ， 探索生 命的奥 秘是其不可推卸的责任。人通过感觉、知觉获取外界的信息，从而形成概念，进而思考推 理， 最终获得对整个问 题的解。 感觉信息 8 0 % 以 上来自 视觉， 然而人类的视觉能力极其有 限， 其空间分辨率仅为3 x 1 0 一 米， 时间分辨极限0 . 0 2 秒，可见波长 范围4 0 0 - 7 0 0 纳米。为 了向徽观扩展人类的视觉功能，必须将微观世界成像为可以直接观察的图像。这依赖于显 徽 成 像 术 一 ， 。 显微术以1 6 6 5 年r . h o o c k 用以 发现 “ 细胞”的光学显微镜为开端。 从一开始就和生 命科学以及光学技术紧紧联系在一起。但由于光子不象带有电荷的电子易于控制，光学显 微术发展一度非常缓慢。衍射极限的存在极大地制约了经典光学显微成像的分辨率。而其 他一 些 显 微 技 术 如电 子 显 微 镜 r i 、 场离 子 显 微 镜 i3 1 、 扫 描 隧 道 显 微 镜 k 1 、 原 子 力 显 微 镜 15 1 晶 体衍射间接成像技术 16 1等发展相对迅速. 这些显 微术都具有极高分辨率。 其在生命科学 研究中也因此得到了相应的应用。但是， 他们对生命科学应用而言都存在以下一种或多种 因素的制约:( 1 ) 样品制作使生物体失去活性，也就是说不能活体观察生命特征:( 2 ) 样 品制作困难，如难以选择合适的衬底;( 3 )成像只能获得样品表面的形貌信息。然而随激 光技术、计算机与图像技术的不断完善，八十年代出现了一种具有突破瑞利极限的超分辨 率的光学显 微成像术 共焦扫描显微成像术 17 1 ， 它同时 具有独 特的 三维成像能力。 基于 此，光学显微术重新表现出强劲的生命力。从共焦扫描显微成像术发展而来的与荧光成像 技术结合的共焦扫描荧光显微成像术la i以 及多 光子 激发 荧光扫描显微成像术 19 1则是本课题 研究的主要内容。 作为本课题的研究背景， 本章将较为详细地说明共焦扫描显微成像术以 及多光子激发 荧光扫描显微成像术。 1 . 1 . 2共焦扫描显微成像术 ( c s o m ) 共焦显微术的概念 最早由m .m in s k y 在五十 年代提出. 当 时 他企图 利用这一 技术来消 除普通光学显微镜在探测样品时产生的散射光。在这样一个成像系统中， 采用点光源照明 样品，而拚带样品信息的光为点探测器所收集，最后利用样品的扫描获得整个样品的信息 1 0 . 遗憾的 是该系统的 研究一直 没有能引 起人们的重 视. 直到8 0 年 代激光技术、 计 算机控 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 制与图像处理技术迅猛发展。共焦显微成像术才得以实用。 c s o m 成像原理与经典光学显微系统完全不同。它通过减小显微镜的视场获得横向 ( 垂直于显微镜光轴) 上能突破瑞利极限的超分辨率，同时c s o m具有很强的纵向分辨能 力。横向扫描机制的引入，弥补了视场减小的缺点。纵向 平行于显微镜光轴)扫描机制 的引入。使c s o m具有纵向层析能力。对层析成像三维重构即可以获得样品的三维像。这 样，c s o m具有了两大突出优点即:( . ) 超分辨率，( 2 )二维层析成像能力。 1 . 1 . 2 . 1 c s o m基本原理 图1 - 1 给出了一个反射式共焦扫描成像系统的光学原理图。 物镜与集光透镜共扼放置， 焦点重合， 光源、 探测器 ( p m t 十 针孔) 以及被钡 ( 物点位于共扼位置。 从光源处发出的光准 确地到达位于共焦点处的被测物。当被测物体是全反镜时，该光束被集光镜准确地聚焦到 针孔处，形成点像，从而通过针孔为探测器所探测 ( 图1 一 1 中实线所示) 。其中分束镜用来 区分照明光路与探测光路。如果反射物不在焦点，那么反射光被聚焦在点探测器前面或后 s mv l e p mt 图 i - 1 反射式共焦显 微镜光路图. s : 光谭: p m t : 光电倍 增管; l , : 物镜: l z 集光 透镜; b s : 分束 器; c o n f o c a l p i n h o l e :共焦针孔- 面某个位置 ( 图 卜 1 中虚线所示) ，而在探测面上仅仅形成弥散斑， 此时通过针孔为探测器 探侧到的光能量很少。也就是说离焦信号强度远远低于焦点信号强度。对离焦信号的摈弃 使共焦成像术可以在三维空间坐标上精确地定位被测物体。 c s o m在横向上分辨率可以突破瑞利准则所确定的极限。 表面上看似乎违背了关于 成 像系统分拼率极限的理论。其实不然，这是因为瑞利准则所确定的分辨率是对物体上相邻 一甲- i 月 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 两个点而言。而共焦成像中，只有一个物点参与成像。因此只要照明点或探测点足够小就 完全可能获得突破瑞利极限的超分辨率，其实质是牺牲视场来改善横向分辨率。从傅立叶 光学点 扩散函数的观点来看， 点照明、 点探测扫描的成像系统的点扩散函数州x ) 可以表示 为照明系统的点扩散函数和探测系统点扩散函数的乘积i n 气 h ( x ) 二 h , x ) h a (- x ) c 1 . 1 ) 其中h ) 为 照明系统的点扩散函数， h , ( ) 为探测系 统的 点扩散函 数。 这意味 着要突破衍射 限可以 有照明系统和 探测系统两 个方面的改 进方 法。 对h ， 0 提高获得超分辨率的 方 法有近 场光学方法。而对共焦显微成像术而言，正是共 焦针孔对h , w 的改 进使点 扩散函 数主极 大半宽度减小约2 7 % ( 12 1 ( 见图1 - 2 ) ， 图中v 为归一 化径向 距离。 对纵向分辨率而言，由于共焦针孔对离焦平面信息的摈弃，给c s o m 带来独特的纵向 分辨率。 视场强度 ( 积分光强) 的分析指出了c s o m 与普通光学显微镜的不同之处。 对非吸 收样品而言，采用普通光学显微镜，根据能量守恒定律，在任意垂直于光轴的平面上积分 光强均应该为常数。 这也就意味着普通光学显微镜不具备纵向分辨率。 而对c s o m 而言， 其 积分强度单调递减.半峰宽度约为中心波长 0 . 了倍，积分光强在像面上具有最大值， 如图 1 - 3 所示 ， ， 图 中。 为归 一化轴向离 焦距离， ， 。 为了得到一个样品的三维像， 必须依赖于三维扫描。 在共焦成像中， 扫描方式主要有 光束扫描和样品扫描。采用样品扫描成像光学系统相对简单，但扫描速度慢。光束扫描成 j 一j曰曰儿 1 e 1 ，皿 4 切幼m叮妙u川川u们“ 卜pl.p1，.p.曰.一勺.目叫1巨是 一十一 图 i - 2一个点物体共焦成像的a iry斑比普图1 . 3背景积分u ts 随离af的变化 通显徽镜的要锐利， 横向分 拚率改善了 .共焦扫描显徽成像与普通显橄成像相比具有摒弃 倍。 v 为归一化径向距离.离焦信号的能力， u 为归一化轴向 距离 像速度快， 但系统复杂。因此在实际c s o m 中，通常在横向 ( x - y 向)采用振镜实现光束扫 描，而在轴向 ( z向) 采用样品扫描。 通过三维重构能够将三维扫描获得的点重构成物体 的三维像。 1 . 1 . 2 . 2 c s 0 1 1 的优点 基于以上分析c s o m 和传统光学显微镜相比具有以下优点:( 1 )可以获得超分辨率: 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 ( 2 ) 可以对样品进行三维成像， 获取样品内部三维精细结构;( 3 ) 其具备的层析能力可以 对样品进行厚度小于. h + 的“ 光学切片” 。 从而避免机械切片以 及由 此造成的样品损伤:( 4 ) 共焦针孔可以有效抑制杂散背景光。从而所成图像反差好，灵敏度高， 成像质量好。 c s o m虽然分辨率低于电子扫描显微镜以 及扫描隧道显微镜， 但具有后二者所不具备 的独特优点。同电子扫描显微镜相比:( 1 ) 样品预处理简单，甚至不需要预处理:( 2 ) 避 免使用真空环境， 操作简单:( 3 ) 样品不会象电子显微镜那样吸附电荷产生图像失真;( 4 ) 绝大多数情况 人们对样品感兴趣的是其光学特征而非电学特征;( 5 )非接触式光探测可 以适用于某些无法承受电子辐射损伤的样品。 同扫描隧道显微镜相比:( 1 ) s t m 等扫描探针型显微镜仅仅能获取样品表面 起伏分布 信息。 而无法获取样品深层结构。 c s o m 则可以 对样品表面以下成像. 获得样品真实三维结 构:( 2 ) s t m要求样品具有一定导电 性，当非导体样品表面覆盖导电 层时，导电层的粒度 与均匀性等问 题都将影响成像结果， c s o m采用光束成像，对样品导电 性无要求:( 3 ) s t m 针尖形状的不确定给图像的认证和解释带来困 难，而 c s o m图像接近人眼直接观察结果: ( 4 ) s t m 对生物样品来说。衬底难选抒，导电性差等。而c s o m 则没有这些影响。 从以上关于优、缺点的比较来看，在生命科学研究中，c s o m可以充分适应对活体样 品进行高分辨成像的要求。生命科学研究对活体观察是必须的，光学无损非接触方法正是 克服了电镜、隧道显微镜等方法难以用于生命活体研究的不足，同时克服了 传统显微镜分 辨率较低等问题的一种先进的显微成像术。因此从一开始就广泛应用于生命科学研究。 1 . 1 . 2 . 3 c s o m 在生命科学中的应用 u ( 1 ) 细胞物理和生物化学测定 激光扫描共焦显微镜可进行弱光检测、 活细胞定量分析和重复性极佳的荧光定量分析， 从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、 细胞骨架、结构性蛋白质、d n a , r n a酶和受体分子等细胞特异结构的含量、 组份及其分布进行定性、 定量、 定时及定位测 定:同时还可测定分子扩散、膜电 位、氧化一 还原状态和配体结合等生化反应变化程度。另 外， 徽光扫描共焦显微镜可以对细胞的面积、平均荧光强度、 积分荧光强度、 细胞周长、 形状因子及细胞内颗粒数等参数进行自 动侧量。 ( 2 )荧光的定量、定位分析 激光扫描共焦显微镜可对单标记或双标记的细胞及组织标本的共焦荧光进行定量分 析，并显示荧光沿z轴的强度变化;同时还可自 动将荧光图像与像差图像重叠以显示荧光 在形态结构上的精确定位。此外，借助于光学切片功能可在毫不损失分辨率的条件下铡量 标本深层的荧光分布。激光扫描共焦显微镜也非常适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定， 可以 准确监测抗原表达、 荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀 伤的形态学特性并做定量分析。 ( 3 ) c a l * , p h 及其他细胞内离 子的实时 定量测定 利用f l u o - 3 . l n d o-l , f u r a - r e d 等多种荧光探针， 激光扫描显微镜可对单个细胞内各种 。 k e y ; 一一 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 离子( c a 、 k 、 n a 、 m g z + 和p h值) 的比 例及动态变化 做毫秒级定时定量 分析: 可 以定量探测胞质中c a 对肿瘤启动因子、化学因子、生长因子及各种激素等刺激的反应: 使用双荧光探针f l u o - 3 和s n a r f 可同时测定c a t + 和p h值。 可见激光扫描共焦显微镜能 完成活细胞生理信号的动态监测。 ( 4 )激光显微外科及光镊技术 激光扫描共焦显微镜可将激光作 “ 光子刀”使用，以完成细胞膜瞬间穿孔，线粒体、 溶酶体等细胞器灼伤，染色体切割，神经元突起切除等一系列外科手术。 光镊技术是利用激光的力学效应，将一个微米级大小的细胞器或其他结构钳制于激光 束的焦平面。也可称为光钳。可利用光钳技术来移动细胞的微小颗粒和结构 ( 如染色体、 细胞器)进行细胞融合、机械刺激和细胞骨架弹性测量等。 ( 5 )胞间通讯的研究 动物细胞中缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起着非常重要的作 用。激光扫描共焦显徽镜通过测量细胞缝隙连接介导的分子转移，观察相邻细胞之间的胞 间通讯。 可用于研究肿瘤启动因子、 生长因子以及细胞内c a ， 和。 a m p 对缝隙连接和胞间 通讯的影响。 ( 6 ) 光活化技术 许多重要的生物活性物质和化合物 如神经递质、 细胞内第二信使、 核普酸、c a 及 某些荧光素 等) 均可 形成笼 锁化合物， 如c a t 的笼 锁化合物主要有n it r - 5 和d m - n it r o p h e n i ) 称多 光子激发，但在本文以 后章节中也将 单光子一并称为多光子。多光子具有以下优点:( 1 )由于多光子激发截面小，因此可以在 无需共焦针孔的情况 获得与常规c s o m 类似的分辨率， 同时提高了信噪比:( 2 ) 可以在长 波长照明光照明下激发紫外波段荧光成像:( 3 )引起更小的光毒性和光漂白;( 4 )在生物 样品中有更深的成像深度。因此，多光子激发被认为是目 前细胞、亚细胞水平活体组织显 徽成像的最先进技术。 对n - p 显 微成像的 研究正是 本文的 主要研究内 容，以 下内 容将详 细 介绍。 除 此以 外， 还有干 涉型 共焦 显微术 iz 1 、 全息共 焦显 微术1 e 1泵 浦双 光子 1 19 1 等多 种共 焦显微术改进型。 一 -气一 1 曰 甘 刀1 1 a 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 . 2多光子激发荧光扫描成像术 1 . 2 . 1多光子激发原理 1 9 9 0 年 s c i e n c e 首次报道了w .d e n k 将双光子激发技术引入共焦显微成像术而研制 的一种新型显微技术双光子激发荧光显微成像术。单光子激发荧光是共焦荧光显微术 f l u o r e s c e n c e e m i s s i o n e mi s s i o n a ) i - p e x c i t a t i o n b ) 2 - p e x c i t a t i o n 图 1 - 4 单光子橄发与多光子 激发原理示意图 基本技术。双光子激发荧光和单 光子激发荧光机理的比较可如图 1 一所示。 在单光子激发 中，荧光分子每吸收一个照明光子，从基态跃迁到激发态.经过能量迟豫后释放一个长波 长 荧光光子 ( 如图 1 - 4 a ) 。 对多 光子激发而言， 荧 光分 子同时 吸收两个 ( 2 - p ) 或多 个照明 光子， 才从基态跃迁到激发态，同样经过能量弛豫后发出荧光 ( 如图 1 - 4 b ) 。在多光子激发 中， 所激发出的荧 光波长短于 照明 光波长!m 1 其实早在1 9 3 1 年， g o p p e rt - m a y e r 就对光子吸收作了 理论预言。 但由于 受到普通光源 发光为弱光的限制，长期以 来，无论在理论上还是在实验上均没有得到重视。直到激光技 术成 熟。 用 脉 冲红 宝 石 激光 器 激 发c a f 2 :e u ; 时 才观 察 到双 光子 吸收. 要 实 现多 光 子 激发， 一般需要用超快激光，产生高峰值密度的光子， 聚焦在合适的荧光介质上，以 足够高的几 率来诱导多 光子跃 迁。从 基态到 激发态n 光 子跃 迁的 儿率是 (n i w . 一 。 。 ， ” 恤 ) / 伪 。 丫( 1 .2 ) 式中，。 。 是n 光子激发 截面，1 恤 ) 是频率为v 的 激光 强度。v的 表达式可由 第n 级 微扰计 算得到， 在可见光波段内，有l a _ / a 。 卜 1 o - s4 。因 此必须 将激光会聚到一 个极其微小的时 空间隔内才能有足够高的几率在产生可测量的荧光信号。通过将此点在生物样品内扫描. 同时记录激发的荧光信号，就可以构建出组织样品的三维像。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 . 2 . 2多光子激发显微成像术 在采用多光子激发的共焦荧光显微术中由于激发儿率小， 在焦点区域亚飞升体积内 才 有足够的光子密度激发荧光。而对单光子而言激发儿率相对较高，照明光入射区域都有荧 光被激发( 如图1 - 5 所示) .因 此多 光子 激发 具有 独特空间 选择 特性。 这一空间 选择特性意 味着在探测光路上可以不采用共焦针孔，同样获得三维分辨能力。不采用共焦针孔意味着 可以获得更高的荧光收集效率。 由多光子激发这一非线性光学特性带来的显微成像术的优点则可以如下总结: ( 1 )多光子激发具有独特的定位特性。 只有在焦点处的光子密度才足以使多个光子同 时到达并激发荧光分子，这样的高准确度定位不仅保证了多光子激发显微镜固有的三维分 辨率，而且使其具有很强的在亚飞升体积内观察光化学过程的能力。来自 理论分析与实验 的结果还表明多 光子具有比 单光子更高的分辨率与 层析能 力【x x ( z )多光子激发局限于 焦点处， 使光漂白 和光损伤也局限于焦点附近。 从而可以获得 比单光子荧光成像更少的 光漂白 与 光损伤。 也 就是说 可以 对活细胞 进行更长时间的 观察m i ( 3 )多光子采用较长 波长光激发较短波长 荧光。 也就是说可以使用可见光、 近红外光 1 1 - i n a t i o n 下g h t o b j e c t i v e 1 - p 2 , 3 - p 图 一 5 单光子、多光子激发荧光显微术对比 激发紫外光成像。紫外光通常对生物样品有很强的损 伤，采用长波长光激发可以有效减少 样 品 的 萦 外 损 伤 。 ( 4 ) 照明光和荧光波长差别比 较大。 双光子激发中， 照明 光波长约为荧光波长的两倍. 因此在光学系统设计上非常容易区分照明光与荧光. ( 5 ) 无需采用针孔即可以 获得高信噪比图 像囚。 ( 6 ) 生物组织对长波长光表现出高散射特性。而对紫外和可见光表现更强的吸收作 用，这样采用紫外激发需要增加用来激发物质的 照明光强度。因此， 传统共焦显微镜处理 标本的深度就被限 制在几微米内二 共焦显 微镜中 只有少次散射的 光子参与 成像， 而多 光子 激光显微镜的d e s c a n n e d 探侧器能使多次散射的荧光光子参与成像，再加上长波长激光的 深度穿透能力。 多光子显微镜可以 对生 物样本内 部更深 层 ( 深度超过5 0 0 徽米) 成像(x5 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 由于以上优点.多光子激发显微成像术广泛应用于生物化学、细胞生物学、发育生物 学和神经学等生物医学各个研究领域中， 而且利用该技术获得的研究成果受到了 广泛关注。 1 . 2 . 3多光子激发显微成像系统 尽管三十年代即提出了多光子激发的理论，1 9 9 0 推出第一个实用的多光子激发荧光显 微成像系统， 直到1 9 9 6 年才出 现第一个商用系统。 一个典型多光子激发成像系统的结构图 如图 l 一所示。系统在共焦成像系统的基础上采用不同的激光光源构成。目 前多光子激发 系 统 一 般 采 用t i :s a p p h i r e 激 光 器m 飞 秒 脉 冲 激 发， 尽 管 采 用 连 续a r k r 激 光 器 连 续 波 激 发 多光子也见诸报道cz , i 。 连续波长激光光学系统 简单、 便宜， 但和飞 秒脉冲激光器相比 有以 图1 一多光子 激发成像系统结构图 下缺陷:( ” 激发波长可选范围小，因而只能激发有限的几种荧光探针，而飞秒激光器一 般可调谐波长为6 9 0 - 1 0 6 0 n m ， 因而可选荧光探针较多:( 2 ) 连续波激光器瞬态功率远远低 于飞秒激光器。因此它对相同强度荧光激发需要更多的时间，这也限制了对活体组织可连 续观察的时间;( 3 ) 连续波激光器也因此激发成像深度有限。 在商用系统中同时采用a r k r 激光器和t i :s a p p h ir e 激光器两种激光光源分别 用于单 光子和多 光子激发 成像。 在商用系统中.一般采用振镜实现光束扫描获得快速的横向扫描，采用样品平台轴向 移动实现轴向扫描。从激光光源发出的照明光经过扫描装置以 及显微镜入射到样品上激发 荧光。在反射式共焦系统中，相同的物镜用于收集荧光。 分束器用于区分荧光和照明光。 使用不同波长激发光时，通过不同涟光片组实现波长选择。荧光最后到达光电倍增管从而 被探侧。光电倍增管所输出的电信号通过图形工作站实现重构获得二维或三维图像。扫描 装里与涟光片的选择通过计算机控制获得自 动调节。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 虽然多光子显微成像系统已 得到商用，但是对其改进仍然是目 前多光子显微成像术研 究的热点. 在多 光子显 微系统中引入共焦针孔i2r ,2 d 、 偏振i2 r i 、 环瞳d i 等技术获得了 广泛的 研讨.同时在共焦显微术中研究的干涉l v z 等方法