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芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆蒈肅膄蒅薁袈膀蒄螃膃肆蒃袅羆莅蒂薅蝿芁蒂蚇羅膇蒁螀螇肃薀葿羃罿蕿薂螆芈薈蚄羁芃薇袆螄腿薆薆聿肅薆蚈袂莄薅螁肈芀薄袃袁膆蚃薂肆肂芀蚅衿羈艿螇肄莇芈薇羇芃芇虿膃腿芆螁羅肅芅袄螈莃芄薃羄艿莄蚆螇膅莃螈羂肁莂蒈螅肇莁蚀肀莆莀螂袃节荿袅聿膈莈薄袁肄莈蚆肇羀蒇蝿袀芈蒆 文件名称 标准操作规程(sop)文件类型sop生效日期(年/月/日)修改日期(年/月/日)文件号页码2012-02-102012-02-10hiv002 1目 录lab/sop/01进口680型酶标仪仪器操作指南 lab/sop/02进口680型酶标仪软件操作帮助 lab/sop/03进口1575型洗板机简易操作流程 lab/sop/04电热恒温箱使用规程 lab/sop/05离心机使用规程 lab/sop/06生物安全柜使用规程 lab/sop/07消毒剂的配制 lab/sop/08废弃物品的消毒处理 lab/sop/09工作区的消毒 lab/sop/10实验室安全制度 lab/sop/11实验室带入物品的安全要求lab/sop/12实验室带出物品安全要求 lab/sop/13实验室人员的管理和健康监护 lab/sop/14样品的运送和发放 lab/sop/15事故紧急处理 lab/sop/16潜在性感染材料的接收 lab/sop/17实验室安全操作要求 lab/sop/18实验标准操作程序1 lab/sop/19实验标准操作程序2 lab/sop/20实验室记录的标准操作程序 lab/sop/21保证数据完整性标准操作 lab/sop/22用电话、传真、e-mail报告结果的标准操作程序 lab/sop/23手提式电热压力蒸汽消毒器的标准操作程序 lab/sop/24样品的采集、登记、处理、保存和运输 编号:lab/sop/24样品的采集、登记、处理、保存和运输1 样品的采集和处理艾滋病检测最常用的样品是血液,包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。1.1 血清样品采集和处理1.1.1 用一次性注射器(或真空采血管)抽取一定量静脉血,室温下自然放置12h,待血液凝固、血块收缩后再用3000r/min离心15min,吸出血清备用。1.1.2 如用滤纸片采样,则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒,在刺破皮肤后,迅速把滤纸片沾上,切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后再包装送检。1.2 抗凝血样品采集和处理1.2.1 用加有抗凝剂的真空采血管(或一次性注射器抽取静脉血,转移至加有抗凝剂的试管),反复轻摇,分离血浆和血细胞备用。1.2.2 应根据实验要求选用适当的抗凝剂,如cd4+/cd8+t淋巴细胞测定可选用k3edta、肝素或枸橼酸钠,hiv病毒分离、核酸定性/定量检测可选用k3edta或枸橼酸钠。1.2.3 用于核酸定性检测时,采集的抗凝全血应在48h内分离pbmc和血浆,否则应在2448h内分离血浆和血细胞。1.3 采集样品注意事项1.3.1 采集样品原则上应按临床采血技术规范操作(试剂盒说明书有特殊要求除外)。1.3.2 采集样品时应注意安全,建议采用真空采血管及蝶形针具,以避免直接接触血液;直接接触hiv感染者/艾滋病(aids)病人血液/体液的操作,应戴双层手套。2 样品的保存2.1 用于抗体检测的血清或血浆样品,应存放于-20以下,短期(1周)内进行检测的样品可存放于28。2.2 用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20以下,进行病毒rna检测的样品如需保存3个月以上应置于-80。2.3 用于cd4+/cd8+t淋巴细胞测定的样品不能长期保存,样品采集时间超过48h则不可检测。3 样品的运送3.1 实验室间传递的样品应为血清或血浆,除特殊情况外一般不运送全血。3.2 应采用who提出的三级包装系统3.2.1 第一层容器:装样品,要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内,试管上应有明显的标记,标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料,以免碰碎。随样品应附有送检单,送检单应与样品分开放置。3.2.2 第二层容器:要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器,可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内,容器的材料要易于消毒处理。3.2.3 第三层容器:放在一个运输用外层包装内,应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签(数量,收、发件人)。3.3 血清和血浆样品应在28条件下由专人运送。用于cd4+/cd8+t淋巴细胞测定的样品应在室温下1823运送。每一包装的体积以不超过50ml为宜。3.4 运送感染性材料必须有记录。3.5 如分离血浆仍有困难,可直接将抗凝血-20以下冻存,采用冰壶冷藏运输,避免冻融。3.6 特殊情况下如需对个别样品进行复测,可以用特快专递形式投寄,但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好,避免使用玻璃容器,以保证不会破碎和溢漏。4 样品的接收4.1 含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的、穿戴防护衣的工作人员打开,用后的包裹应进行消毒。4.2 核对样品与送检单,检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出,对样品管和盛器消毒,同时报告有关领导和专家。4.3 检查样品的状况,记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受,则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。4.4 打开标本容器时要小心,以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出,则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜,以防皮肤或粘膜污染。4.5 因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。4.6 接收样品时应填写样品接收单。艾滋病筛查检测登记表 登记日期 年 月 日标本编号(gb码)姓 名性别年龄婚姻状况人群特征通 讯 地 址采样日期检测日期检测结果结果报告日期报告人确认结果备注elisapa快速 文件名称 标准操作规程(sop)文件类型sop生效日期(年/月/日)修改日期(年/月/日)文件号页码2012-02-102012-02-10hiv002 2 目 录lab/sop/25检测方法和步骤lab/sop/26生物诊断试剂使用记录和保存记录lab/sop/27实验质量控制与质量管理lab/sop/28检验结果解释与报告lab/sop/29保密lab/sop/30实验室数据、文件记录lab/sop/31实验室安全防护lab/sop/32不确定样品追踪和处理lab/sop/33实验室清理和消毒编号:lab/sop/25检测方法和步骤1. 目的:为hiv实验室各技术人员统一实验操作程序,保证实验质量,特制定本程序。2. 适用范围:适用于hiv实验室技术人员。3. 规范性引用文件:全国艾滋病检测技术规范(2004年版)。4 相关器材设备:人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(双抗原夹心酶联免疫法)hiv(1+2)。5 安全防护器材与措施:一次性乳胶手套、隔离衣、口罩、帽子,接收或取用试剂时应把试剂视作感染性材料对待。首先穿好一次性隔离衣,戴好口罩、帽子,最后戴好乳胶手套后再接触试剂。6 检测方法与步骤6.1双抗原夹心酶联免疫法6.1.1 试剂名称:人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.1.2试剂厂家:北京万泰生物试剂有限公司6.1.3原理及用途:采用基因工程抗原gp41和gp36包被酶联板,用基因工程hiv-1和hiv-2嵌合抗原env18标记辣根过氧化物酶,与其他试剂组成试剂盒,应用双抗原夹心法检测人血清或血浆中的人类免疫缺陷病毒抗体,用于献血员及高危人群中人类免疫缺陷病毒感染的筛查。6.1.4 试剂盒组成(96人份) 6.1.4.1.预包被板条 12孔8/8孔12 6.1.4.2.hiv酶标记物12ml1瓶6.1.4.3.阴性对照1ml1瓶6.1.4.4.阳性对照1ml1瓶6.1.4.5.25倍浓缩洗液80ml1瓶用去离子水或蒸馏水稀释 6.1.4.6.底物缓冲液8ml1瓶6.1.4.7.底物液8ml1瓶6.1.4.8.终止液7ml1瓶6.1.4.9.封口袋1个6.1.4.10.说明书1份6.1.5操作方法6.1.5.1. 加样:将预包被板条固定于板架上。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔,分别加入阴、阳性对照100ul;设空白对照1孔,不加样品。其余孔加入待测样品100ul。6.1.5.2. 温育:置37温育60分钟。6.1.5.3. 洗涤:弃去孔内液体,将稀释后的洗液注满各孔,静置3060秒,弃去孔内洗液,扣干。重复洗5次。6.1.5.4. 加酶:空白对照孔不加酶,其余孔加入酶标记物100ul。6.1.5.5. 温育:置37温育30分钟。6.1.5.6. 洗涤:弃去孔内酶标记物,重复洗5次(同操作步骤3)。6.1.5.7. 显色:每孔加入底物缓冲液50ul,再加入底物液50ul,振荡混匀,置37温育10分钟。6.1.5.8. 终止:每孔加入终止液50ul,轻拍混匀。在单波长450nm或双波长450nm/630nm下,用空白孔校零,再读取各孔od值。6.1.6结果判读 96.1.6.1. 要求: 阳性对照od值应 0.80 阴性对照od值应 0.08(空白校零后)6.1.6.2. 临界值(c.o.)计算: 临界值(c.o.) 阳性对照平均od值10% 备注:阳性对照od值大于2.5按2.5计算。6.1.6.3. 结果判定:样品od值 临界值(c.o.)为hiv抗体阳性样品od值 临界值(c.o.)为hiv抗体阴性初筛试验阳性者应重新取样进行双孔复试,按照全国艾滋病检测工作规范需将血样或重新采血送“hiv筛查中心实验室”进行确认试验。6.2.1试剂名称:人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.2.2试剂厂家:英科新创(厦门)科技有限公司6.2.3原理及用途:本试剂盒采用双抗原夹心两部法检测人血清或血浆样本中(hiv 1/2)型抗体.采用多种hiv-1和hiv-2的特异性抗原制作预包被板及酶结合物.当待检样本中存在hiv抗体时,在反应过程中形成“固相hiv抗原-hiv抗体-酶标记hiv抗原”的免疫复合物,加入底物后形成显色反应.适用于辅助诊断及献血员筛查。6.2.4试剂盒组份6.2.4.1. 测抗-hiv酶联板1块 (96孔) 7. 显色剂a 1瓶 (7ml)6.2.4.2. 测抗-hiv样品稀释液1瓶 (7ml) 8. 显色剂b 1瓶(7ml)6.2.4.3. 测抗-hiv酶标抗原1瓶 (13ml)9. 终止液 1瓶 (7ml)6.2.4.4. 抗-hiv阳性对照(已灭活)1瓶 (1ml)10.不干胶封片2张6.2.4.5. 抗-hiv阴性对照(已灭活)1瓶 (1ml)11.说明书1份6.2.4.6. 20洗涤液 1瓶 (50ml)12.密封袋、干燥剂1套6.2.5标本要求 血清或血浆(可用枸橼酸钠、肝素等作抗凝剂)6.2.6仪器要求 酶标仪 洗板机 恒温箱 加液器等 6.2.7检测程序6.2.7.1将各种试剂移到室温(18-25)平衡半小时后,取一瓶20洗涤液,加蒸馏水至1000 ml,混匀后备用。6.2.7.2将酶联板从密封袋中取出,每孔加入1000l酶标抗体,设一个空白对照孔,两个阳性对照孔,两个阴性对照孔。取阳性对照和阴性对照分别充分混匀后各20l 加入对照孔中,其余每个孔加待检血清20l,充分混匀,将酶联反应板置微板振荡器上混合510秒,用不干胶封片封盖反应板。未用完的板条在密封袋中保存。6.2.7.3酶联板置37温育60分钟, 小心吸干孔中血清,用洗涤液洗5次,然后在吸水纸上拍干。6.2.7.4每孔加显色剂a 50l ,显色剂b 50l ,轻轻振荡后置37暗处显色30分钟,每孔加终止液50l。6.2.7.5选择酶标仪测定波长450nm,用空白孔调零点,测定各孔od值。也可选择630 nm作为参考波长,用双波长测定。6.2.8结果判定6.2.8.1cutoff值0.12n(阴性对照的平均值)6.2.8.2阴性对照od值大于等于0.10。6.2.8.3阳性对照od值大于等于0.80,阴性对照od值大于0.1,则实验不成立,全部实验重做。6.2.8.4标本od值小于cutoff值为阴性,大于等于cutoff值为阳性。6.2.8.5阳性者须重新取样双孔复试,复试阳性者应按全国hiv管理规范,送hiv筛查中心实验室进行确认。6.2.9注意事项6.2.9.1. 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的hiv初筛实验室。6.2.9.2. 整个hiv检测必须符合全国艾滋病检测技术规范生物安全守则规定,严格防止交叉感染。操作时必须戴手套、穿工作服,严格健全和执行消毒隔离制度。6.2.9.3. hiv-1/hiv-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。6.2.9.4. 样品及各种试剂应用加液器加注,并经常校对其准确性。6.2.9.5. 洗涤时各孔均需加满洗液,防止孔口有游离酶不能洗净。6.2.9.6. 所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。6.2.9.7. 微孔板条从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干尽方可使用,未用完者须放入有干燥剂的密封袋中保存。6.2.9.8. 用于检测的样品应保持新鲜。6.2.9.9. 剩余样品及废弃物应经121高压蒸汽灭菌30分钟,或用5.0g/l次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。6.2.9.10. 若倍浓缩洗液出现结晶,请放置37至溶解。6.2.9.11. 结果判读请在15分钟内完成。6.2.9.12. 不同批号的试剂组份不可混用。6.3.1 试剂名称:人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒6.3.2试剂厂家:珠海丽珠试剂有限公司6.3.3原理及用途:本品系用纯化基因工程人类免疫缺陷病毒型和型(hiv-1/hiv-2)抗原(合成肽或基因重组蛋白)包被的微孔板和酶标记的hiv-1/hiv-2抗原及其他试剂组成,应用双抗原夹心法原理(sandwich elisa)检测人血清或血浆中的hiv-1/hiv-2抗体。6.3.4.1.hiv抗原包被板 12孔8/8孔12 6.3.4.2.hiv酶标记物7ml1瓶6.3.4.3.阴性对照1ml1瓶6.3.4.4.阳性对照1ml1瓶6.3.4.5.20倍浓缩洗液50ml1瓶用去离子水或蒸馏水稀释至1000ml 6.3.4.6.底物缓冲液7ml1瓶6.3.4.7.底物液7ml1瓶6.3.4.8.终止液7ml1瓶6.3.4.9.封口袋1个6.3.4.10.说明书1份6.3.5操作方法6.3.5.1. 将试剂盒平衡至室温,取出所需的条板,剩余的即时封存。6.3.5.2. 用去离子水和蒸馏水20倍稀释浓缩洗涤液。6.3.5.3.将所需数量的条板固定于支架,按顺序编号,设置样品孔、空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔(每次实验需设空白对照1孔,阳性对照2孔,阴性对照3孔。)。在样品孔中加入50ul待测样品, 空白孔不加任何液体,阴性、阳性对照孔分别加入50ul阴性或阳性对照,轻拍混匀。6.3.5.4.置37温育30分钟。6.3.5.5. 将孔内液体甩干,置洗板机用洗涤液充分洗涤6遍,扣干。(注:洗涤时各孔要加满洗液,勿使孔间交叉污染。采用洗板机时应设定每遍有60秒的浸泡时间。)6.3.5.6. 每孔加入50ul酶标记物(空白孔除外),轻拍混匀。6.3.5.7. 置37温育30分钟。6.3.5.8. 将孔内液体甩干,置洗板机用洗涤液充分洗涤6遍,扣干。(注:洗涤时各孔要加满洗液,勿使孔间交叉污染。采用洗板机时应设定每遍有60秒的浸泡时间。)。6.3.5.9. 每孔加入50ul底物缓冲液和50ul底物液,轻拍混匀,置37避光温育30分钟。6.3.5.10. 每孔加入50ul终止液终止显色反应.6.3.5.11. 用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔,并以空白对照孔调零)或双波长450nm/630nm测定各孔a值。6.3.6结果判定 6.3.6.1. 临界值(cutoff)0.15阴性对照的平均a值6.3.6.2样品的a值cut off值为hiv抗体反应阳性。6.3.6.3样品的a值cut off值为hiv抗体反应阴性。6.3.6.4. 正常时,阴性对照a值应0.12,阳性对照a值应0.80,阴性对照值若小于0.08以0.08计算。 6.3.6.5. 若阳性对照a值孔间之差大于30%,应重复实验。6.3.6.6. 初次实验阳性者应重新取样进行双孔复试,按全国hiv检测管理规范的要求,须将血样或重新采血送hiv确认实验室做确认实验,确认报告阴性者,血可以发放使用;凡确认实验阳性和可疑者,血不能发放使用,统一送确认实验室处理。6.3.7注意事项6.3.7.1. 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的hiv初筛实验室。6.3.7.2. 整个hiv检测必须符合全国艾滋病检测技术规范生物安全守则规定,严格防止交叉感染。操作时必须戴手套、穿工作服,严格健全和执行消毒隔离制度。6.3.7.3. hiv-1/hiv-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。6.3.7.4. 样品及各种试剂应用加液器加注,并经常校对其准确性。6.3.7.5. 洗涤时各孔均需加满洗液,防止孔口有游离酶不能洗净。6.3.7.6. 所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。6.3.7.7. 微孔板条从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干尽方可使用,未用完者须放入有干燥剂的密封袋中保存。6.3.7.8. 用于检测的样品应保持新鲜。6.3.7.9. 剩余样品及废弃物应经121高压蒸汽灭菌30分钟,或用5.0g/l次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。6.3.7.10. 不同批号的试剂组份不可混用。6.4.1试剂名称:人类免疫缺陷病毒(hiv1/2)抗体诊断试剂(乳胶层析法)6.4.2试剂厂家:艾康生物技术(杭州)有限公司6.4.3实验原理:本品系用特异性重组hiv1/2抗原gp41和gp36及兔抗hiv1/2多克隆抗体包被硝酸纤维素膜,配以红色乳胶标记重组hiv1/2抗原pg41和pg36及其他试剂制成,应用双抗原夹心反应原理,定性检测血清/血浆标本忠hiv1/2抗体,用于无偿献血的现场筛查.6.3.4.试剂组成6.3.4.1.说明书1份6.3.4.2. 艾康人类免疫缺陷病毒(hiv1/2)抗体诊断试剂(乳胶层析法)6.3.4.3. 一次性吸管.6.3.5 试验方法:6.3.5.1. 本试剂使用人血清或血浆。检测时应尽量使用新鲜的样本;样本出现浑浊时,通过离心或过滤取上清检测。6.3.5.2. 不能检测含有悬浮纤维蛋白或聚集物、重度溶血的样品。6.3.5.3. 样品中应无微生物,无菌分离的样品可以再2-8储存1周,长期储存应于-20或更底温度条件,避免反复冻融。6.3.5.4. 使用前请将样品室温平衡30分钟以上,冷冻样品实验前需混匀。6.3.5.5. 不能使用放置时间过常、长菌、发臭的标本,这样避免因标本污染而造成的非特异反应。6.3.6 实验方法:在加样处滴加样品80ul,平置于室温,30分钟内看结果,9.6.3.7结果判定 6.3.7.1. 在30分钟后的结果无效。6.3.7.2. 样品视为传染品,注意安全操作。6.3.7.3. 测试卡上显示两条红线时,即可判为初筛实验阳性结果。6.3.7.4. 测试卡从包装中取出后,应在60分钟内使用,潮湿空气中暴露时间过长将影响检测结果。如测试卡储存于冰箱(2-8),取出后,应平衡至室温再开口使用。6.3.7. 注意事项6.3.7.1. 检测为阳性的标本药注意保藏,并需要进一步确正。6.3.7.2. 检测为阳性的样品,需要进行复检,复检为阳性的样品,应按全国艾滋病检测技术规范送hiv确证实验。6.3.7.3.测试卡应在hiv初筛实验室由经过hiv检测技术培训的人员进行操作使用。7 附录7.1 北京万泰双抗原夹心法试剂盒使用说明书7.2 英可新创双抗原夹心法试剂盒使用说明书7.3 珠海丽珠双抗原夹心法试剂盒使用说明书7.4人类免疫缺陷病毒(hiv1/2)抗体诊断试剂(乳胶层析法)使用说明书编号:lab/sop/26生物诊断试剂使用记录和保存记录 使用记录:试剂名称使用日期主要性状使用者备注 保存记录编号试剂名称数量供货单位保藏方式存放地点到货日期有效期编号:lab/sop/27实验质量控制与质量管理1. 目的:为hiv实验室各技术人员统一实验操作程序,保证实验检测质量,特制定本程序。2. 适用范围:适用于hiv实验室技术人员。3. 规范性引用文件:全国艾滋病检测技术规范(2004年版)。4. 相关器材设备:酶标仪、洗板机、标准血清。5. 安全防护器材与
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