（动物学专业论文）绿僵菌传代菌株的退化.pdf

摘要 摘要 绿僵菌在生物防治中的作用越来越明显，但在生产中出现的退化问题，一 直是人们难以解决的问题。本研究着重对绿僵菌m a 0 9 、1 2 4 5 、9 8 5 、双型孢4 个菌株，在传代过程中出现的退化进行了研究，主要结果如下： ( 1 ) 菌株的复壮和传代培养。供试菌株经过宿主体内复壮后，产孢量明显 增加，菌丝的生长速率也明显比复壮前小。从传代的结果看，随着传代次数的 增多，菌株的产孢量越来越低，甚至已经不产孢。这表明传代过程中，菌种发 生了退化。 ( 2 ) 菌株的生长速率、产孢量的测定。传代后的各代菌株在生长的后期， 表现差异显著。随着传代的进行，菌株菌丝的生长速率增加。菌株双型孢还表 现一定的菌丝疯长现象，第1 代菌丝生长速率是3 8 7 0 2 4 6 5 m m d ，而第9 代达 到了4 8 4 3 3 _ , 2 0 0 4 0 8m m d ，与其它各代差异显著。产孢量的测定发现，随代数增 加，产孢越来越少。菌株9 8 5 第1 代每e n l 2 孢子含量为5 0 6 x 1 0 9 ，第9 代每c e l l 2 孢子含量2 4 9 x 1 0 9 。 ( 3 ) 菌株的毒力测定。根据绿僵菌毒力测定并采用时间一剂量死亡率模 型模拟分析，结果表明，各代菌株都对供试虫有致病力，但各代菌株有差异。 菌株9 8 5 的第1 5 代的致死中时最大1 1 8 5 d ，说明第1 5 代的毒力最弱。传代的靠 前的几代没有表现明显的差异，一直到第1 2 代才表现出显著差异。所以在生产 中，不应使用传代次数太多的菌株作为生长用的菌株。 ( 4 ) 各代菌株的酯酶同工酶比较研究。随着传代的进行，酶的活性在不断 减弱，尤其是几条主要酶带的活性变化更为明显。从聚类图中各菌株排列次序 来看，各代菌株按照传代顺序排列。第1 代菌株与越靠后的菌株之间的类间距 越大，说明传代越多变异的发生的几率就越大。 ( 5 ) 各代菌株的d n a 多态性的r a p d 分析。r a p d 分析结果显示，4 个 菌株传代培养的第1 8 代与其它各代的类间距最大，与其它各代菌株的相似率是 最小的，说明菌株它在传代过程中，基因组d n a 已经发生了一定变化。也就是 说，各代菌株在d n a 水平上已经产生了遗传变异。 关键词：绿僵菌：传代培养；退化；同工酶；随机扩增多态性d n a 分析； a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee f f e c to fm e t a r h i z i u ma n i s o p l i a eo nb i o l o g i c a lc o n t r o lb e c a 3 m e sm o r ea n d m o r ee v i d e n t s ow em u s tr e s e a r c ht h ed e g e n e r a t i o ne l m a n i s o p l i a ef o ri t se x t e n s i v e u s e t h i sp a p e ra i m st or e s e a r e ht h ed e g e n e r a t i o no f4s t r a i n so f 脱a n i s o p l i a e p r e s e n t i n gi np a s s a g e t h er e s u l t sa r ea sf o u o w s ( 1 ) r e j u v e n a t ea n d p a s s a g e o f f o u rs t r a i n s o f ma n i s o p l i a e a f t e rr e j u v e n a t i o n i ni v i oo fh o s tt h es p o r ey i e l d sm u c hm o r ea n dt h eg r o w t hr a t eb e c o m es l o w e r t h e r e s u l t sa l s os h o wt h a tt h es p o r ey i e l d so fs t r a i n sb e 虻o m e sf e w e ra l o n gw i t ht h e p a s s a g e t h e r ea l es o m es t r a i n sh a v en os p o r ey i e l dw h i c hs u g g e s t e dt h a tt h es t r a i l 塔 h a v ed e g e n e r a t e d ( 2 ) m e a s u r et h eg r o w t hr a t ea n ds p o r ey i e l d t h eg r o w t hr a i la n ds p o r ey i e l do f t h et e s ts t r a i n sh a v es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c eo nt h ea n a p h a s eo fg r o w t h t h eg r o w t h r a t eo fs t r a i n sb e c o m e sf a s t e ra l o n gw i t hp a s s a g e a tt h es a m et i m et h es t r a i nb i b p r e s e n t sm y c e l i u mh y p e r t r o p h y t h eg r o w t h r a t eo ft h ef i r s t g e n e r a t i o n i s 3 8 7 - - * 0 2 4 6 5 m m d c o m p a r i n gw i t ho t h e rg e n e r a t i o n st h eg r o w t hr a t eo ft h en i n t h g e n e r a t i o nr e p r e s e n t ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ti s4 8 4 3 3 _ l 0 0 4 0 8m m d t h es p o r ey i e l d b e c o m e sf e w e ra n df e w e ra l o n gw i t l lp a s s a g e s p o r ey i e l do ft h es t r a i n9 8 5i s 5 0 6 x 1 0 9 e r a 2i nt h ef i r s tg e n e r a t i o n , a n di s2 4 9 x 1 0 9 e m 2i nt h en i n t h ( 3 ) m e 笛i u 己t h ev i r u l e n c e t h ev i r u l e n c eo f e x p e r i m e n t a ls t r a i n si sa n a l y z e db y t h et i m e - d o s e m o r t a l i t ym o d e l a l lt h ep a s s a g es t r a i n sc a l lk i l le x p e r i m e n t a li n s e c t s t h el t 5 0o ft h e1 5 t hg e n e r a t i o no ft h es t r a i n9 8 5i s1 1 8 5 d w h i c hm e a n si t sl o w e s t v i r u l e n c e t h es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c et h e1 2 t hg e n e r a t i o n s ow h e nu s i n g 胍 a n i s o p l i a e ，t h es t r a i n sa f t e rm a n yg e n e r a t i o n ss h o u l da v o i d ( 4 ) c o m p a r et h ei s o z y m eo ft h e d i f f e r e n ts t r a i n s t h ee s t e r a s ei s o z y m eo f d i f f e r e n ts u b c u l t u r e ss h o w e ds a m et y p eo fz y m o g r a m ，b u ti t s a c t i v i t yd e c r e a s e s o b v i o u s l yf r o mg e n e r a t i o nt og e n e r a t i o n d i s t i n c tg e n e t i cd i v e r s i t ya m o n gd i f f e r e n t p a s s a g eg e n e r a t i o n s ，t h ef i g u r e o fc l u s t e r i n ga n a l y s i ss h o w st h a tt h eg e n e r a t i o n o r d e r i n gb yp a s s a g e t h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nt h ef i r s tg e n e r a t i o na n do t h e r s b e c , o m el o n g e rf r o mg e n e r a t i o nt og e n e r a t i o n i na l l ，m o r eg e n e r a t i o nm e a n sm o r e a b e r r a n c ei nm a n i s o p l i a e a b s t r a c t ( 5 ) r a p da n a l y s i so fd n ad i v e r s i t y t h eg e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e n1 8 t h g e n e r a t i o na n dt h eo t h e r sa i cl a r g e s t , w h i l e t h e r es i m i l a r i t i e sa l ee n g e n d e r e d i t s u g g e s t e dt h a tg e n e t i cv a r i a t i o nh a sh a p p e n e do nt h el e v e lo nd n a k e yw o r d s ：m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ，s u b c u l t u r i n g , d e g e n e r a t i o n , i s o z y m e ， m 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进i t s g a 腕t 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌盍堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的i s l 志对本研究所做的任何贡献均已在论文1 作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：j 支从签字日期：妒7 年r 上月p 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全r 解壶昌盍堂 有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送父论文的复印件和磁 懿，允许沦文被查阅利借阅。本人授权直昌太望：可以将学位论文的令 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或于1 描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位i ：仑文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 湃岛认 签字曰期：哆珲，二川，rl 1 聊签名：孙式 签字h 期：矿埠，。j j | _ _ i 1 第1 章前言 第1 章前言 自从1 8 7 9 年m e y h n k o b 首先大量繁殖绿僵菌防治奥地利丽金龟( a n 妇o p l i a a u s t r i a c ah e r b s t ) 以来，绿僵菌就成为了害虫微生物防治的主角之一。绿僵菌属 ( m e t a r h ：i z i u ms o r o k i n , 1 8 8 3 ) 隶属于真菌门( e u m y c o t a ) 、子囊菌亚门( a s c o m y c - o t i n a ) 、核菌纲( p y r e n m y c e t e s ) 、球壳菌i 目( s p h a e r i a l e 曲、麦角菌科( c l a v i s i p i t e t a c e a e ) 。 2 0 世纪初，对绿僵菌的研究仅限于分类、培养特性、感染机制及其影响因 素等方面；5 0 6 0 年代，人们开始对绿僵菌的形态、分类、生理生化等进行系 列研究；8 0 年代末，对绿僵菌菌剂的生产及生物防治进行了深一步的研究。1 9 8 8 年，金龟子绿僵菌制剂应用于澳洲甘蔗和牧草害虫的防治，其应用才算取得较 大进展。应用绿僵菌防治地下害虫及非洲蝗虫也已取得初步成效，绿僵菌的研 究和应用成了生物防治领域的一个热点。1 1 卅 1 1 绿僵菌的应用 绿僵菌m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e 是虫生真菌的主要类群之一，寄主范围广， 能寄生8 个目3 0 个科，约2 0 0 种昆虫，螨类及线虫川，利用绿僵茵防治的研究 与实践已愈百年l 毋。金龟子绿僵菌小孢子变种寄生范围较广，除能寄生直翅旨、 鞘翅目、半翅目、膜翅目和鳞翅目的2 0 0 余种昆虫外，亦有报道可侵染蜘蛛、 蝇类及蚊子幼虫，它的分布是世界性的。大孢子变种则远不如前者普遍，主要 侵染独角仙类，亦有报道能寄生某些蝉。 它致病力强，效果好，对人、畜、作物无毒害，是当前虫生真菌研究的主 要对象之一。世界上许多国家包括美国、巴西、澳大利亚、菲律宾等均已将绿 僵茵应用于害虫防洲9 j 。从防治规模看，绿僵菌已发展成为仅次于白僵菌的真菌 杀虫剂i 埘，是一种具有良好应用前景的虫生真菌。 目前，绿僵菌己广泛用于防治甘蔗害虫、林木害虫、牧草害虫及卫生害虫 等，特别在白蚁、金龟子、蝗虫等害虫上研究工作做得比较深入。但用绿僵菌 防治蔬菜害虫的研究较少，针对小菜蛾的绿僵菌研究仅限于室内毒性测定和初 步的田间防治试验i n 1 3 j 第1 章前言 1 2 虫生真菌的退化研究 1 2 1 营养研究 真菌对营养的要求并不像细菌那样复杂，培养一般真菌的培养基也常常适 用虫生真菌。常用的天然培养基有马铃薯块、胡萝卜块、燕麦片、凝固蛋黄、 麦麸、豆饼粉、黄豆粉、玉米粉、米饭、昆虫煮汁或虫体等。采用天然营养料， 常使真菌获得全面的营养，但其组成成分不明确。常用的虫生真菌培养基有： 察氏琼脂培养基马铃薯一葡萄糖琼脂蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂萨氏葡 萄糖琼脂+ 酵母膏萨氏葡萄糖肉汁酵母萨氏麦芽糖琼脂+ 酵母膏蛋黄培养 基。 唐晓庆等【1 4 i 同时探讨t 8 种培养基。6 种氮源，1 5 种碳源，8 种p h ，不同温、 湿度、光照等对菌种稳定性、产孢量、毒力的影响。结果显示：白僵菌的变异 主要受控于菌株本身的遗传物质。常见的8 种培养基以营养贫乏的p d a 、s d a 、 c m a 最易发生变异，s d a y 较稳定；氮源是影响菌落局变的最主要因子，在供 试的6 种氮源中，动物性氮源较植物性氮源稳定蛋白胨最优，植物性氮源中麦 麸稳定性优于米糠、黄豆粉；碳源、c n 、p h 对菌株稳定性影响不明显；低温、 低湿、全光照下引起的变异最低。蔡国贵【1 5 l 等通过对l o + 菌株在5 种培养基上继 代培养情况检测，探讨了不同培养基对菌种稳定性、产孢量和毒力的影响，经 过比较以营养贫乏的p d a 培养基培养容易产生变异，菌苔局变面积大，含虫尸、 蛋白胨加p d a 培养基( c t p d a ) 培养最为稳定，表明氮源是影响变异的主要因子。 唐晓庆等1 16 】对不同培养基上的产孢量进行分析，结果表明，不同培养基对产孢 量影响显著。s d a y 和s a d 上产孢量较高，后依次为w b a 、w p a 、p d a 和c m a 。 1 2 2 毒力测定、产孢量、生长速率及毒力的影响 早期，s c h a e r f f e n b e r g 1 7 l 和f a r g u e s i s 】就发现球孢白僵菌在合成培养基继代培 养多代后毒力呈现出衰退现象，但他们认为选种毒力衰退是暂时的。唐晓庆【1 4 1 等发现球孢白僵菌在不同培养基上继代培养中常发生不同形式的菌落局变，局 变产生的分离株，有的较出发母株菌苔瘠薄，有的为气生菌丝徒长，这些局变 导致的变异意味着该菌生产性状发生了退化。 2 第1 章前言 樊美珍1 19 j 等研究表明由同一出发菌株产生的不同分离子问，产孢量、生长 速率及毒力多具显著差异，变异产生的局变分离子的生长速率大多高于原始型 分离子，因而在生产培养过程中菌落一旦出现局变，局变分离子即迅速扩展并 逐渐掩盖非局变区，这些生长快的分离子产孢量及毒力往往较低，因而在转管 传代过程中，菌种就呈现出产孢量下降、生长速率加快、毒力降低的退化现象。 唐晓庆等i 加j 研究发现由同一出发菌株产生的不同分离子株间，产孢量多具显著 差异。无论是多孢株还是单孢株，与出发母株相比，分离子株第5 代产孢量往往 呈现出一个( 或几个) 增加一个( 或几个) 下降或都下降的现象，高者增加至母株的5 倍之多，低者仅为母株的1 5 ，高低之间相差可超过15 倍。单孢株局变产生的 分离子株的产孢量多表现为下降。少数分离子株比母株产孢量稍高，但不显著。 最后得知，多孢株在继代培养中通过菌落局变可选择出产孢量较高的分离子株， 而单孢株一旦变异皆表现为产孢量下降的退化趋势。茵落由于局变产生的各型 分离子株与出发母株间及各分离子株之间，生长速率都呈现出差异，这种差异 性在多孢株分离子株间表现尤其明显，且局变型分离子株大多比原始型分离株 生长快。生长速率较快的分离子株多数产孢量低，而产孢量高的分离子株生长 反而较慢。单孢株各分离子株生长幅度差距较多孢株小，但也有和多孢株同样 变化趋向，即局变型分离子株，尤其是产孢量低的分离子株比原始型分离子株 生长快。唐晓庆1 2 l j 等对在不同培养基上第1 代和第5 代培养物的毒力测定结果进 行方差分析，得出同一菌株在不同培养基上的毒力差异不显著口 第5 代 第2 代 第9 代 第4 代 第1 代 第6 代 第7 代 第3 代菌株。 菌株1 2 4 5 的第6 代生长最快4 4 6 4 6 7 m m d ，生长最慢是第4 代只有3 9 7 m m d 。 第8 、9 代的生长速率也要比其它几代要大分别是4 4 8 1 7 m m d 、4 5 3 5 m m d 。各代 生长速率的极差为0 6 7 6 6 7 m m d 。各代菌株生长速率比较是，第6 代 第9 代 第8 代 第5 代 第2 代 第7 代 第3 代 第1 代 第4 代菌株。 菌株a 0 9 第9 代生长最快4 8 4 m m d ，第2 代生长最慢4 2 1m m d ，生长速率的极 差是0 6 6 m m d 。随着传代的进行生长速率也在增加。各代菌株生长速率比较是， 1 4 第3 章菌株退化的生物学特征 第9 代 第8 代 第7 代 第6 代 第1 代) 第5 代 第3 代 第2 代 第4 代菌株。 菌株双型孢的第9 代生长最快4 8 4 3 3m m d ，第1 代生长最慢3 8 7m m d ，生长 速率极差是0 9 7 3 3 3m m d 。各代菌株生长速率比较是，第9 代 第8 代 第7 代 第6 代 第5 代 第3 代 第2 代 第4 代 第1 代菌株。 3 2 菌株产孢量的测定 在实际生产中，选取菌种的一个重要指标就是菌株的产孢量。唐晓庆等团l 研究发现由同一出发菌株产生的不同分离子株间，产孢量多具显著差异。另外， 作为菌株退化的另一重要特征，在研究退化时，对菌株产孢量的测定就很有必 要。本实验对3 个供试菌株的1 9 代进行了产孢量的测定。 3 2 1 材料与方法 3 2 1 2 供试菌株 菌株m a 0 9 、9 8 5 、1 2 4 5 的第1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 代 培养基参照2 2 1 1 ，p p d a 培养基。 3 2 1 3 每c m 2 菌落产孢量的测定 参照孙继美等1 4 3 1 、张立钦等1 4 4 1 和r a y m o n d 等i 饲的方法。p p d a 培养基 上各菌株培养1 4 d 后，在茵落核心至1 2 处用直径8 m m 的打孔器取出3 个面积 相同的菌块，放入相对应编号的小烧杯中，加入l o m l 含0 5 鲫吐温的无菌水 中，在高速涡旋振荡器上充分振荡，配成孢子悬液，稀释到显微镜中每个视野 5 1 0 个孢子时，用滴管吸取孢子悬液滴一滴于血细胞计数板( 2 5 个中方格1 上， 加放盖玻片，在显微镜下直接计数。统计血细胞计数板计数室四角和中央五个 中格( 麸舳小格) 孢子数量，每个样品重复计数3 次，取其平均值。从血细胞计 数板上每个小方格( 1 4 ，0 0 0 ，0 0 0 m 1 ) 中的孢子数可进一步计算出3 个重复单位面 积产孢量的平均值，计算公式如下： 样品孢子数。f 塑全查整窒! i i 垦王墼。4 0 0 0 0 0 0 。悬浮液稀释倍数 驯 每啪z 的孢子含量：孢子删：! 塑堂曼垫季墼 第3 章菌株退化的生物学特征 记下结果，比较同一菌株不同代的产孢量。 数据处理和分析均采用d p s 数据处理软件和e x e c e l 软件。 3 2 2 结果与分析 菌株9 8 5 各代菌株的产孢量测定结果如图3 5 所示，产孢量随着代数的增加而 减少，第5 代除外。尤其是前3 代和后3 代比较，显示产孢量越来越少。 iziit- 唾 图3 5 菌株9 8 5 的产孢量测定 f i 9 3 5s p o r u l a t i o ny i e l d so f9 8 5 对菌株9 8 5 的样品孢子数和第锄2 孢子含量进行比较，得出表3 2 ， 表3 2 菌株9 8 5 的产孢量 t a b l e 3 2s p o r u l a t i o ny i e l d so f 9 8 5 注；同列中具有相同字母表示在o 0 5 水平上差异不显著( d m r t 法) 一。ij一扣卜蟹h：， ，。一i_舶一，唧。 第3 章菌株退化的生物学特征 从表3 2 可以看出，菌株9 8 5 的第1 代菌株的每锄2 孢子含量与其它菌株差异显 著为5 0 6 x 1 0 9 孢子e r a 2 。产孢最少的第4 代为1 7 0 x 1 0 9 孢子e m 2 ，极差达到了 3 3 6 x 1 0 9 孢子e m 2 。据每锄2 孢子含量比较，第1 代 第5 代 第3 代 第2 代 第7 代 第8 代 第9 代 第6 代 第4 代菌株。 菌株1 2 4 5 各代菌株的产孢量测定结果如图3 6 所示，得出随着传代进行，产 孢量也在减少。 茁栋1 2 牾t 藿品矗子蠢 1z4，t0， 憎 i 善- ；l - 量l 罨o ；o o lz，5t89 t t 图3 6 菌株1 2 4 5 的产孢测定 f i 9 3 6s p o r u l a t i o ny i e l d so f1 2 4 5 对菌株1 2 4 5 的样品孢子数和第锄2 孢子含量进行比较，得出表3 2 ， 表3 2 菌株1 2 4 5 的产孢量 t a b l e 3 2s p o r u l a t i o ny i e l d so f1 2 4 5 从表3 2 中得出，菌株1 2 4 5 的前4 代菌株每c m 2 孢子含量明显高于后几代，最 1 7 ，。舭o刖。 第3 章菌株退化的生物学特征 大的第4 代和最小的第9 代分别是1 2 6 1 0 9 孢子，c l i l 2 和6 o o 1 0 8 孢子a n 2 ，极差为 6 6 x 1 0 s 孢子a 1 1 2 。据每c m 2 孢子含量比较，第4 代 第1 代 第3 代 第2 代 第5 代 第8 代 第7 代 第9 代 第6 代菌株。 菌株m a 0 9 各代菌株的产孢量测定结果如图3 7 所示， ， 一 暑2 = ：z - 一1 = ：l 。 。点 。 il，t- 他 图3 7 菌株m a 0 9 的产孢测定 f i 9 3 7s p o r u l a t i o ny i e l d so fm a 0 9 从图3 7 可以看出随着传代的进行产孢越来越少，对菌株m a 0 9 的样品孢子数 和第c 1 1 1 2 孢子含量进行比较，得出表3 3 ， 表3 3 菌株m a 0 9 的产孢量 t a b l e 3 3s p o m l a t i o ny i e l d so f m a 0 9 第8 、9 4 弋的产孢量明显小于其它菌株，最大第3 代和最小第9 代的每锄2 孢子 含量分别是2 2 4 x 1 0 9 孢子c m 2 和5 9 9 x 1 0 s 孢子c m 2 ，极差是1 6 4 1 x 1 0 a 孢子c m 2 。据 每锄2 孢子含量比较，第3 代 第2 代 第5 代 第4 代 第1 代 第6 代 第7 代 第8 代 1 8 a t=2 1 o 岔曼摹睾_ 第3 章菌株退化的生物学特征 第9 代菌株。 3 3 菌株的毒力测定 虫生真菌是自然界控制害虫种群最大的一类病微生物，与环境有良好的相 容性，对人畜及作物无害，且害虫不易产生抗性【蛔。随着人们环保意识的增强， 昆虫病源微生物的开发和利用越来越受重视【4 ”。其中重要的一种昆虫病源微生 物绿僵菌，对多种害虫有防治效果，v e e n 曾记载过8 目4 2 科2 0 4 种寄主。菌株的 毒力是生产中选取菌种的重要依据，菌株对害虫的毒力是菌株是否退化的最直 观的指标闱。本实验对菌株9 8 5 和菌株m a 0 9 对椰心叶甲进行了毒力测定。 3 3 1 材料与方法 3 3 1 1 供试虫源 采于海南省文昌市，室内饲养多代后，选择健康的椰心叶甲4 龄幼虫，饲 养采用未展开椰子c o c o sn u c i f e r a 心叶。 3 3 1 2 供试菌株 菌株9 8 5 第1 代、第3 代、第6 代、第9 代、第1 2 代、第1 5 代 菌株m a 0 9 第1 代、第3 代、第6 代、第9 代、第1 2 代 3 3 1 3 实验方法 将椰子心叶剪成长约1 5 e r a ，每个剪成的叶片中饲养1 0 头幼虫，每个培养皿 中放2 0 头，也就是一个重复。培养皿中以棉花球浸水保湿，保持湿度在7 5 以 上。用浓度为0 5 9 l 吐温8 0 溶液的收集分生孢子，配成1 o x l 0 7 孢子m l 浓度， 用1 埘的微量注射器接种于幼虫，每虫接种o z u l ，换算成每头幼虫所接种的孢 子量为2 0 0 0 孢子虫。每菌株3 个重复，每重复2 0 头四龄幼虫，另设含0 5 9 l 吐温踟无菌水接种的对照组一个。连续观察1 5 d ，记录每天的幼虫死亡数和僵 虫数。根据处理每3 日的虫口死亡数，按下述公式算出累计死亡率和校正累计 死亡率 4 9 - 5 1 】： 累计死亡率c ，- 竺鑫墨瓣1 0 0 第3 章菌株退化的生物学特征 校正累计死亡率伤，- 竺里塑号芒豸嘉翥；窨凳铲x ，0 0 3 3 2 数据分析 根据菌株传代得到的菌株处理的1 5 d 死亡虫数统计计算出椰心叶甲感染绿 僵菌的死亡率，并进行差异显著性比较。 用时间剂量死亡率( 冯明光，1 9 9 8 b ：f e n gc t a l ，1 9 9 8 ；n o w i e r s l de t a l ， 1 9 9 6 ) 4 0 l 模型模拟获得的剂量效应参数和累计时间效应参数估计出时间的剂量 效应对数估计和剂量的时间效应估计( 以u h 表示) ，该方法使剂量效应和时间 效应统一于一个模型之中( f e n g & p o p r a w s k i ，1 9 9 9 ) 。 数据处理采用d p s 数据处理软件和e x e c e l 软件。 3 3 3 结果与分析 3 3 3 1 菌株9 8 5 的毒力测定结果 对菌株9 8 5 进行毒力测定得出表3 4 ， 表3 4 菌株9 8 5 的死亡率和僵虫率 t a b l e 3 4t h em o r t a l i t i e sa n di n f e c t i v i t yo f9 8 5 从表3 4 可以得出，菌株9 8 5 第6 代的死亡率最大7 5 5 6 ，第1 2 代最小3 0 0 0 ， 极差为4 5 5 6 。前4 代的死亡率都要高于第1 2 、1 5 代。各代菌株根据校正累计死 亡率比较，第6 代 第3 代= 第9 代 第1 代 第1 5 代 第1 2 代。 根据时间死亡率机值分析结果，得出各代菌株的毒力方程，计算出致死中 时，得到表3 5 。 第3 章菌株退化的生物学特征 表3 5 菌株9 8 5 的毒力方程和致死中时 t a b l e 3 5t h et r o p i c a le q u a t i o no f v i r u l e n c ea n dl t s 0o f 9 8 5 表3 5 中显示，对菌株进行机率值分析，各代菌株的相关系数都在9 5 以上， 第1 2 、1 5 代菌株l t 5 0 分别为1 9 3 9 6 4 9 d 和1 1 8 5 3 8 6 d ，与前几代相差比较大。致死 效果最好的第6 代菌株和最差的第1 5 代菌株极差达到6 0 5 0 4 1 d 。第1 代菌株毒力方 程的斜率为2 9 4 3 2 3 ，说明在致死中时后致死速率较快。 用d p s 数据处理系统计算机对数据进行拟合，获得时间剂量死亡率模型的 剂量效应参数( 卢) 和时间效应参数( r ) 的估计，继而估计出累计死亡率模型的时间 参数( t ) ，得到表3 6 。 表3 6 菌株9 8 5 生测数据的时间剂量死亡率模型模拟及参数估计 f i 9 3 6 p a r a m e t e r se s t i m a t e df o rt h ed o s e ( s ) a n dt i m e ) e f f e c t so f 9 8 5a g e i n s tb i o n g i s s i m a b a s e d0 1 1c o n d i t i o n a l m e o s e m o r t a l i t ym o d e l i n g 参教符号下标表示接种后的相应日序( 条件死亡串模型) 或景计日救( 景计死亡辜模型) 据h o s m e r - l c m e s h o w 检验，卡方检验统计量为8 4 1 5 5 ，小于x 2 0 0 5 = 1 5 5 1 ( 在 d r = 8 时，x 2 0 0 5 = 1 5 5 1 ) ，卡方值的显著水平p = o 3 9 3 9 7 大于o 0 5 故数据拟合是 第3 章菌株退化的生物学特征 成功的，否决所拟合模型异质性的假设，数据模拟成功。 特定时间效应参数r i 的估计值在第6 天达到最大值，与实验中观察结果一 致。 3 3 3 2 菌株m a 0 9 的毒力测定结果 对菌m a 0 9 进行毒力测定得出表3 7 。 表3 7 菌株m a 0 9 的死亡率和僵虫率 t a b l e 3 7 t h e m o r t a l i t i e sa n d i n f e c t i v i t y o f m a 0 9 从表3 7 中看出，菌株第1 、3 代的累计死亡率最大嬲8 9 ，第1 2 代最小6 5 5 6 ， 极差为2 3 3 3 。累计僵虫率也是第1 、3 代的累计死亡率最大8 8 8 9 ，第1 2 代最 小5 7 。7 8 。各代菌株根据校正累计死亡率比较，第1 代= 第3 代 第9 代 第6 代 第1 2 代。 根据时间死亡率机值分析结果，得出各代菌株m a 0 9 的毒力方程，计算出致 死中时，得到表3 8 。 表3 8 菌株m a 0 9 的毒力方程和致死中时 t a b l e 3 8t h et r o p i c a le q u a t i o no f v i r u l e n c ea n dl t s 0o f m a 0 9 第3 章菌株退化的生物学特征 机率值分析结果显示表3 8 ，各代菌株的相关系数都在9 5 以上，第1 代的l t 5 0 最小6 9 6 7 1 4 d ，第1 2 代的l t s 0 最大8 1 0 6 3 4 ，极差为1 1 3 9 2 d 。 利用时间剂量一死亡率模型模拟结果得表3 9 。 表3 9 菌株m a 0 9 生测数据的时间剞量死亡率模型模拟及参数估计 f i 9 3 9 p a r a m e t e r se s t i m a t e df o rt h ed o s e ( b ) a n dt i m e ( r j ) e f f e c t so fm a 0 9a g e i n s tb 1 0 n g i s s i m a b a s e 矗0 1 1c o n d i t i o n a lt i m e - d o s e m o r t a l i t ym o d e l i n g 参数符号下标表示接种后的相应日序( 条件死亡率模型) 或累计日教( 累计死亡翠模型) 据h o s m e r - l e m e s h o w 检验，卡方检验统计量为1 5 2 5 9 8 ，小于x 2 0 晒= 1 5 5 1 ( 在 d r = 8 时，x 2 0 肼= 1 5 5 1 ) ，卡方值的显著水平p = 0 0 5 4 2 9 大于0 0 5 故数据拟合是成 功的，否决所拟合模型异质性的假设，数据模拟成功 得出结果，所需的致死中时越来越大，与实际观察的结果一致，随着传代 进行毒力减弱。 第4 章菌株退化的分子生物学特征 第4 章菌株退化的分子生物学特性 4 1 各代菌株的酯酶同工酶比较研究 运用同工酶手段研究菌株退化已成为一项重要的手段。同工酶( i s o z y m e ) 是 具有相同或相似的催化功能而分子结构不同的一类酶。自从h u n t e r 和m a r k e r t 仓t 立了同工酶酶谱( z y m o g r a m ) 技术以来，同工酶的研究得到了很大的发展，酶谱 的变化已作为鉴定物种、研究分类与进化、遗传与变异的重要指标。菌株退化 现象的出现就意味着该菌株发生的遗传变异，其变异特征可在同工酶的酶谱中 反应出来。对酶谱的研究有助于我们找到退化过程中，酶变化的种类及强度。 本研究对各供试菌株不同代菌株之间的酯酶同工酶进行比较 s 3 - s 列。 4 1 1 材料 4 1 1 1 供试菌株 m a 0 9 、1 2 4 5 、9 8 5 、双型孢各菌株的第1 、3 、6 、9 、1 2 、1 5 代 4 1 1 2 菌丝体的培养 制备p p d a 培养基，倒入9 e r a 培养皿制成平板培养基，在培养基上铺灭菌的 玻璃纸，平衡1 天后，取各菌株新鲜孢子的孢子悬浮液0 3 1 i 辅平板，放置天1 后， 倒置于2 5 的无光照培养箱中培养，培养2 - 3 天，根据菌落生长情况，将长满全 皿而又未产孢的菌丝在无菌条件下取出，置于7 m l 的灭菌离心管中，冷冻干燥， - 2 0 保存备用。 4 1 2 实验方法 参考冯明光【5 6 】殷凤鸣【5 7 】胡景江酬等人的方法，采用垂直板型聚丙烯酰胺凝 胶电泳( v e r t i c a ls l a bp a g e ) 对各个菌株的第1 、3 、6 、9 、1 2 、1 5 代进行了酯酶同 工酶的比较研究。 第4 章菌株退化的分子生物学特征 仪器和试剂如下所示： 电泳仪：j y 3 0 0 0 + 型j y 6 0 0 0 + 北京君惠东方电泳仪设备有限公司 电泳槽：j y s c z 5 j y s c z 7 北京君惠东方电泳仪设备有限公司 离心机：c e n t r i f u g e5 8 0 4 r 德 亘e p p d o r f 移液枪：0 5 1 叩l 、5 5 毗l 、2 0 - 2 0 0 z l 、1 0 0 - 1 0 0 0 # l 、1 - 5 m l 德i $ 1 e p p e n d o r f 凝胶成像系统：u n i v e r s a lh o o di ib i o r a dl a b o m t o i s e s e g r a t e ( m i l i a n ) i t a n l y 凝胶系统：n 一亚甲基双丙烯酰胺( a e r y ) 、丙烯酰胺( b i s ) 、三、盐酸饵a ) 、 柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠( e d t a - n a ) 、四甲基乙二胺( t e m e d ) 、过硫酸铵 电泳系统：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘氨酸 染色系统：溴酚蓝、醋酸一1 萘酯、醋酸2 萘酯、固蓝b 盐、丙酮 4 1 3 实验步骤 ( 1 ) 酶液的提取 称取2 9 茵丝体，加t b e 提取液1 5 0 m l ( t r i s - h 3 8 0 4 - e d t a 各o 1 m o l l 等量混 合) ，2 0 交替冻融3 6h 。取出加少许石英砂研磨成浆，4 c - f 1 0 0 0 0r m i n 离一l , 1 5 m i l l ，取上清液备用。 ( 2 ) 凝胶制备 参看何忠效( 1 9 9 9 ) 【删选择适当的凝胶浓度制备凝胶，配方如下： 分离胶 用1 0 的0 1 2 8 m o l 1 t r i s - 柠檬酸( p h = 8 9 ) 分离胶系统制取1 0 m l 其配比为如下 所示： 3 0 a e r y 0 8 b i s 3 2 5 m l 0 1 2 8 m o l l t r i s 一柠檬酸p h = 8 9 6 1 m l 1 2 4 7 e d t a - n a0 4 m l 双蒸水00ml 2 5 第4 章菌株退化的分子生物学特征 1 过硫酸铵0 2 5 m l t e m e d 1 7 5 u l 浓缩胶 用4 的0 1 2 8 m o l t r i s 一柠檬酸( p h = 6 8 ) 系统制取1 0 m l 浓缩胶，配比如下： 3 0 a c r y - 0 8 b i s 1 3 m l o 1 2 8 m o l l t r i s 一柠檬酸p h = 8 9 1 3 m l 1 2 4 7 e d t a 小h0 2 m l 双蒸水 6 2 m l 1 过硫酸铵1 0 m l t e m e d1 0 “l ( 3 ) 电泳 正确连接好正、负电极，放入4 0 恒温冰箱中进行电泳。开始稳压1 0 0 1 5 0 v ， 半小时后加到2 0 0 2 5 0 v ，至电泳到离底部5 m m 处断电，取胶。 ( 4 ) 染色 参看何忠效闻一书。染色配方如下： 称取2 0 0 l m g 醋酸- 1 一萘酯和5 嘶g 醋酸2 萘酯用1 0 m l 丙酮溶解，再称取2 0 0 1 1 1 9 的固兰b 盐也用1 0 m l 丙酮溶解，溶解后一起倒a 2 0 0 m l 的0 1 m o l l 磷酸盐缓冲液 p h 6 二4 中。 4 1 4 数据处理 数据处理采用q u a n t i t yo n e 软件jd p s 数据处理系统、e x e c e l 、a u t o c a d 2 0 0 5 。 4 1 5 结果与分析 4 151 菌株9 8 5 的同工酶分析 第4 章菌株退化的分子生物学特征 对菌株9 8 5 的各代菌株取样进行电泳，比较它们之间的差异。结果如图4 1 ： 图4 1 菌株9 8 5 酯酶同工酶酶谱扫描图 e s t 4 1z y m o g r a m so fs e v e i is t r a i n9 8 5 墨玎l r 一景铲丐尸亏酽 图4 2 菌株9 8 5 酯酶同工酶酶谱模式图 从图4 1 可以看出，菌株9 8 5 酯酶同工酶的谱带较少，总共1 6 条带，尤其 是第1 代菌株只有1 条。酶带r f = 0 3 5 0 7 7 区间，根据r f 将图谱划分a ( r f = 0 3 5 ) 、 b ( r f - - 0 7 4 、0 7 7 ) 、二个区。a 区是e s t l 主要是由强带组成；b 区是弱带、极 弱带的集中区域。各代菌株的a