（物理电子学专业论文）白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究.pdf

iifbi=tf iijl 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密口。 学位论文作者签名：王免凯 指导教 沙，年莎月7 日 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 r e s e a r c ha n d d e s i g no fo p t i c a ls e n s i n gs y s t e mi n l e u k o c y t es u b c l a s si d e n t i f i c a t i o n 姓 江苏大学 2 0 1 1 年6 月 大学硕士学位论文 摘要 随着基础医学深入的研究，高科技在实验方法学上的应用，医学检验仪器获 得飞速发展并逐步在临床实验室中得到普及。在血液学检测方面，白细胞分类计 数是医学临床检验的一个重要项目，也是判断各种血液疾病和其他相关疾病的重 要依据。由于生物细胞在生命科学各领域的重要作用，许多学者在该领域做了大 量的研究。自光散射方法应用于生物细胞的研究以来，各种光学检测技术在生物 细胞成分和分类识别领域的探索一直是国内外研究的热点问题之一。通过研究不 同类型样机和比较各种临床检验方法，选择研究用光散射原理进行细胞分类计数， 然后利用像差原理和光学软件设计了两种多维光学传感系统。本文基于国内外的 专家和我们课题组在白细胞分类检测中的应用基础，对传统的检测方法进行了多 维检测方法的技术拓展。以白细胞为主要研究对象，根据实际血液细胞的大小和 形态特征，分析了不同条件下细胞光散射幅值分布特征和规律，为白细胞分类提 供理论基础。通过比较传统光散射式细胞分析仪的光路结构，针对系统在信噪比， 稳定性，精确度等方面出现的问题进行了改进与设计。最终，设计完成了两套切 实可行的光学系统方案，可应用于白细胞的精确识别科学技术领域。 本文共分五章：第一章为绪论，阐述了本研究课题的研究背景、发展现状及 本课题研究的内容和意义；第二章对目前细胞分析仪的细胞检测理论及方法进行 了分析比较；第三章介绍了光散射式细胞分析仪的构造并阐述了检测原理以及技 术要求；第四章详细介绍了白细胞亚类分析光信息传感器的结构及特点并重点说 明了新型光学传感系统的基本光路和主要构成；第五章结论与展望。 关键字：光学设计；分类识别；光散射；血细胞；多维传感 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 w i t ht h ed e e pr e a r c ho fp r e c l i n i c a lm e d i c i n ea n dt h ea p p l i c a t i o no fh i - t c c hi i l t h ef i e l do fe x p e r i m e n t a l m e t h o d s ，m e d i c a l d e t e c t i o ni n s t r u m e n t sw i n ss w i f t d e v e l o p m e n ta n dp o p u l a r i z e si nc l i n i c a ll a b sg r a d u a l l y i nt h ef i e l do fb l o o dt e s t i n g ，t h e c o u n ta n dr e c o g n i t i o no fw h i t eb l o o dc e l l sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nm o d e mc l i n i c a l p r a c t i c e a tt h es a m et i m e ，i t i st h ek e yf o u n d a t i o nf o rd i a g n o s i n gk i n d so fb l o o d d i s e a s e sa n do t h e rp e r t i n e n td i s e a s e s m a n yt h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a lr e s u l t sh a v e b e e np u b l i s h e dd u et oi t sg r e a te f f e c t so nl i f es c i e n c e s t h ee x p l o r a t i o no fv a r i o u s o p t i c a ld e t e c t i o nt e c h n o l o g i e so nt h ec o m p o n e n t sa n dc l a s s i f i c a t i o ni d e n t i f i c a t i o no ft h e b i o l o g i c a lc e l l sh a sb e e na ne x t e n s i v e l yi n v e s t i g a t e dt o p i cs i n c et h el i g h ts c a t t e r i n g m e t h o dh a sb e e na p p l i e dt ot h er e s e a r c ho nb i o l o g i c a lc e l l s t h r o u g hr e s e a r c h i n go n p r o t o t y p e so fd i f f e r e n tt y p e s ，a n dc o m p a r i n gv a r i o u sk i n d so fc l i n i c a lm e t h o d so f i n s p e c t i o n ，c h o o s i n gt oc a r r yo nt h ec e l ls o r t i n gb a s e do nl i g h ts c a t t e r i n gp r i n c i p l e t h e n u s i n ga b e r r a t i o nt h e o r i e sa n do p t i c a ld e s i g ns o f t w a r e ，t w om u l t i d i m e n s i o n a lo p t i c a l s e n s i n gs y s t e m sa r ed e s i g n e d i nt h i sp a p e r , ac o n v e n t i o n a ll i g h ts c a t t e r i n go p t i c a l s y s t e mi sr e f o r m e db a s e do nt h er e s e a r c hr e s u l t so fl e u k o c y t ec l a s s i f i c a t i o nm a d eb y d o m e s t i ca n df o r e i g ne x p e r t sa n do u rr e s e a r c hg r o u p c h o o s i n gt h el e u k o c y t ea st h e m a i nr e s e a r c ho b j e c t ，b a s e do nt h er e a ls i z ea n dm o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c so ft h eb l o o d c e l l s ，t h ep a p e ra n a l y z e sl i g h t - s c a t t e r i n gd i s t r i b u t i o no fc e l l si nd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，a s t h et h e o r e t i c a lb a s i so fl e u k o c y t ed i f f e r e n t i a l t h r o u g hc o m p a r i n gt r a d i t i o n a ls c a t t e r i n g o p t i c a ls y s t e m si nb l o o dc e l la n a l y z e r ，t h eo p t i c a ld e s i g np a r a m e t e r sa n ds t r u c t u r e sa r e i m p r o v e di ns n r ，s t a b i l i t ya n da c c u r a c y a tl a s t ，t w oo p t i c a ls y s t e m sf o rc o l l e c t i n g s c a t t e r i n gs i g n a la r ed e s i g n e d t h e yc a nb eu s e di ns c i e n t i f i cr e s e a r c ho fl e u k o c y t e i d e n t i f i c a t i o n t h i sa r t i c l ei sd i v i d e di n t of i v e c h a p t e r s ：c h a p t e ro n eh a si n t r o d u c e dt h e b a c k g r o u n da n dt h ed e v e l o p m e n ts t a t u so ft h ed e t e c t i o nt e c h n o l o g yo fb i o l o g i c a lc e l l a n dt h ec o n t e n ta n dt h ep r a c t i c a lv a l u eo ft h i sp r o j e c t ；c h a p t e rt w oh a sa n a l y z e da n d c o m p a r e dd i f f e r e n tl e u k o c y t ei d e n t i f i c a t i o nt h e o r i e sa n dd e t e c t i v em e t h o d s ；c h a p t e r t h r e eh a sg i v e nt h ec o m p o s i t i o na n de x p o u n d e dc l a s s i f i c a t i o np r i n c i p l ea n dt e c h n i c a l r e q u i r e m e n t sb ys c a t t e r i n gl i g h t ；c h a p t e rf o u rh a sg i v e nt h ef e a t u r e sa n dc o m p o n e n to f o p t i c a li n f o r m a t i o ns e n s o ra n de l a b o r a t e ds p e c i a l l yb a s i cs t r u c t u r eo fn o v e lo p t i c a l 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 s e n s i n gs y s t e m ；c h a p t e rf i v eh a sc o n c l u d e da b o v er e s e a r c h e sa n dp r e s e n t e ds o m eo t h e r q u e s t i o n sw h i c hn e e dt ob es o l v e di nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：o p t i c a ld e s i g n ；c l a s s i f i c a t i o ni d e n t i f i c a t i o n ；l i g h ts c a t t e r i n g ；b l o o dc e l l ； m u l t i d i m e n s i o n a ls e n s i n g 厂_ i i 【 目录 第一章绪论 1 1 1 2 1 3 第二章 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 第三章 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 第四章 1 国内外发展状况1 典型生物细胞检测技术3 1 2 1 荧光显微技术3 1 2 2 相位显微技术。5 1 2 3 流式细胞术7 研究的意义和主要内容9 各种血细胞分析仪检测方式比较一1 l 体积、电导、激光散射分析技术1 1 电阻抗、细胞化学和射频法1 2 激光散射和细胞化学染色法1 3 多角度偏振光散射技术1 4 本章小结1 5 光散射式细胞分析仪的结构和检测原理。1 6 细胞分析仪的结构与组成1 6 3 1 1 流动室与液流驱动系统1 6 3 1 2 光学系统。1 7 3 1 3 信号的采集、分析与分选系统1 7 血细胞的种类及特征1 8 3 2 1 白细胞1 8 3 2 2 红细胞与血小板2 0 细胞的散射理论2 1 细胞分析仪的检测参数，技术要求及分选原理2 3 3 4 1 散射光参数2 4 3 4 2 荧光参数。2 4 3 4 3 数据显示方式及分选原理2 5 3 4 4 技术要求2 7 本章小结2 7 新型细胞分析仪光学系统的设计2 9 4 1 传统光散射式细胞分析仪的光路结构2 9 4 2 白细胞亚类分析光信息传感器。3 0 v 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 4 3 4 4 4 5 第五章 4 2 1 光源的选取3 1 4 2 2 椭球反射面的应用。3 l 4 2 3 传感光路的结构及特征3 2 4 2 4 像质评价3 3 新型光学传感系统基本光路和主要构成3 4 4 3 1 激光器的应用3 5 4 3 2 光束分离器3 5 4 3 3 光阑3 6 4 3 4 光电探测器。3 6 4 3 5 激光光束整形系统3 7 4 3 6 前向散射光接收光路3 9 4 3 7 侧向散射光检测光路4 1 4 3 8 后向散射光检测系统4 1 分类技术分析4 6 本章小结4 8 参考文献 致谢 结论与展望 在学期间发表的文章 4 9 5 l 5 5 5 6 r1。_。_。_。_。_。 江茎垄堂堡 第一章 士学位论文 1 1 国内外发展状况 绪论 细胞是组成生物体的结构和功能的基本单元，是展现活的生命状态全部特征 的最小单位。细胞的特殊性体现了生物个体的特殊性。人体血液中的白细胞含量 和质量是人体健康状况的重要表征，白细胞分类计数是临床检验的重要内容。由 于血液中的白细胞各有其生理功能，在不同生理状态下，可引起不同类型的白细 胞发生数目和质量的变化。如白细胞增多症可以是感染的一种征兆。在血液病和 肿瘤的临床诊断治疗中，白细胞中淋巴细胞的生物活性物质可直接反应体内癌变 进展程度和机体的免疫状态。 血液自细胞的传统检验方式是通过人工分类计数完成的。显微镜检测需要提 取细胞，涂片，制备，在显微镜下得到细胞图像，对细胞进行静态检测。观测人 员靠目视进行分析检验，强度大、效率低，难以客观记录和定位定量分析。随着 激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、荧光化学技术等的迅速 发展和应用，各种新的检测技术不断出现。目前已制成的自动白细胞分类计数仪 器主要有两种类型。一类是原型认识型，其工作原理是模仿人“脑一眼”系统的 只能识别过程，运用计算机图像处理和模式识别技术，将从显微镜与摄像机得到 的数字化细胞图像进行自动处理和分类。其主要特点是运用图像处理分析技术抽 取细胞形态( 如中性粒细胞的核像变化) 、色彩、纹理等方面的多种特征信息并采 用模式识别技术进行细胞分类。另一类是基于流式细胞术的分析仪，主要是通过 连续流动的系统，以光电效应的方式检测单一细胞，报告血细胞中自细胞总数， 各类细胞的百分率和绝对值。 在原型认识型方面，上世纪9 0 年代起图像的数字化处理技术应用到细胞识别 上，使镜检的测量数据更加客观化。图像分割和特征提取的有效运用实现了不同 种类细胞的区分。在血液图像分割中，主要应用k a s s 1 】提出形变轮廓模型和b c u c h c r 的分水岭算法进行红细胞和白细胞分割。基于小波变换利用圆弧算法，实现了红 白细胞的识别和定量分析。c o m p a 印o l i l 2 】基于数学形态对图像中白细胞作局部形态 学处理，有效地分割出了白细胞的细胞质。荧光标记技术的出现，丰富了精密光 学显微镜的种类，如：多光子激光扫描显微技术( m p l s m ) 1 3 1 ，荧光共振能量转移 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 显微技术( f 唧【4 】，全内反射荧光显微技术m r f m ) 【5 1 等。1 9 5 7 年，m i n s k y 首次 阐明激光共聚焦扫描显微技术( l c s m ) 的基本原理，1 9 8 5 年w i i j a n e d t s 第一次成 功的用激光共聚焦扫描显微镜演示了荧光标记的生物材料的光学横断面。新的荧 光探针量子点作为重要的辅助工具，成功的应用于生物大分子的识别与检测，细 胞成像，生物活体标记等。目前，激光共聚焦扫描显微镜已成为活细胞结构和细 胞生理行为研究中重要的检测和分析工具，被称为细胞c t 。1 9 9 1 年，美国麻省理 工学院的h u a n g 等人在s c i e n c e 杂志首次提出光学相干层析技术( o c r ) 6 】后，一直 作为一个研究热点活跃在研究领域。光学相干层析检测被测样品不同深度的背向 散射信号，并通过扫描得到组织二维或三维深度结构图像。o c t 的核心结构是一 个迈克尔逊干涉仪，结合了共焦、弱相干、光外差及扫描层析成像技术的优点， 可实现实时、无损伤、活体检测，具有较高的探测灵敏度和分辨率。另一方面， 由于生物细胞具有光学穿透性的特征，因此由相位分布能够准确地反演出细胞形 体的三维形态。数字全息与显微技术结合用于生物细胞的微结构观察成为了一个 吸引人的研究方向。1 9 4 8 年d e n n i sg a b o r 提出了全息术，1 9 6 7 年j o h ng o o d m a n 数字化重建了全息图，1 9 9 4 年s c h n a r 和l u e p m e r 首次将c c d 与计算机连接进行 应用，后经过短短不到2 0 年的时间，数字相位全息技术和理论得到了飞速的发展， 产生了数字全息显微d h m ( d i g i t a lh o l o g r a p h i cm i c r o s c o p y ) l r l ，将数字全息与显微 技术结合用于生物细胞的微结构观察，具有精度高、速度快、可全场、实时在线 等优点，其研究发展速度极其迅速，1 0 多年便出现许多科学技术研究成果。如： 相位对比显微术( p c m ) f 8 l ；微分干涉对比显微( d i c ) 【9 】；傅里叶相位显微( f p m ) 【1 0 l ； 希尔伯特相位a 微( h p m ) 【1 1 】；衍射相位显微( d p m ) t 1 2 1 ；谐波相分散显微技术 ( p d m ) t 1 3 l 等等。尤其是德国b j 6 mk e m p e r 教授和英国g a b r i e lp o p e s c u 教授在近两 年分别拓展了数字相位全息显微技术，获得了细胞的瞬态3 d 显微图。美国g e o r g e r h a r r i s o n 光谱实验室主任、物理学教授m i c h a e lf e l d 博士于2 0 0 7 年应用数字相 位显微技术得到了目前最为翔实的反映细胞内部动态的3 d 图像，无需借助荧光标 记物或其它外加的造影剂，整个过程只需大约0 1 秒。并且数字相位显微技术还应 用于细胞动力学、细胞干重测定、细胞折射率测定、细胞膜振动的研究等。这些 成果进一步推进了细胞光学检测的理论和的技术迅速发展。 另外，在细胞检测与分析方面，流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) t 1 4 】具有检 2 江苏大学硕士学位论文 速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，在血液学、 疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等领域得到广泛的应用。f c m 的基本原理 基于2 0 世纪初由m i e 和d e b y e 所建立的m i e 散射理论1 1 5 】。a n d r e ie l u g o v t s o v ， g o r d e nv i d e e n 和b o h r e n 等人从理论和实验上对不同形体微粒的散射进行了研究 p 6 1 。a l l e nt 、m a t t h e wb a r t l e t t 等人对光散射方法进行了研列1 7 1 。分层鞘流原理的 应用和细胞分选方法的提出，使流式细胞检测技术逐渐完善。f c m 综合了光学、 电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和 技术，能以每秒上万个的速率对细胞悬液进行快速检验分析，通过对流动液体中 排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光信号，分析出其体 积、内部结构、d n a 、蛋白质、抗原等物理及化学特征。流式细胞术已经日臻完 善，成为分析细胞学中不可替代的重要工具。 总之，生物细胞检测技术涉及众多学科的理论与技术。这些细胞检测技术对 免疫学、遗传学等学科的研究和医学临床分析起到了极其重要的作用，是现代生 命科学发展的重要支柱。目前比较典型的生物细胞检测技术主要包括：荧光显微 技术、相位显微技术、流式细胞术等。 1 2 典型生物细胞检测技术 1 2 1 荧光显微技术 荧光显微技术依据光致发光的原理，利用一定波长的照射光激发显微镜下样 品中的荧光物质，使之发射荧光，呈现荧光图像。其主要特点是它的光源能提供 大量特定波长范围的激发光，使被观察的样品中的荧光物质获得必要强度的激发 光。 近1 0 年，随着非线性激光技术的发展，特别是飞秒激光器的发明，在激光共 聚焦显微镜【1 8 】( 如图1 1 ) 的基础上发展出多光子激光扫描显微镜( m p l s 峋。目前， 双光子扫描技术已经比较成熟，采用高功率的超短脉冲长波激光使荧光物质激发， 其中一个荧光分子吸收两个光子后，跃迁到第一激发态而发射荧光。因为只有在 焦点处很小空间内的标本才能获得足够的光子而发出荧光，所以后者比前者具有 更高的空间局域特点，将获得更加清晰的三维荧光图像。试验中采用能量较小的 长波，利用其穿透能力强且光毒性小的特点，活体观测时间将被延长。得益于这 3 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 种技术，通过原位置成像，我们可以进行完整器官或组织的分析1 1 9 1 。通过用- - + 片头骨取代盖玻片，这种系统已经被应用在肿瘤生长成像和a l z h e i m e r 的病理过程 成像。通过薄头骨的神经过程的成像也可以进行。 光 源 z 图1 1 共聚焦显微镜原理图 f i g 1 1p r i n c i p l eo fe o n f o e a lm i c r o s c o p y 分子间的相互作用是活细胞各种生命过程的基础，通过测量两元件的邻近距 离能够实现监控。在光学显微镜中，可以用荧光共振能量转移邮e ，r ) 显微技术做 到。为了研究细胞中蛋白质之间的相互作用，通常应用绿色荧光蛋白作为细胞蛋 白质的标记分子。如v o g ts 等将f r e t 与荧光寿命显微技术结合，实时跟踪细胞内 物质互相作用的动态变化过程，最终获得皮秒和纳米量级的空间和时间的分辨率。 d i e t r i c ht o m a s 2 0 把荧光能量共振转移技术应用于单分子检测与d n a 介导的电子 转移过程，并且也用于d n a 间的相互作用。 很多细胞内的生命过程发生在细胞特定的有限区域，如质膜。全内反射荧光 显微镜【2 1 】哪蛐可以对接近盖玻片区域的生命过程直接成像，光学系统如图1 2 所示。在临界角激发产生倏逝场，并在盖玻片下迅速衰减，从而限制激发深度大 约为1 0 0 n m 。该显微镜可以用来研究肌动蛋白的作用和观测细胞内吞作用的动态过 程，另外还可以和其他技术如宽视野成像或光致漂白结合起来。全内反射在单分 子成像中的应用最令人兴奋，比如病毒感染和生长因子受体信号的成像。因为全 内反射荧光显微镜只能激发临近界面的荧光探针分子，所以远离界面的分子便不 能获得足够的能量，就不会产生荧光辐射。同一样品应用全内反射荧光显微镜得 到的图像比普通荧光显微镜得到的图像具有更高的对比度，并且对于发光机理的 4 江苏大学硕士学位论文 为有利。 s p e e im c n 图1 2 全内反射成像系统 f i g 1 2t o t a l 血e m a lr e f l e c t i o nm i c r o s c o p ys y s t e m 1 2 2 相位显微技术 生物细胞相位显微是一种将显微技术和数字全息相结合，主要用于研究生物 细胞微结构的新技术。近年来，随着生物显微技术和计算机处理方法的不断发展， 越来越多的学者加入到该领域的研究，并且在理论和实验中，都取得了丰富的研 究成果。以g a b r i e lp o p e s c i l 【2 2 刎教授带领的光学成像实验室提出了很多可行的实验 方法，主要包括傅立叶相位显微( f p m ) 、希尔伯特相位显微( 印? m ) 、衍射相 位显微( d p m ) 等。 傅里叶相位显微技术是2 0 0 4 年由麻省理工学院生物医学研究中心提出并逐步 发展起来的。该技术把相移干涉术和相位对比显微术相结合，是一种拥有高灵敏 度的成像技术。傅里叶相位显微技术把给定场分解为空间变化场和平均场两部分， 在实验过程中，干涉场通过对显微镜输出的图像进行傅里叶变化得到，缩小了光 程，使该装置具有长期的稳定性和高的横向分辨率。此外，该方法可以提取细胞 的定量相位图像，在几秒到一个细胞生命周期内，实现亚纳米级的光程灵敏度。 g a b r i e lp o p e s c u 等利用该技术分解低相干光学图像，最终得到了红细胞在间接核分 裂期间的色码定量相位图，灵敏度达到了波长的1 5 0 0 0 ，稳定时间也达到了几个小 时。傅旱叶相位显微术可实现在自然状态下，精确测量生物细胞及其内部的结构。 希尔伯特相位显微( h p m ) 技术同样是由美国麻省理工学院生物医学研究中 心发展起来，作为对傅立叶相位显微技术的一种补充。图1 3 表示h p m 的基本光路， 这种技术把用复数分析信号的概念从时域中推广到了空间域中，并且只需一张空 5 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 间干涉图就能测出定量的相位图。凭借其单次拍摄的特性，识别时间只受记录设 备的限制，因此可以在毫秒级或更短的时间内准确定量纳米级的光程变化。 t a k a h i r oi k e d a 等利用h p m 技术还原了血涂片上红细胞，且分辨率达n 5 0 m 。2 0 0 8 年，g a b r i e lp o p e s c u 等利用h p m 技术观察溶血细胞内血红蛋白的流出过程，在毫秒 时间量级上达到亚细胞水平的空间灵敏度。 图1 3 希尔伯特相位显微光路 f i g 1 3e x p e r i m e n t a ls e t u po fh p m 衍射相位显微( d p m ) 技术结合了f p m 的共传输路径结构和h p m 的单次拍 摄特性，如图1 4 所示。该技术得到的定量相位图像达到了毫秒级采集率以及亚纳 米级的光程稳定性，并且其识别速度仅受到探测器的限制。它类似于m a c h z e n d e r 干涉仪，把零级衍射场与一级衍射场分别作为参考场和样品场，最终在c c d 上获 得干涉图。由于两光束通过相同的光学路径，因而大幅降低了纵向相位噪音。对 于生物生命现象的研究，衍射相位显微技术提供了一种新的技术支持，特别是在 活细胞的纳米级振动等方面。 c c d 6 图1 4 d p m 光路图 f i g 1 4e x p e r i m e n t a ls e t u po fd p m 士学位论文 细胞或亚类细胞结构进行快速测量的新型 分析技术和分选技术。1 9 3 4 年，m o l d a v e n 首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流 过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想。 1 9 5 3 年，c r o s l a n d t a y l o r l 捌根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究，设计 了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着 鞘液，细胞悬浮液和鞘液都制成层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术 基础。1 9 5 6 年，c o u l t e r 2 0 l 在多年研究的基础上利用c o u l t e r 效应生产了c o u l t e r 计数 器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，在细胞与悬浮的介质之间存在着导电 性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的 强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1 9 6 7 年，h o l m 2 7 等设计了 通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1 9 7 3 年， s t e h l 】p 【2 8 1 设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数， 又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代f c m 计数技术的主要历程。计 算机技术的发展，使现代的f c m 数据采集和分析技术有了进一步的提高。检测数 据的显示根据测量参数的不同有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式 表达，对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选 择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等。 f c m 凭借其测量速度快、检测参数多、既能完成细胞分析，又可以分选细胞等 特点，在微生物学等领域得到了很好地应用，已成为病原微生物研究过程中不可或 缺的工具，广泛应用于功能基因组及微生物基因组学、药物学、临床微生物学、抗 感染免疫学等领域，涉及快速测量细胞胞内抗原、表面抗原、d n a 分析、基因表达、 细胞增殖曲线、感染细胞周期分析以及感染细胞凋亡分析等众多方面1 2 9 - 3 1 1 。 近年来，综合性高科技的飞速发展，使基于f c m 的细胞分析仪也不断采用最 新的电子、光学、化学和计算机技术，从而不断满足临床工作对血细胞分析的要 求。尽管细胞分析仪的检测原理各不相同，但是都不断朝着高速度，高精度，集 成化，方便化的方向发展。 检测速度不断提高。许多仪器因为增加了自动进样系统，使得检测速度加快， 已经不局限于每小时只检测6 0 个样品，已经可以达到每小时8 0 1 0 0 个标本。在不 7 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 含网织细胞测定的情况下，b a y e r 的a d v i a l 2 0 可以每小时检澳t 1 2 0 个标本；而 s y s m e x 的k x 2 1 0 0 每小时可以达至j j l 5 0 个样品。这些仪器在自动成批进样的同时， 都能随时插入急诊检验的样品。 测量精度不断提高。为了实现更加准确的计数和检测的目的，血细胞分析与 测量的方法已经不单纯的局限于某一种方法，而是采用多种技术联合的检测方法。 改善光路系统可以使系统灵敏度得到一定的提高，同时增加检测参数可以有效地 提高细胞识别的准确性。光子计数系统的使用也可以提高仪器的灵敏度，可以完 成对一些微弱荧光信号的检测。增加试剂的种类，同样可以完成对特定样品的检 测工作。例如啪r 的a d v i a l 2 0 型分析仪需要多达1 1 种试剂，但这些试剂由于生 产技术含量较高，因此还没有其它的替代产品。 检测功能不断集成化。为了满足临床诊断和治疗的需求，仪器中新的检测项 目不断增加。血红蛋白浓度分布宽度、幼稚细胞提示、异常淋巴细胞提示等检测 项目和功能也不断的增加到一些厂家的仪器上，目前，有的分析仪甚至可以提供 4 0 - - - 5 0 种检测或计算项目。b a y e r 的a d v i a 2 1 2 0 型分析仪加入了脑脊液的细胞分 析功能，应用特殊的试剂和程序，对脑脊液中的白细胞、红细胞进行分类测定。 使用流程简单化。对于操作者来说，最大的优越性还应该体现在仪器的操作 方便性上。仪器在进样、荧光分析、数据处理、细胞分选等方面都基本上实现了 自动化操作。针对临床检测及患者的需求，对检测项目可作适当的组合。仪器可 以通过自动扫描条码，来鉴别样品的来源、需要检测的项目以及区分患者，最终 根据条码提供的信息将检测结果反馈到临床或病人的档案中。特别是自动进样系 统与真空采血管的应用，不但避免了实验的随机误差，加快了标本的处理速度， 而且杜绝了某些实验环节导致血行感染等情况的发生，使工作人员在检测过程中 得到了保护，同时让操作更加的标准化。 应用范围呈现多元化。血液学中的应用，各种血细胞的计数与分类，各种造 血细胞的研究和血液病学中的应用；肿瘤学中的应用，肿瘤细胞增殖动力学，d n a 异倍体细胞群体的研究；免疫学中的应用，各种免疫细胞的表型分析，杂交瘤细 胞的筛选与克隆，免疫活性细胞功能的测定；细胞遗传学中的应用，流式核型分 析特定的染色体分选纯化；细胞生物学中的应用，细胞动力学，细胞分化和细胞 凋亡的研究。 8 江苏大学硕士学位论文 总而言之，这些技术与方法已经为细胞检测提供了选择，研究者可以根据科 研需要选择不同观察手段，从而有利的促进了生命科学的进步与发展。但是，现 有的各种手段和实际应用的要求还有一定的差距，比如：1 各种显微技术代价昂 贵，染色会对细胞产生影响，且对样本要求较高，处理速度有限；2 相位显微技 术适宜于科学研究性的细胞检测，被检测细胞需要涂片，尚不能够应用于医学批 量检测中；3 流式细胞术存在分类识别正确率不高，试剂种类复杂等问题。 1 3 研究的意义和主要内容 传统的血液参数分析检查，完全用手工方法，检验人员劳动强度很大，检验 的准确性差。医疗电子技术的发展，取而代之的是先进科学技术和高度自动化的 医疗仪器，这使得检验医学在临床诊治疾病工作中发挥了更加重要的作用。因此， 血液参数测量技术备受重视，很多国际化的大企业纷纷投入大量资金进行测量技 术的研究与开发。各厂家设计生产的血细胞分析仪，其在白细胞分类技术上原理 各不相同，分析测定项目略有不同，且形式多样，结构复杂，试剂种类和成分也 比较复杂。不断改进和升级的新产品使得仪器在白细胞分类技术上更加成熟可靠， 而技术的提高也带来了仪器和各种试剂成本的增加。而在国内，血液参数测量技 术起步相对较晚，发展速度又受到诸多方面的制约。目前，只有少数企业，如深 圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，开发的具有自主知识产权的血细胞分析仪比 较成功，然而与国外先进技术相比还有一定的差距，主要是在稳定性和精确度方 面。 本文针对生物细胞原位检测和提高分类精度这一研究热点，以白细胞为主要 研究对象，基于国内外的专家【3 2 侧和我们的课题组【3 9 4 1 】在白细胞分类检测中的应 用基础，对传统的检测方法进行了多维检测方法的技术拓展。利用细胞光散射识 别方法，根据细胞各方向散射光的特点，设计了一种白细胞亚类分析多维光信息 传感器。该系统的独特之处在于把椭球反射面和非平均分光的b s 镜应用于其中。 最终设计完成了新型多维光学传感系统，用于检测白细胞五种不同条件的激光散 射，即前向大角度散射，前向小角度散射，侧向散射，侧向偏振动，以及后向散 射。系统的设计过程分为光束整形和散射光接收两个阶段。其中对系统的光路结 构和元件组成进行了优化设计，尤其在光学整形和多维接收的方法和高效方面进 9 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 行了比较系统的研究。系统的光束整形部分使光束在细胞室中央形成大小一定的 光斑，且没有伴随光斑。散射光检测部分，根据检测信号的差异，前向与侧向分 别采用不同结构的光路与元件，实现所需信号的有效检测；针对后向散射信号较 弱的特点，设计特殊的反射镜，并采用远心光路结构，完成后向散射光的高效接 收。设计过程中，充分考虑到光学元件校准时位置的准确性与调节步骤的简单化。 整个系统构成五维纯光散射信号的联合检测，尽量少的使用化学药剂，最大化体 现细胞原始状态，精确识别细胞种类。优化设计后的多维光学传感系统可应用于 白细胞的精确识别科学技术领域。 1 0 j 艟 _ 1 。_ _ 。 _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。r 。 兰茎垄 第二章各种 学硕士学位论文 血细胞分析仪检测方式比较 临床检验工作中，血细胞分析仪在血液检测方面具有非常重要的作用，其中 白细胞亚群的分类为其检测的主要目的。检测技术涉及了众多学科的理论和技术， 检测方法也各不相同。目前，白细胞分类采用的技术主要有：电阻抗法，化学试 剂法，荧光法，以及光散射法。随着科技的进步，发明了多种技术相结合的联合 检测法，使检测结果更为准确。其中比较有代表性的技术有以下几种：b e c k m a n c o u l t e r 公司的体积、电导、激光散射( v c s ) 分析技术【4 2 卅；s y s m e x 公司的电阻 抗、细胞化学和射频法1 4 5 4 7 1 ；b a y e r 公司的激光散射和细胞化学染色法1 4 8 , 4 9 1 ； a b b o r r 公司的多角度偏振光散射( 脚s s ) 技术【5 们2 1 。 2 1体积、电导、激光散射分析技术 b e c k m a n - - c o u l t e r 公司所生产的血细胞分析仪应用的是三种物理学检测方法同 时作用的经典技术，该方法的检测原理如图2 1 所示。细胞分析前，首先在血样标 本中加入红细胞溶血剂，使红细胞溶解，接着放入对红细胞溶血剂起中和作用的 稳定剂，维持白细胞表面、胞浆以及细胞的大小体积不变。最后应用鞘流技术将 细胞输送到细胞流动室中，同时被仪器的v c s 三种技术检测。 一 图2 1v c ：s 检测原理 r i g 2 1v c s d e t e c t i o np r i n c i p l e 唧l 哪e ) 表示体积测量法，应用的是经典的库尔特专利技术，采用低频电流 分析细胞体积的大小。在白细胞亚群的分类中，体积是一个重要的参数。淋巴细 1 1 白细胞亚类识别光学传感系统的设计与研究 胞和单核细胞的体积大小差异显著，该方法可有效地将它们区分开。c ( c o n d u c t i v i t