（环境科学专业论文）菜籽粕复合蛋白的提取及在发酵工业中的应用.pdf

济效益和社会效益，具有广阔的应用前景。 关键词：菜籽粕发酵脱毒六偏磷酸钠复合蛋白应用 h e x t r a c t i o no fc o m p o u n dp r o t e i nf o r m r a p e s e e dm e a l a n di t sa p p l i c a t i o ni nf e r m e n t a t i o n i n d u s t r y m a j o r ：e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e g r a d u a t es t u d e n t ：w a n gb i n s u p e r v i s o r ：p r o f h up e i a b s t r a c t ：b e i n go n e o fl a r g e s tr a p e s e e dp r o d u c e r si nt h ew o r l d 。c h i n ah a st h e b i g g e s tp l a n t i n ga r e aa n dt h eg r e a t e s tt o t a ly i e l do fr a p e s e e d 。r a p e s e e dm e a l a 1 1 1 m p o r t a n tp l a n tp r o t e i nr e s o u r c e ，i st h er e s i d u eo fr a p e s e e da f t e r d e g r e a s i n g h o w e v e r , s o m ec o m p o n e n t si nr a p e s e e dm e a la r ed e t r i m e n t a lt oa n i m a l s ，a l w a y s l i m i t i n gi t sa p p l i c a t i o na san a t u r a lp r o t e i nr e s o u r c e b a s e do nt h ep r e s e n tu t i l i t yo f r a p e s e e dm e a la th o m ea n da b r o a d ，a sw e l la s t h er a p i dd e v e l o p m e n to f f e r m e n t a t i o ni n d u s t r y , t h i sr e s e a r c hm a k e sc h e a p m p e s e e d m e a ld e t o x i f i c a t e dt h r uf e r m e n t a t i o n ，w h i c ht h e ni sd e v e l o p e di n t oah i g h - q u a l i t v r a wm a t e r i a l ( f e r m e n t a t i o n s y n e r g i s t ) a v a i l a b l ef o rf e r m e n t a t i o ni n d u s t r y t h i s a c h i e v e m e n ti sc a p a b l eo fi m p r o v i n gt h eu t i l i z a t i o na n da d d e dv a l u eo fr a p e s e e d m e a l ，a sw e l la st h eu t i l i z a t i o na n dc o n v e r s i o nr a t eo ft h e r a wm a t e r i a l si n f e r m e n t a t i o ni n d u s t r y , f o rt h e p u r p o s eo fr e a l i z i n gm a x i m u mu t i l i z a t i o na n d e f f i c i e n c yo fr a p e s e e dm e a la sak i n do fn a t u r a lr e s o u r c e s i nt h i s s t u d y , t h er a p e s e e dm e a lw a sf e r m e n t e du s i n gh o m e m a d ec o m p l e x m i c r o b i a li n o c u l a n t s t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a ts u c hf e n l l e n t a t i o n r e m o v e dm o s to fa n t i n u t r i t i o n a lc o m p o s i t i o n si nt h er a p e s e e d m e a l ，s u c ha sp h y t i c a c i d ，p h e n o l i cc o m p o u n d sa n di s o t h i o c y a n a t e s ( r r c ) i tw a sf o u n dt l l a t t l l e t r e a t m e n t f o l l o w i n g a l la e r o b i c a n a e r o b i cm o d el e d t ob e t t e rr e s u l t s i n t h e e x t r a c t i o n o f c o m p o u n d p r o t e i n f r o mt h e r a p e s e e d m e a l s o d i u m h e x a m e t a p h o s p h a t e ( s h m p ) w a su s e da st h ee x t r a c t i o na g e n t ，a n dt h e o p t i m a l e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：s h m pc o n c e n t r a t i o n ，1 ；p h ，7 ；t e m p e r a t u r e r 0 0 m 1 1 1 t e m p e r a t u r e ；s o l i d l i q u i dr a t i o ，1 ：18 t h eb a t c he x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e e x t r a c t e dc o m p o u n dp r o t e i nh a daf a v o r a b l ec o n t r i b u t i o nt ot h ef e r m e n t a t i o no f g i b b e r e l l i n ，i t a c o n i ca c i d ，a b a m e c t i na n dx a n t h a ng u m t h ei m p r o v e dp r o c e s so f p r o t e i n e x t r a c t i o n r e q u i r e d f e w e r s t e p s t h a nc o n v e n t i o n a l p r o c e s s e s t h e p h o s p h o r u s - c o n t a i n i n go r g a n i cw a s t e w a t e rp r o d u c e di ne x t r a c t i o np r o c e s sw a s r e u s e di nt h ed e t o x i f i c a t i o np r o c e s s ，w h i c hr e d u c e dt h e l o a d i n go fw a s t e w a t e r d i s c h a r g e t h er e s u l t e dr e s i d u e sf r o me x t r a c t i o nc a nb eu t i l i z e da saf e r t i l i z e r b y a ni m p r o v e de x t r a c t i o n a p p r o a c h ，t h i ss t u d ys u c c e s s f u l l ye x t r a c t e dc o m p o u n d p r o t e i nf r o mt h er a p e s e e dm e a lt h a th a db e e nd e t o x i f i e dt h r o u g hf e r m e n t a t i o n t h ec o m p o u n dp r o t e i nc a nb eu s e da sh i g h - q u a l i t yf e r m e n t a t i o ns y n e r g i s t ， w h i c he x t e n d st h ea p p l i c a t i o no fr a p e s e e dm e a l t h i sf i n d i n gg r e a t l yi n c r e a s e st h e u t i l i z a t i o no fr a p e s e e dm e a la n dm a x i m i z e si t sa d d i t i o n a lv a l u e ，a n da l s om a k e sa v a l u a b l ec o n t r i b u t i o nt ot h ei n d u s t r yo fm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n k e y w o r d s ： r a p e s e e d m e a l ，f e r m e n t a t i o n ，d e t o x i f i c a t i o n ，s o d i u m h e x a m e t a p h o s p h a t e ，c o m p o u n dp r o t e i n ，a p p l i c a t i o n i v 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师妇堡 剑丝蕉指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由 本人承担。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符 而引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学 拥有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提 交印刷版和电子版学位论文；可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库供检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论 文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供 阅读、浏览。 本人授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文 全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王斌导师签名：胡佩 签字日期：2 0 0 9 年0 4 月1 0 日签字日期2 0 0 9 年0 4 月1 0 日 1 引言 1 1 菜籽粕的国内外研究现状 油菜是我国四大油料作物( 油菜、大豆、花生、芝麻) 之一。我国的油 菜种植面积和总产量自1 9 8 5 年以来居世界首位。据2 0 0 5 年统计，1 9 8 0 年之前， 我国油菜种植面积维持在3 0 0 0 - - - 4 0 0 0 万亩，1 9 9 0 年增力d n 8 0 0 0 多万亩，2 0 0 0 年以来其种植面积已经超过1 1 亿亩，占世界油菜播种面积的2 6 ，而油菜籽 的年总生产量也由1 9 8 0 年的2 3 8 4 万吨增； 1 1 至u 2 0 0 0 年的1 1 0 0 万吨以上，占世界 油菜籽总产量的2 8 1 - 3 。油菜籽榨油后的饼粕，除含4 0 左右的蛋白质外， 还含有碳水化合物、残留脂肪、纤维素、矿物质和维生素等，是良好的蛋白 质资源。菜籽粕含丰富的赖氨酸和蛋氨酸1 4 j 】，尤其含硫氨基酸含量高于大豆 粕，必需氨基酸含量平衡【6 】。 菜籽粕本应是很好的畜禽饲料或食品添加剂。然而，油菜饼粕中还含有 一些对动物生长不利或有害的成分，如植酸、酚类及硫代葡萄糖甙类物质等。 植酸是公认的动物抗营养因子，它能与金属离子特别是f e 3 + 、z n 2 + 等金属离 子螯合，使金属离子不能被动物所吸收【7 1 。酚类化合物主要包括单宁、芥酸、 香草酸、丁香酸等，含量在2 4 左右。它们可以和蛋白质形成复合物， 从而改变蛋白质的物理化学特性和功能特性。硫甙类物质本身是无毒的，但 在贮藏、加工等过程中，在芥子酶或水解酶的作用下，分解成一系列的毒物 质，这些有毒物质大体上可以分为异硫氰酸酯( i t c ) 、硫氰酸酯( t c ) 、嚼 唑烷硫酮( o z t ) 和氰四类【8 l 。硫甙分解后产生的刺激性气味，使得油菜粕 适口性很差。因此，限制了菜籽粕这一蛋白质资源在饲料中的充分利用，造 成资源的极大浪费，其经济价值远远没有被开发出来 9 - 1 0 。 7 0 年代以来各国育成了一批无硫代葡萄糖甙的油菜品种，使菜籽粕的饲 用价值大大提高。自1 9 6 4 年加拿大育成第一个甘蓝型无芥酸品种和1 9 7 4 年育 成第一个双低( 油中含低芥酸，粕中含低硫代葡萄糖甙) 油菜品种t o u w e r 以 来，菜籽和菜油在国际油脂市场上占优势地位，更加促进了油菜生产的发展 【1 l - 1 3 】 0 目前国内外对菜籽粕的再利用大致分为四个方面： ( 1 ) 菜籽粕堆制发酵后直接用作农业有机饲料或肥料。将菜籽粕在地 面或竹筛上铺3 - - 5 厘米厚，上面覆盖透气的纺织袋，以利保温、保湿，2 5 以上发酵2 4 h 。待发酵料长满菌丝、结成块状、闻有香味表明发酵完成。翻 料，自然晾干。经发酵脱毒后，适c i 性好，消化率高，可代替豆粕，是很好 的蛋白饲料，也可用于农田作有机肥料使用。 ( 2 ) 菜籽粕化学方法脱毒后用于牲畜配合饲料。一般采用弱酸、弱碱、 盐等作为提取剂。如硫酸亚铁法其原理是使菜籽粕中硫甙的分解产物在处理 过程中与硫酸亚铁中游离出来的铁离子起络合作用，形成稳定的络合物，从 而不被动物吸收，达到去毒的目的。化学方法脱毒后的菜籽粕，虽然其中大 部分有毒物质被除去，但因其色泽较深、口感苦味，在饲料中的应用受到一 定的限制。 ( 3 ) 菜籽粕利用微生物发酵脱毒，同时其中的成分也转化为小分子蛋 白、寡肽、氨基酸、乳酸、维生素和u g f ( 未知生长因子) 等物剧1 4 】。一般 高活性生物制剂是由乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌及白地霉等菌株复合而成， 利用它发酵处理菜籽粕既可以脱去其中的有毒成分，又可以增加菜籽粕中的 有益成分。 ( 4 ) 菜籽粕作为重要的化工原料，可以提取浓缩蛋白、植酸、单宁、 芥酸等物质。欧洲许多国家都是把油菜籽粕当作重要的化工原料，可以从中 提取浓缩蛋白、植酸、单宁等物质，使菜籽粕的经济价值成倍增加。为菜籽 粕的应用提供更为宽广的空间。 前面三种方法虽然都能达到脱毒的目的，但脱毒后的菜籽粕还是停留在 饲料和肥料领域使用，其利用率及经济价值远远没有被开发出来。 1 2 发酵工业面临的问题 发酵工业是利用特定的微生物生产有用的产品，如氨基酸、有机酸、抗 生素、酶制剂和一些重要的化工原料的新兴产业。尤其在最近的二十年中， 发酵工业正以惊人的速度向前发展。 目前发酵工业面临的问题有：高产菌种性能不稳定、原料价格贵利用率 低、发酵周期长产率低等。发酵工业使用的原料主要是农副产品，如淀粉、 玉米、小麦、高粱、大豆等。发酵工业的共同点是经过微生物的作用，把含 2 有机物质的原料转化为各种特定的产品。发酵生产使用的菌种的好坏，是发 酵工业取得显著经济效益的关键。因此，筛选高产高效的菌株一直是发酵行 业研究的热点1 5 】。此外，能否在培养基中添加一些用量小、成本低、效果好， 能显著促进微生物生长和分泌代谢产物的物质( 发酵增效剂) ，来提高产量、 提高原料的利用率和转化率、缩短发酵周期，也是当前备受关注的研究领域。 1 3 本论文研究目的和主要内容 1 3 1 研究目的 我国是油菜种植大国，有着丰富的油菜粕资源。针对国内外利用油菜粕 的现状及迅速发展的发酵产业，将价值低廉的油菜粕经生物化学处理，研制 成一种能应用于发酵工业的优质原料( 发酵增效剂) 。既能提高油菜粕的利 用率和附加值，又能提高发酵工业中原料利用率和转化率、增加其经济效益， 实现菜籽粕资源利用最大化、效益化。 1 3 2 主要内容 ( 1 ) 筛选用于菜籽粕发酵脱毒的微生物菌株，培养后制成复合菌剂。 选取合适的发酵方式进行实验。 ( 2 ) 发酵脱毒后的菜籽粕中蛋白质、植酸、酚类及硫代葡萄糖甙类物 质的测定。 ( 3 ) 采用何种提取剂对发酵脱毒菜籽粕中的蛋白质进行分离纯化。 ( 4 ) 菜籽粕复合蛋白提取工艺的确定。 ( 5 ) 将制得的菜籽粕复合蛋白应用于微生物发酵领域，考察其是否对 发酵行业的生产起到促进作用。 1 4 本论文的主要研究成果及创新点 1 4 1 主要研究成果 ( 1 ) 将菜籽粕用自制的复合微生物菌剂发酵，能有效的去除菜籽粕中 大部分的抗营养成分，如植酸、酚类化合物、异硫氰酸酯( i t c ) 等。发酵 方式采用先好氧后厌氧的方式效果最佳。 ( 2 ) 在菜籽粕蛋白的提取方法上，采用s h m p 作为提取剂，通过实验 找到了最优的提取条件：s h m p 的浓度为1 ：浸提液酸度p h = 7 ；浸提温度 为常温；浸提固液比为1 ：1 8 。 ( 3 ) 改进的蛋白质提取工艺步骤少、可操作性强。提取过程产生的含 磷和有机废水，返回到发酵脱毒工序中使用，既满足了工艺要求，又解决了 废水的排放问题。提取过程产生的滤渣，仍可当作肥料直接使用。 ( 4 ) 制得的菜籽粕复合蛋白应用于发酵工业领域，既提高了油菜粕的 利用率和附加值，又提高了发酵工业中原料利用率和转化率。在阿维菌素、 泰乐菌素、透明质酸等大生产上应用，取得了显著的经济效益和社会效益。 1 4 2 创新点 ( 1 ) 对y e w - m i nt z e n g 提出的用六偏磷酸钠( s h m p ) 作蛋白质提 取剂的工艺进行了改进。缩短了工艺流程、可操作性增强。提取过程产生的 含磷和有机废水，返回到发酵脱毒工序中使用，既满足了工艺要求，又解决 了废水的排放问题。提取过程产生的滤渣，仍可当作肥料直接使用。 ( 2 ) 制得的复合蛋白在其应用领域的创新。因复合蛋白中残留有s h m p ， 用作食品和饲料添加剂使用是不适合的。将其作为微生物发酵增效剂使用，既提 高了复合蛋白的附加值，又使发酵生产企业取得了显著的经济效益。 4 2 菜籽粕发酵脱毒 为降解菜籽柏中的有害物质，并充分利用其有效成分，采用微生物发酵 脱毒是最理想的的方法之一。以往的研究大多采用单一的菌种进行发酵，虽 然取得一定的成效，但都存在脱毒不完全等缺剧m 】。本论文通过纳豆芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、光台细菌、放线菌等多种菌种的复合 作用，降解菜籽柏中有毒物质，同时产生更多的有效成分。各种微生物在生 长过程中产生的有用物质及其分泌物。成为各自或相互生长的基质和原料， 通过菌群问互利共栖或互惠同生，形成一个复杂而稳定的微生态系统，微生 物繁殖的过程将菜籽饼粕中的有害物质降解掉，从而达到脱毒的目的【 。19 1 。 2 1 菌株的选育 本论文筛选的菌株，大都具有分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、 脂肪酶等功能，在分解抗营养成分和有毒物质的同时，还能形成氨基酸、维 生素、复合蛋白、多糖等物质，这些物质又都是微生物发酵所必需的营养成 分。 2 1 1 纳豆芽孢杆菌 纳豆芽孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 是从纳豆中分离的一类微生物。在显微 镜下观察，纳豆芽孢杆菌通常为( 0 7 - v o 8 ) p m x ( 2 0 - 3 0 ) p x n ，革兰氏染色 阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢椭圆形或柱状，中生 或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。适宜的生长温度为 2 0 - - - , 4 5 ( 2 。孢子耐热性强。能分泌蛋白酶、淀粉酶、植酸酶和( 等f 外站j 。 ( 1 ) 菌株：纳豆芽孢杆菌( 广州华天农牧开发公司) ( 2 ) 培养基：大豆5 0 0 9 、纳豆菌5 9 ( 3 ) 使用器1 1 1 l ：高压锅、不锈钢盆、泡沫饭盒等浅容器、温度计等 ( 4 ) 培养方法： 蒸豆：将大豆充分洗净，加入3 倍量的水浸泡一夜后，倒掉水放进高压 锅内蒸到大豆用手捏碎的程度，大约4 5 r a i n 。 接种：将纳豆菌用5 0 r a l 热水( 温度最好3 8 - - - 4 2 ) 溶解后均匀地加 入到热大豆中( 温度最好4 0 4 5 0 ) ，迅速搅拌均匀，分装在泡沫饭盒里， 厚度大约2 c m ，上面盖上纱布，使其充分接触空气。 培养：在3 8 4 2 c 下培养1 4 3 6 h 。待大豆表面产生了白膜、并有粘丝 出现便结束培养。 洗脱：先配制好09 的生理盐水，加热到5 0 c 左右，将发酵好的大豆 倒入其中，均匀搅拌，直到大豆表面的白膜洗脱掉。收集滤液即得纳豆芽孢 杆菌菌液。计数：在葡萄糖琼脂平板中计数，菌体浓度在2 4 1 0 7 个n i l 。 鹰 图2 - 1 纳豆芽孢杆菌 ：1 2 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l e ) 是人类发现最早的细菌之一。具有典型 的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小( o8 1 2 ) g m ( 1 5 40 ) g m ：革兰 氏染色阳性：可产生荚膜；周生鞭毛：芽孢中生或近中生，小于或等于细胞 宽，呈椭圆至圆柱状：菌落粗糙，不透明，污白色或微带黄色；能液化明胶， 胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌 3 3 - 3 5 i 。 枯草芽孢杆菌也是当今工业酶制剂生产应用最广泛的菌种之一。枯草芽 孢杆菌所产的酶占整个酶制剂市场的5 0 以上。由于其产酶量高、种类多、 安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产酶制剂的菌种， 其发酵生产的酶制剂在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域 发挥着十分重要的作用。枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十 分丰富这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力 3 6 4 ；i 。 ( 1 ) 菌株：枯草芽孢杆菌( 本实验室保存) ( 2 ) 培养基：牛肉音蛋白胨琼脂培养基 ( 3 ) 培养方法：将配制好的培养基分装试管，包扎好后进行灭菌，l0 5 k g c m 2 ， 2 2 r a i n ，灭菌后摆斜面。在无菌室内将枯草芽孢杆菌接种到斜面上。3 7 培 养2 4 h 后，用配制好的o 9 生理盐水，分少量多次倒入已经长好枯草芽孢杆 菌的试管中，将斜面的菌苔洗脱下来。最后测定洗脱液中菌体浓度在2 x 1 0 7 个m l 。 目2 - 2 午五阜芽孢杆萄 213 光合细菌 光合细菌( p h o t o s ) n t h e t i c b a c t e r i a ，p s b ) 是一类能进行光合作用的细菌总 称，含有光台色素，利用太阳能进行光合作用的异养微生物，广泛分布于江 河、湖海、水田和土壤中。在嫌气性条件下，能够利用小分子有机物来合成 自身生长繁殖需要的各种养料，并以动植物体内的分泌物、有机物和有害气 体等为基质，合成糖类、氨基酸、维生索和生物活性物质等。其菌体本身含 有丰富的蛋白质、维生素、辅酶、抗病毒物质和生长促进因子。在不同的自 然环境下，光合细菌具有多种生理功能，如硫化物氧化、固碳、固氮和脱氨， 促进有害污染物( 如农药) 的转化等，在自然界物质转化和能量循环中起着 重要作用e 4 25 2 i 。 ( i ) 菌株：光合细菌( 本实验保存) ( 2 ) 培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基 ( 3 ) 培养方法：将配制好的培养基分装三角瓶，包扎好后进行灭菌， 10 5 k g c m = ，2 2 m i n ，灭菌后冷却到室温后，在无菌室内将原光合细菌接种到 三角瓶中。3 t c ，摇床培养2 4 h 。测定菌体浓度在2 1 0 7 个m l 左右 霞 图 2 14 乳酸菌 乳酸菌( l a c i d o p h i l i nj 指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰 氏染色阳性细菌的总称。它不形成芽孢，不运动或极少运动。主要有乳酸球 菌属、乳酸链球菌属、乳杆菌属等。乳酸菌通过生物拮抗竞争排斥，降低和提 高挥发性脂肪酸浓度，阻止和抑制致病菌的侵入和定植，维持正常生态平衡， 被称为“后抗生桑”。乳酸菌能够分解在常温下不易分解的木质素和纤维素，合 成多种氨基酸和维生桑，产生消化酶类，帮助食物消化和营养吸收，促进新陈 代谢。乳酸菌还能抑制农作物连作障碍产生的致病菌增值，如有害线虫等1 5 3 删。 ( 1 ) 菌株：乳酸菌s i c c1 5 1 8 ( 西南菌种站) ( 2 ) 培养基；牛肉膏蛋白胨液体培养基 ( 3 ) 培养方法：配制好的培养基分装到试管中，包扎灭菌，摆斜面。在无 菌室内，将原实验室保存的乳酸菌转接到，已制各好的斜面上，3 7 * ( 2 恒温 培养2 4 3 6 h 。等斜面长好后，使用0 9 的生理盐水洗脱斜面，洗脱液中苗 体浓度大约在12 x1 0 。个m l 。 硒 黼蠢翟 2 1 5 酵母菌 酵母菌( c a n d i d ag u i l l i e r m o n d i i ) 是一种单细胞微生物，其结构简单，属 于真菌类。酵母菌具有氧化和发酵两种代谢方式，能特征性地发酵一系列碳 水化合物。有机物经酵母菌发酵后，蛋白质、维生素、氨基酸生物活性大幅 度提高，所产生的单细胞蛋白是动物的有效养分。酵母菌菌体富含蛋白质、 维生素和多种酶类，可以加强消化吸收功能，提高动物对植酸磷的利用率。 另外，酵母菌还可毗为其他微生物( 如乳酸菌，放线菌) 增值所需要的基质 提供重要保障。由于酵母菌个体大，蛋白质含量高，易分离，杂食性强，易 培养，代谢产物多，综合利用广等特点，在现代工业中如食品、医疗保健、 饲料、酿酒、生物工程等行业中都有广泛的用途 6 1 。6 7 i 。 ( 1 ) 菌株：酵母菌( 市售的安琪儿酵母) ( 2 ) 培养基：使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行扩培。 马铃薯3 0 0 9 葡萄糖2 0 9 琼脂2 0 9 氯霉素0 l g 蒸馏水1 0 0 0 m l ( 3 ) 培养方法：将马铃薯去皮切块，加1 0 0 0 m l 蒸馏水，煮沸1 0 2 0 r a i n 。 用纱布过滤，补加蒸馏水至1 0 0 0 m l 。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化。另用 少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装，i 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。摆斜面。 在无菌室内，将市售的酵母菌先用无菌水溶解后转接到已制备好的斜面上， 2 8 ，恒温培养4 8 7 2 h 。等斜面长好后，使用o9 的生理盐水洗脱斜面， 洗脱液中茼体浓度大约在1 2 1 07 个m l 。 瀑晕焉 幽2 - 5 酵母西菌种 2 1 6 放线葚 放线菌( a c t i n o m y c e t a c e a e ) 是一类具有介于真菌和细菌之间特征的原核 生物。其菌落常呈辐射状生长，主要以孢子繁殖。革兰染色为阳性。放线菌 能产生种类繁多的抗生素、维生素和酶。同时对难分解的物质如纤维素、木 质素、甲壳素等的降解起重要作用，创造出其他有益微生物增殖的生态环境 6 8 。 ( 1 ) 菌株：细黄链霉菌5 4 0 6 ( 本实验室保存) ( 2 ) 培养基及培养方法： 大麦粉培养基( ) ：大麦粉5 ，黄豆饼粉2 ，泥土3 ，葡萄糖l ，琼脂2 ， p h = 7 5 。先将大麦粉、黄豆饼粉、泥土按比例加水煮沸3 0 r a i n ，中间应不断 补加蒸发的水分，过滤后加琼脂溶化，再拌入葡萄糖，调p h 后装管灭菌。 饼土培养基：菜籽柏1 份，细肥土1 0 份，搅拌均匀，控制含水量为2 5 及 口h 为7 5 左右。 斜面菌种培养：将原菌种接种到已灭菌的大麦粉培养基上，3 0 c 下培养 7 t 。 菌剂扩大培养：将活化的斜面菌种接种在已灭菌的装有饼土培养基的广 口瓶内，3 0 下培养7 天。 将已经培养好的放线菌，用09 的生理盐水洗脱斜面，最后洗脱液中菌 体孢子数量约在12 1 07 个l m l 。 凌釜泛 警彰： 。二警k 图2 - 6 细黄链霉菌5 4 0 6 2 2 复合菌剂的制备 先将油菜籽柏研磨成粉状，用1 0 的油菜籽粕粉和1 的葡萄糖为培养 基，配成i o 2 0 l 的悬溶液，在0 t m p a 压力下1 2 0 灭菌l o 3 0 m i n ，冷却 至常温后，将上述制得的6 个菌株的菌液按照1 ：l 的比例进行接入，总接种 量为5 1 0 ，在2 8 3 5 c 下培养4 0 5 0 h 。作为第一代复合苗液。 再用1 0 的油菜籽柏粉和1 的葡萄塘为培养基，配制成2 0 3 0 l 的悬 渡，在oi m p a 压力下1 2 0 灭菌l o 3 0 m m ，冷却至常温后，将上面做的第 一代复合菌液加入其中。在2 8 3 5 下培养4 0 5 0 h 。作为第二代复合菌液。 按照相同的培养条件，通过三级扩培。将菌种扩培至5 0 i o o l 或者更 多，扩培的目的：增加菌体量； 经过三代的驯化，复合菌液里的菌种已 经适应在菜籽粕中生存。 经三级扩培和驯化后的发酵菌液，其总菌数应达到4 x l o 个，m l 。制各 成功的复合菌剂外观为米黄色、有酸酸的酒味。 囤2 7 制备成功的复合菌剂 2 3 菜籽粕发酵脱毒 油菜籽榨油后的饼粕含粗蛋白4 0 左右，是一种优质的蛋白质资源，但 因其含有毒物质，且适口性差，使其应用受到限制。本文通过复合微生物菌 剂发酵去除这些有害物质，达到脱毒的目的。 2 3 1 菜籽粕中主要的抗营养成分 菜籽粕中含有的主要的抗营养成分有以下几类： ( 1 ) 植酸 植酸是具有6 个磷酸基的环状化合物，又称肌酵六膦酸。通常以钙，镁 和钾盐的形式存在于菜籽的蛋白体内，在整粒菜籽内的含量为2 0 - - 4 o ， 脱脂粕中含量为2 o 5 o ，蛋白浓缩物中的含量为5 0 - - 7 。5 ，分离蛋 白中的含量为1 0 - - - 9 8 。植酸和蛋白质可以形成不溶性的复合物。 去除植酸的方法也有很多，在p h3 5 和p h5 2 的条件下进行菜籽粕的渗 析可以出去8 5 和8 8 的植酸，而在p h9 0 时进行渗析，只有在e d t a 存在 下才能有效的脱除植酸。超滤也是一种很有效的方法，在相当高的盐浓度条 件下，植酸与蛋自质的相互作用被减弱，采取超滤可以完全去除植酸。 ( 2 ) 酚类物质 酚类化合物主要包括单宁，芥子酸，香草酸，丁香酸等，含量在2 - - - 4 左右。它们可以和蛋白质形成复合物，从而改变蛋白质的物理化学特性和 功能特性；由于蛋自质表面的一些基团和酚类化合物发生作用，使蛋白质表 面被复合层包围，最后导致蛋白质聚合沉淀。 ( 3 ) 硫甙及分解产物 硫甙本身无毒，但其水解产物异硫氰酸酯( 1 t c ) 、嗯唑烷硫铜( o z t ) 、 腈却具有毒性。 异硫氰酸酯有辛辣味，严重影响菜籽粕的适口性。高浓度的异硫氰酸酯 对动物体内黏膜具有强烈的刺激作用，长期或大量饲喂菜籽粕可引起胃肠 炎、肾炎及支气管炎，甚至肺水肿。异硫氰酸酯中的硫氰离子是与碘离子的 形状和大小相似的单价阴离子，在血液含量高时，可与碘离子竞争，浓缩到 甲状腺中，抑制甲状腺滤泡细胞浓集碘的能力，导致甲状腺肿大，使得动物 生长速度降低。异硫氰酸酯多数不溶于水，具有挥发性，因此采用加热的方 法可以将其去除。 嗯唑烷硫酮的主要毒害作用是阻碍甲状腺素的合成，引起脑垂体促甲状 腺素的分泌增加，导致甲状腺肿大，故被称为甲状腺肿因子或甲状腺肿素。 嚼唑烷硫酮还可使动物生长缓慢。 腈也是硫甙在低温、酸性条件下酶解时形成的有害物质。大多数腈进入 体内后通过代谢迅速释放出氰离子，因此对机体的毒性比异硫氰酸酯和嗯唑 烷硫铜大得多。腈的毒性作用和氰酸相似，可以引起细胞内窒息，但症状发 展较慢。腈可以抑制动物生长，引起动物的肝和肾肿大。 2 3 2 常见的脱毒方法 如何去除菜籽粕中的毒物和抗营养成分，一直受到国内外专家的重视。 主要有以下几种处理方法：、 ( 1 ) 物理方法 常用的物理方法是钝化芥子酶法，如果将芥子酶钝化就可以阻止硫甙的 分解。根据这一原理，在一定条件下将芥子酶钝化，8 的水分，1 0 0 加热 1 5 m i n 灭酶效果最好。但动物肠道内有些微生物可以分解硫甙，当动物摄食 含有硫甙的饲料时，硫甙就会在动物的消化道内分解生成有毒的物质，因此， 该方法并不能彻底去除硫甙及降解产物。 ( 2 ) 化学方法 化学脱毒法包括酸碱处理法、溶剂浸出法、，化学添加剂等方法。将菜籽 粕加热后用氨或者氨水处理脱毒；向菜籽粕中加入硫酸使硫甙降解产物分解 脱毒；用碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙处理菜籽粕也可以明显降低硫甙的含 量。采用溶剂浸出的方法也可以脱除大部分的异硫氰酸酯和嗯唑烷硫酮，所 用的溶剂主要有甲醇、乙醇、丙醇和水。 ( 3 ) 生物学方法 主要有酶水解法和微生物发酵法。酶催化有两种，一是外加硫甙酶及酶 的激活剂，使得硫甙加速分解；另一种是利用菜籽中的硫甙酶水解菜籽中的 硫甙即自动酶解法。水解完成后用汽提或溶剂浸出产生的硫甙降解产物，即 可达到脱毒的目的。微生物发酵法主要是利用微生物对菜籽粕进行发酵处 理，脱除菜籽粕中的硫甙，既可以将有毒的成分经微生物代谢掉，还可能产 生新的营养因子，处理方便并可大量操作，因此，微生物脱毒应用前景最好。 ( 4 ) 遗传学方法 遗传学方法是采用育种的方法培育出硫甙含量低的菜籽品种。目前各国 育成了一批无硫代葡萄糖甙的油菜品种，已经培育出的“双低”油菜品种( 油 中含低芥酸，粕中含低硫代葡萄糖甙) ，硫甙含量在o 3 以下。 2 3 3 复合菌剂发酵脱毒 在脱毒环节中，为了适宜菌剂中微生物的生长，需在菜籽粕中添加一些 辅料如玉米粉、麦麸、磷酸盐等。并需要用水调节一定的湿度，才能满足微 生物的最佳生长条件。将原料和复合菌剂按照一定比例混合均匀，采用适当 的发酵方式，使复合菌剂中的微生物都能较好的繁殖代谢，最终达到脱毒的 目的。 ( 1 ) 原料配比 菜籽饼粕1 0 0 0 k g ，玉米粉5 0 k g ，麦麸5 0 k g ，磷酸盐8 k g 。复合菌剂l o k g ， 水4 5 0 k g ， ( 2 ) 复合菌剂的活化 在使用复合菌剂前，应先将菌剂进行活化，取复合菌剂2 0 0 m l 兑水1 0 0 0 m l 混匀，放置2 - - - 6 h 后再使用。 ( 3 ) 操作 菜籽粕预先粉碎，和玉米粉、麦麸混合均匀后，将制成的活化菌剂与其 混合均匀。湿度以手捏成团不滴水、一触即散为宜。放在常温( 2 5 ) 、防 鼠的地方发酵5 天。 ( 4 ) 发酵方式及现象 为选择较好的发酵方式，做了四组不同方式的发酵： a ：完全好氧； b ：完全厌氧； c ：先好氧2 天后厌氧3 天； d ：先厌氧2 天后好氧3 天； 发酵过程中观察到以下现象： a ：完全好氧： 温度开始慢慢升高至5 0 c 左右，发酵5 天后，表面长满白霉，有较浓烈 的氨气释放。由于菌株的繁殖和代谢，发酵温度升高，使得原料的水分明显 减少。发酵结束后物料色浅变干。 1 4 b ：完全厌氧； 表面颜色、温度及水分基本没有什么变化，发酵5 天后，略带有酒气和 油粕的味道。 c ：先好氧2 天后厌氧3 天： 好氧的前2 天表面长满白霉，温度升车5 0 c 左右，有部分的氨味。厌氧 3 天后，略带有酒气和油柏的味，色较浅，水分适中。 d ：先厌氧2 天后好氧3 天： 厌氧的前2 天温度及颜色没有大的变化，好氧三天，温度开始卜升至4 0 左右，略带有酒气和油柏的味，色较浅。经四种发酵方式的菜耔粕见图2 - 8 。 围2 - g 经四种发酵方式的菜籽粕( 发酵5 天 2 4 发酵脱毒菜籽粕中抗营养成分的测定 菜籽粕通过发酵之后，其中的抗营养成分或有害成分是否发生变化，通 过下述方法进行了测定。 2 41 异硫氰酸酯( i t c ) 的测定 菜籽粕中的硫葡萄糖甙，在芥子酶的作用下生成相麻的异硫氰酸酯，用 二氯甲烷( 或氯仿) 提取后再用紫外分光光度计测定。 ( i ) 试剂和溶液 二氯甲烷或氯仿、丙酮、氨水、无水己醇( a r ) p h7 0 缓冲液：0 9 6 9 的柠檬酸溶于蒸馏水并稀释定容到5 0 m l 的容量瓶 中，取出3 5 m l 加入1 6 5 m l 的磷酸盐液( 5 6 8 9 的a r 级n a 2 h p 0 4 ) 配成2 0 0 m l ， 测试p h 调至7 0 。 芥子酶：磨2 5 9 黄芥籽，用7 5 m l 丙酮与1 7 5 m l 蒸馏水的混合液萃取 1 5 h ( 可用低磁性搅拌器) ，然后混浊液离心过滤或用真空泵抽滤，弃去滤渣， 加入3 3 0 m l7 0 丙酮溶液，收集粘性的芥子酶沉淀物于丙酮中冷冻储藏，有 效期约1 周。 ( 2 ) 主要仪器与设备 紫外分光光度计( 有1 0 m m 石英比色r m ) 、恒温水浴锅，实验振荡器( 振荡 频率1 0 0 次m i n ) 、可调定量加液器( 5 0 2 5 0 灿) 。 ( 3 ) 步骤 样品制备采集具有代表性的样品至少5 0 0 9 ，四分法缩分至5 0 9 ，再磨 细，使其8 0 能通过0 2 8 m m 筛。 测定步骤精确称取l g 经磨细的菜籽粕到玻璃瓶中。加入l m lp h = 7 0 的缓冲液，溶于大约5 0 r a g 芥子酶，准确加入2 5 m l 的二氯甲烷或氯仿及一 颗玻璃珠。紧闭盖子，于振荡器上振摇2 h 后静置直到瓶底的二氯甲烷或氯 仿层澄清。转移1 0 m l 二氯甲烷溶液到玻璃瓶中，该玻璃瓶预先准确加入6 m l 氨基乙醇( 1 份浓氨水，加4 倍的无水乙醇) ，盖上试管后置于5 0 c 恒温水浴 锅恒温2 h 。冷却，调整紫外分光光度计，吸收波长2 3 5 、2 4 5 、2 5 5 n m ，使用 1 0 m l 二氯甲烷混在6 m l 氨基乙醇的溶液作为空白。 ( 4 ) 计算 吸收光密度：o d 2 4 5 = o d 2 4 5 - - 0 5 ( o d 2 3 一- o d 2 s s ) 异硫氰酸酯( i t c ) 总量x ( p g g ) = o d 2 4 5 2 8 5 5 m 其中：x - 试样中异硫氰酸酯的含量，以每克样品中异硫氰化物质量( a g ) 表示；o d 2 4 5 一试样的吸收光密度：m 一试样的质量( g ) ：2 8 5 5 一转换因素， 吸光度为l 时，每升溶液中异硫氰酸酯质量为2 8 5 5 9 9 。 ( 5 ) 测定结果 表2 1 异硫氰酸酯含量变化 1 6 由表2 1 可以看出，采用好氧与厌氧结合的方式脱除异硫氰酸酯的效果 最好( c 、d ) 。尤其是c 处理( 先好氧2 天后厌氧3 天) 的发酵方式，异硫 氰酸酯由对照组的3 4 l 降到o 6 2 ，异硫氰酸酯降解率达到8 1 8 。 2 4 2 植酸的测定 植酸为有机磷的化合物，经浓硫酸和浓硝酸消解后转变为无机磷，通过 比色法测定出样品中总磷含量( p t ) ；直接测定样品中无机磷含量( p i ) ；总磷 与无机磷两者之差乘以系数3 5 5 ，即为植酸含量。 ( 1 ) 样品的处理 称取样品l - 2 9 ( 精密称定，眦g ) 移入5 0 m l 容量瓶中，用水定容至刻 度。摇匀后取5 m l 于凯氏烧瓶中，在电炉上加热至约0 5 m l 液体时，停止加 热。冷却后加入5 r n l 浓硫酸和0 5 m l 浓硝酸，盖上一个小漏斗，加热消解。 待棕色气体完全消失后，继续加热2 0 m i n ，冷却后移入1 0 0 m l 容量瓶中，用 水定容至刻度，得到1 0 0 m l 样品消煮液。 ( 2 ) 空白试验 在分解样品的同时做一个空白试验，即加入5 r n l 浓硫酸和0 5 m l 浓硝酸， 盖上_ 个小漏斗，加热消解。待棕色气体完全消失后，继续加热2 0 m i n ，冷 却后移入1 0 0 m l 容量瓶中，用水定容至刻度，得到1 0 0 m l 空白消煮液。 ( 3 ) 标准曲线的绘制 吸取磷标准溶液( 含p s o r t g 叫) 0 、2 、4 、6 、8 、t o m l ，分别置于5 0 r n l 容量瓶中，用水稀释至2 0 r n l 左右，加入l m l 空白消煮液、1 0 m l 显色剂，再 用水定容至刻度。摇匀，3 0 m i n 后，在4 2 5 n m 处测定其吸光度，