（生物化学与分子生物学专业论文）宇佐美曲霉木聚糖酶基因的改造及表达.pdf

摘要 摘要 宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u su s a m i i ) 木聚糖酶( x y n l i ) 是g 1 l 家族高比酶活木聚糖酶 的一种，来源于t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a 的木聚糖酶( t f x a ) 也属于g 1 l 家族的耐高温 木聚糖酶。本研究以x y n l i 为母体通过与t f x an 端替换拟提高x y n l i 的耐热性，研究 结果表明，n 端替换后的重组蛋白x y n i i a b 失去了木聚糖酶活性；比较x y n l i 、t f x a 和x y n l i a b 的三维结构，发现x y m i 和t f x a 空间位置第6 位氨基酸残基都是芳香族氨 基酸( t y r 或p h e ) ，但在x y n l i a b 中失去了这一空间位置。为考察第6 位芳香族氨基酸 对酶活性的影响，设计实验将x y n i i 第6 位酪氨酸定点突变为丝氨酸( s e r ) 。研究结果 发现，突变后的重组蛋白x y r l i i y 6 s 同样无木聚糖酶活性；进一步对已报道的2 0 种g l l 家族木聚糖酶进行三维建模，发现它们在上述的空间位置都是芳香族氨基酸。由此可见， x y n l i 无论是n 端替换或定点突变，由于均失去了空间位置上保守的t y r 或p h e ，从而 导致酶活性的丧失。 对宇佐美曲霉木聚糖酶x y n l i 进行s 1 7 9 c 定点突变。测定结果表明，突变酶 x y n l i s l 7 9 ( ：的最适反应温度由原酶的5 0 提高到5 2 ；5 0 热处理，半衰期由原酶的2 3 m i n 延长到7 0m i n ，热稳定性是原酶的3 倍；最适反应p h 无变化。 关键词：木聚糖酶；热稳定性；n 端替换；定点突变；三维结构 a b s t r a c t a b s t r a c t n l ex y l a n a s e ( x y n l i ) f r o ma s p e r g i 淞u s a m i i ，w h i c hw a so n eo ft h eh i g hs p e c i f i ca c t i v i t y x y l a n a s e b e l o n g e dt of a m i l y ( 3 1 1 硼忙x y l a n a s ef r o mt h e r m o m o n o s p o r a f u s c ab e l o n g i n gt o f a m i l yg 1 1 ，c o u l dt o l e r a t eh i g ht e m p e r a t u r e 1 1 1 eh y b r i dx y l a n a s ex y n l i a b w a sc o n s t r u c t e d b yt h es u b s t i t u t i o no ft h en - t e r m i n u ss e g m e n to ft h ea s p e r g i l l u su s a m i ix y l a n a s ex y n l lw i t h c o r r e s p o n d i n gr e g i o no ft h e r m o m o n o s p o r af u s c ax y l a n a s et 乱1 1 l er e s u l t st h a tt h eh y b r i d p r o t e i nl o s ei t sb i o a c t i v i t yw a sb e y o n dw a n t e d a n dt h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e so ft h e p r o t e i n sw e r em o d e l i n g e dt oc o m p a r et h e i rd i f f e r e n c e o n ek e yp o s i t i o n ( e g t h e s i x t h t y r o s i n ei nt h ex y n l i ) w a sf o u n d i nt h ef o l l o w i n go b s e r v a t i o n i nt h eh y b r i dp r o t e i nx y n l i a b ， t h ek e yp o s i t i o nv a n i s h e d t h e ny 6 sm u t a t i o nw a si n t r o d u c e di nx y n l ib ys i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s t h em u t a n tx y l a n a s e ( x y n i l v 6 s ) a l s ol o s ti t sb i o a c t i v i t y 1 1 1 et h r e e d i m e n s i o n a l m o d e l so fo t h e rx y l a n a s e sw h i c hb e l o n g e dt og 1 1f a m i l yw e r em o d e l i n g e db ye s y p r e ds e r v e r t o o a tt h es a m ec o n s e r v a t i v ep o s i t i o n ( e g t h es i x t ht y r o s i n ei nx y n l i ) ，t h e ya r ea l la r o m a t i c a m i n oa c i d s ( y f ) x y n l lw a sat y p eo fx y l a n a s ew h i c hh a dh i g h e rr e l a t i v ea c t i v i t y w i t hs 17 9 c d i r e c t e d m u t a g e n e s i s i t so p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a si m p r o v e df r o m5 0 t o5 2 a f t e r7 0 m i no fi n c u b a t i o na t5 0 i ts t i l lh a d5 1 3 r e s i d u a la c t i v i t y , w h i l et h er e s i d u a la c t i v i t yo ft h e n a t i v ex y l a n a s ew a s5 0 a f t e ro n l y2 3r a i na tt h es a m ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e t h e t h e r m o s t a b i l i t yw a se n h a n c e d3f o l d h o w e v e r , t h e r ew a sn oo b v i o u sc h a n g ei no p t i m u mp h k e y w o r d s ：x y l a n a s e ；t h e r m o s t a b i l i t y ；s u b s t i t u t i o n o ft h en t e r m i n u s ；s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s ；t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：孙舔 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 木聚糖酶概述 1 1 1 木聚糖概述 木聚糖( x y l a n ) 在植物性材料中与纤维素和木质素紧密地结合在一起，是植物半纤维 素的重要组分。木聚糖的侧链基团和木质素之间以化学键相互连接【1 2 1 ，再通过氢键并在 果胶等物质的协助下与纤维素相结合，形成致密的结构；这种致密结构对维持植物形态 具有重要作用p j 。木聚糖在自然界中广泛存在，含量丰富。据估计，地球上每年生产的 生物质总量约为1 5 x 1 0 1 1 吨，其中有2 0 - - 3 0 为木聚糖【4 l ，木聚糖理所当然的成为自然 界中仅次于纤维素的含量第二丰富的可再生生物资源【5 】。 木聚糖是一类分子结构复杂的不均一的聚糖。木聚糖主链的糖单位为吡哺型木糖， 以p 1 ，4 糖苷键连接成链状骨架，同时在主链上以仅糖苷键连接有l 阿拉伯糖、葡萄糖 醛酸等侧链基团和分枝。自然界中的木聚糖在主链聚合度、侧链基团的含量、种类等方 面存在着较大的多样性【6 】。木聚糖的结构特征见图1 1 。 o a c e n mx y l n i l 2 i l e r a s e i 图1 - 1 木聚糖结构特征及各木聚糖降解酶系水解位点 f i g 1 - 1x y l a ns t r u c t u r ea n dt h eh y d r o l y s i ss i t e so fx y l a n a s eg r o u p s 1 1 2 木聚糖酶概述 木聚糖酶是指可将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类酶的总称。木聚糖酶的存在 无论对生物体自身生命活动还是对自然界物质循环都具有重要意义。例如肠道微生物分 泌的木聚糖酶分解反刍动物瘤胃和肠道中的半纤维素类物质，既为反刍动物提供了营养 也降低了胃肠内食物粘度，更促进了其它营养成份的吸收【7 ，8 】；植物来源的木聚糖酶在种 江南大学硕士学位论文 子萌发等过程中起作用唧。 依据断开木聚糖中糖苷键位置的不同，可将木聚糖酶分为三个主要类别：第一类为 内切口1 ，4 木聚糖酶( e c3 218 ) ；第二类为外切口1 ，和k 聚糖酶( e c3 2 1 9 2 ) ；第三 类为b 木糖苷酶( e c3 2 1 3 7 ) 。此外，能够作用于术聚糖的还包括一些侧链糖苷水解 酶：主要有乙酰脂酶、阿拉伯呋哺糖苷酶、葡萄糖醛酸酶等。各种术聚糖酶及木聚糖侧 链水解酶的酶切位点见图1 - 1 。 根据氨基酸序列的同源性和三维结构特征，木聚糖酶分属于糖苷水解酶类的两大家 族，即f 1 0 家族和0 1 1 家族i 埘。f i o 家族木聚糖酶的分子结构一般比较复杂( 见图1 - 2 ) ； ( 3 1 1 家族的木聚糖酶结构上相对简单( 如图1 - 2 ) ，一般具有很强的底物专一性和很高 催化效率，除木聚糖外几乎不水解其它任何底物 l “。 图1 术聚糖酶的分子结构 来原于砌啪”佣洲啦岬如的t f x a ( o n l hb 来原于c e l l v i b r i o m p t t u s 的2 c n c _ a ( f i o ) f i g1 - 2 t h e t h x e e - d i m e r a i o n a ls i c u h e o f x y l a n a s e & t f x a f r o mt h e e m o m o n o s p o r a f u s e a ( g 1 1 ) ：h2 c n c _ a f r o m c e l l v l b r f o m i x m s ( f i io ) 1 2 木聚糖醇的应用 从上世纪6 0 年代开始，随着生物技术研究的不断发展，木聚糖酶的应用领域也在 不断扩大，除了传统上应用在食品、饲料、纺织、造纸、酿酒等工业领域外，现在术聚 糖酶在医药、环境和能源等工业上的应用也逐步得以开发，其应用前景十分看好。 1 2 i 未粜糖醇在食品，饲料酿酒工业上的应用 木聚糖酶在食品行业应用广泛，如：在小麦改良方面，添加木聚糖酶可以水解小麦 面粉中含有的微量阿拉伯木聚糖，提高面粉的质量；就制做面包而言，可以提高面包的 品质。中国饲料产量位居世界第二，但中国饲料资源并不丰富，木聚糖酶和其他半纤 维素酶合用，能有效改善农作物饲料的营养成分，有利于动物的消化吸收，提高各种类 型饲科的利用率。术聚糖酶能降解谷物细胞壁中的木聚糖，打破谷物细胞壁，有利加快 第一章绪论 淀粉酶降解淀粉；应用于酿酒工业，有助于增加发酵效率，提高酒精产率。 1 2 2 木聚糖酶在造纸、纺织工业上的应用 利用纤维素酶和木聚糖酶处理草浆，选择性地除掉半纤维素和细小纤维，可以显著 地改善草浆的滤水性、脆性和机械强度等性能。木聚糖酶还可用于二次纤维的酶法改性。 木聚糖酶在纺织工业中扮演脱胶的角色。将木聚糖酶与果胶酶复配使用于苎麻脱胶 过程，取得了良好的效果；酶法脱胶后残胶率小于1 ，同时减轻了对纤维的损伤，不 但改善了劳动条件，而且减少了环境污染。 1 3 木聚糖酶基因的克隆与表达现状 至今为止，国内外已报道的木聚糖酶基因有3 0 0 多种，其中已有1 0 0 多种基因被克 隆和表达在合适的宿主中，研究较多的是来源于细菌的木聚糖酶基因，对来源于真菌的 木聚糖酶的研究较少【1 4 , 1 5 1 。目前为止，国内外来源于嗜热菌耐热木聚糖酶基因克隆和表 达的实验性报道己屡见不鲜；如：来源于新阿波罗栖热袍菌的x y n a 和x y n b 基因都分别 被克隆和表达在大肠杆菌中，x y n a 和x y n b 最适反应温度分别为1 0 2 和9 0 。江正 强i l6 j 等将极端嗜热菌海栖热袍菌的第二个木聚糖酶基因即x y n b 基因在大肠杆菌中表 达，所得到的重组木聚糖酶x y n b 属于f 1 0 家族，含有单一功能区。其最适酶反应p h 为6 2 左右，最适应温度为9 0 。该酶1 0 0 下具有很宽的p h 稳定性，p h 6 5 8 5 内 都很都有催化作用。 来源于嗜热菌的耐热木聚糖酶基因在常温菌中的克隆和表达为耐热木聚糖酶的研 究和开发利用提供了技术前提。由于常温宿主菌产生的其它蛋白质耐热性相对较差，因 此用热变性的方法可迅速而简便地初步纯化在常温菌中表达的耐热木聚糖酶。但大多数 产耐热木聚糖酶基因的工程菌株产酶量低，商业化的价值不大。 近年来，通过构建合适的表达载体、采用适宜的表达宿主已成功地使某些木聚糖酶 基因获得了高效表达。目前，关于木聚糖酶基因的高效表达和胞外分泌的研究仍处于基 础研究阶段。巴斯德毕赤酵母p i c h i ap a s t o r i s 是目前最常用的外源基因真核高效表达系 统。2 0 0 2 年，陆健等【l7 】运用p c r 介导的定点突变对米曲霉来源的木聚糖酶在毕赤酵母 中的表达进行了研究，重组毕赤酵母发酵上清中的酶活力比亲本菌株提高了1 , 0 0 0 倍； 2 0 0 3 年，张红莲等【l8 】从橄榄绿链霉菌中克隆出木聚糖酶基因x y n a 并在毕赤酵母中进行 表达，在摇床培养水平上达到2 0 0m g l 发酵液的水平；2 0 0 5 年，李春华掣憎j 运用“鸟 枪法”克隆酸性木聚糖酶基因x y b 并将之转化进毕赤酵母g s l l 5 ，重组毕赤酵母诱导表 达3 6h ，所产粗酶液酶活力1 7 7u l 发酵液；2 0 0 7 年，欧阳嘉掣2 0 】克隆到里氏木霉r u t c 3 0 木聚糖酶x y ni i 的基因，并将其在毕赤酵母中进行表达，诱导表达6 0h ，酶活力达到 1 4 5 0u l 发酵液。 1 4 木聚糖酶热稳定性方面的研究 当前，木聚糖酶热稳定性方面的研究主要分为两个方向，一个方向集中在从极端微 生物中克隆木聚糖酶基因并将其在合适的宿主中进行表达；另一个方向则集中在分子改 江南大学硕士学位论文 造高比活但耐热性不好的木聚糖酶，希望以此得到酶活性高且耐热性好的突变酶。 大多数木聚糖酶的最适催化温度在5 0 6 0 之间。迄今为止，只发现2 0 余种细菌 和不足1 0 种真菌能产生耐热木聚糖酶。嗜热真菌比嗜热细菌产生的木聚糖酶耐热性差， 嗜热真菌中只有g l o e p h y l l u mt r a b e u m 产生的木聚糖酶的最适反应温度达到了8 0 ；而 来源于嗜热细菌的木聚糖酶的最适反应温度有的高达1 0 0 以上( 如栖热袍菌属) 。另外， 目前已发现的耐热木聚糖酶中只有来源于t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a 的木聚糖酶t f x a 属于 g l l 家族糖苷水解酶类，其它均属于f 1 0 糖苷水解酶家族【2 1 1 。 为了使木聚糖酶能更好的应用于生产，提高木聚糖酶热稳定性的研究就成了目前亟 待解决的难题。下面将从不同层次上分析影响木聚糖酶热稳定性的可能因素。 1 4 1 热稳定区、盐桥、二硫键 现已发现有2 2 种耐热木聚糖酶含有热稳定区( t s d ) ，其中4 种含c 末端t s d 的 木聚糖酶都为g l l 家族中温木聚糖酶【2 l 】。因而有人认为g 1 1 家族木聚糖酶本质上更耐 热，不像第f 1 0 家族木聚糖酶需要通过折叠方式而使它们相对容易进化为嗜热酶1 2 2 1 。 删除来源于t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u ms a e c h a r o l y t i c u m 的木聚糖酶x y n a 的n 端热稳定区， 其酶学活性不变，但其热稳定性大大降低；可能是影响了该酶酶促活性部位三级结构的 稳定【2 3 j 。将来源于t h e r m o t o g am a r i t i m e 的木聚糖酶x y n a 的氨基酸序列与来源于 t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u ms a c c h a r o l y t i c u m 的木聚糖酶x y n a 有相似的n 端序列，n 端删除 同样使酶的热稳定性下降。因此认为这种n 端的重复有利于蛋白抵抗热变性【2 4 1 。 蛋白质的酸性或碱性氨基酸残基会通过静电吸引形成盐桥，盐桥结构的形成对提高 蛋白质的热稳定性有一定的作用。t o m a z i c h 和k l i b a n o v 对耐热淀粉酶盐桥结构的分析 表明，盐桥结构可以使淀粉酶保持紧密和牢固的构象，并使淀粉酶具有很好的耐热性【2 5 】。 但由于蛋白分子中荷电氨基酸少，能靠近并形成盐桥者更少，因此盐桥在维持蛋白热稳 定性中发挥的作用是有限的【2 6 j 。 蛋白质分子中空间上邻近的两个半胱氨酸之间可形成二硫键，二硫键在提高酶的热 稳定性方面有一定的作用。w a k a r c h u k t 2 7 2 8 】等对来源于rc i r c u l a n s 的木聚糖酶中引入不 影响酶催化活性的二硫键，使其耐热性提高了1 5 。但多数的研究同时发现，在分子内 或分子间引入二硫键，热稳定性提高的同时酶的比活性下降了：推测是分子问或分子内 二硫键使酶分子形成二聚体或使酶的结构更加紧凑，从而提高了酶的热稳定性，但同时 也影响了酶的活性。 1 4 2 芳香族氨基酸、精氨酸、脯氨酸的含量 j a c q u e sg e o r i s l 2 9 等人对来源于s t r e p t o m y c e ss p 的嗜温木聚糖酶x y l l 引入t ll y 定点 突变，获得了y 1 l - y 1 6 芳香氨基酸的相互，突变酶的最适反应温度和t m 值都提高了9 c ， 5 7 c 时突变酶的热稳定性是野生型酶的6 倍；结构分析表明y 1 1 和y 1 6 与5 个其他残 基组成的连续的芳香氨基酸区是木聚糖的结合部位，t l l y 突变使底物在较高的温度下 与酶的结合力提高。对来源于s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i r i d i s 的木聚糖酶x y n b 的研究也取 得了类似的结果【3 0 】。 4 第一章绪论 o s s it u r u n e n 【3 1 】等人使用s w i s s - p d b v i e w e r 对来源于t r i c h o d e r m ar e s s e i 的g 11 家族 木聚糖酶x y n i i 的结构进行分析；并用p c r 的方法在x y n i i 中引入5 个a r g 点突变时， 酶在6 5 。c 的半衰期提高4 5 倍，最适p h 也有所提高；由此可知，在木聚糖酶表面引入 a r g ，对改善酶的热稳定性质有一定的作用，但关键在于突变位点的选择。 据统计，嗜冷、中温、耐热蛋白质中的脯氨酸含量依次升高；对来源于sl i v i d a n s 的g 11 家族木聚糖酶x i n a 引入1 4 9 p 突变，在大肠杆菌中进行表达，突变酶的热稳定 性提高到原来的5 倍；这表明特定位点的脯氨酸突变对提高木聚糖酶的热稳定性有重要 作用【3 2 1 。 1 4 3 一些保守的氨基酸 由氨基酸序列对比可知，r 1 5 6 是来源于s t r e p t o m y c e s 伽的木聚糖酶a 的保守氨基 酸，r 1 5 6 e 点突变酶的最适反应温度比原酶提了5 ；来源于c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 、 c r y p t o c o c c u sa l b i d u s 的木聚糖酶第1 5 6 位是精氨酸，来源于b a c i l l u ss p 、c a l d o c e l l u m s a c c h a r o l y t i c u m 的木聚糖酶第1 5 6 位是甘氨酸，而后者的最适反应温度比前者高i o * c 3 3 1 。 据此认为r 1 5 6 e a 突变可能会提高某些木聚糖酶的热稳定性。 l l o l e g g i o 【3 4 】等人总结了影响f 1 0 家族木聚糖酶热稳定性的几种因素：一、酶疏 水中心的包埋效应；二、酶n 端螺旋结构中存在脯氨酸；三、酶荷电氨基酸侧链与螺旋 偶极子的互作用；四、耐热酶一般都没有长的环状结构；五、氢键和盐桥对f i o 家族 木聚糖酶热稳定性的影响不大。以上结论对定点突变提高f 1 0 家族木聚糖酶热稳定性 有重要的参考价值。 1 5 木聚糖酶基因改造的方法 当前，国内外常用的提高木聚糖酶热稳定性的技术方法有定点突变【2 9 ，3 5 1 、定向进化 3 6 - 3 8 、d n a 改组【3 9 4 1 】等。 1 5 1 定点突变 定点突变技术可用来改变蛋白质编码基因的序列，运用于分析d n a 调控元件的功 能等领域，对改造酶的各种优良性能也非常重要。 g e o r i s 【2 9 】等人构建了来源于s t r e p t o m y c e ss p 的木聚糖酶x y l l 和来源于 t h e r m o m o n o s p o r af u s c a 的木聚糖酶t f x a 的分子模型；两种木聚糖酶同属于g l l 家族 糖苷水解酶类；三维结构对比后，他们将t f x a 中的嗜热结构用定点突变的方法引入 x y l l ，得到的突变酶比原酶最适反应温度提高了1 0 ，5 7 时突变酶的热稳定性比原酶 提高了6 倍。 1 5 2 定向进化 定向进化技术是改造酶分子的种有效策略；是在体外模拟自然进化进程，通过随 机突变和( 或) 体外重组的方法造成基因的多样性。易错p c r 是随机突变的主要手段之 一，它主要是通过改变反应条件或应用低保真的d n a 聚合酶在扩增目的基因时有意的 引入随机的错配碱基。d n a 改组是体外重组的主要手段之一，是在基因水平上进行的 江南大学硕士学位论文 有性重组，通过改变某一基因的核苷酸序列，创造出新基因，并赋予表达产物新功能或 特性；实际上，该技术是一种分子水平上的定向进化。c h e n 3 6 】等用易错p c r 技术对来 源于真菌n e o c a l l i m a s t i xp a t r i c i a r u m 的木聚糖酶进行定向进化研究，获得了比野生型蛋 白质耐碱性更强的木聚糖酶。 1 5 3d n a 改组 d n a 改组双叫d n as h u f f l i n g ，是将某一种或几种基因打散重排，在重排的过程中 会引入点突变；如果是同一个基因则会在基因中引入随机的点突变，如同是不同的几种 d n a 分子，则会产生杂交分子。运用d n as h u f f l i n g 技术的关键在于后期的筛选要有一 个强大的筛选系统。m i y a z a k ik t 4 2 】等人对来源于b a c i l l u ss u b t i l i s 的木聚糖酶基因运用 d n as h u f f l i n g 技术进行研究，获得了一株最适反应温度提高了1 0 ( 2 ，6 0 c 时热稳定性 提高了2 4 倍的突变酶。 1 6 课题意义 木聚糖酶是一种重要的工业用酶，可广泛应用于食品、饲料、医药、能源、造纸、 纺织、生物转化等行业；虽然有些天然的木聚糖酶可以直接应用到某些行业，但都存在 着不同的缺点，如酶活性不高，p h 稳定性不好，应用环境p h 与酶的最适p h 不相符合 及热稳定性不好等。如在饲料加工的后熟过程中，高温易造成酶损失，因此耐高温的酶 有更好的应用前景。目前普遍采用的固定化，包被等技术不能从根本上解决问题，因此 如何提高木聚糖酶的热稳定性是当前亟待解决的重大难题。在造纸工业中，酶还必须耐 受高温和高碱性环境。因此，利用基因工程的方法对酶基因进行改造是一种有效的手段。 1 7 立题依据 宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u su s a m i i ) 木聚糖酶( x y l l i i ) 是属于1 3 1l 家族的高比活木 聚糖酶，本实验室在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统都成功的表达了该酶；在毕赤酵母表 达系统中，2 5 0m l 三角瓶摇瓶发酵最高可达6 6 3i u m l 发酵液【4 3 1 ，这比国内已报道的在 该水平上表达的最高酶活要高出十几倍，这证明宇佐美曲霉木聚糖酶是一个值得研究， 很有应用潜力的酶。x y n l i 最适反应p h 值为4 2 ，最适反应温度为5 0 c ：x y n l i 酶学性 质的特点使它适合应用在饲料工业，但在饲料生产中有一个后熟过程，该过程需要短暂 高温，由于x y n i i 原酶的热稳定性不是很好，在生产中就要添更多的酶，这无疑增加了 生产成本；因此如何提高x y n i i 的热稳定性成为亟待解决的一个难题。 来源于t h e r m o m o n o s p o r af u s c a 的木聚糖酶t f x a ( g e n b a n k 收录号为：a u 0 1 2 4 2 ) 是现在已发现的耐热木聚糖中极少数属于g 1l 家族木聚糖酶中的一个，其它的耐热木 聚糖酶大多都属于f 1 0 家族。g e o r i s l 2 9 】等t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a 木聚糖酶t f 地的分子 模型，并通过定点突变证明了该酶的热稳定区主要在其氮末端。杨浩萌m 】等用t 姒的 n 端前三十一个氨基酸替换掉来源于s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i r i d i s 的木聚糖酶x y n b ( g e n b a n k 收录号为：a j 2 9 2 3 1 7 ) 的n 端前三十三个氨基酸，构建出重组木聚糖酶t b ； 融合木聚糖酶t b 的热稳定性与x y n b 相比提高了6 倍，同时保留了x y n b 的高比活； 6 第一章绪论 这证明t f x a 的n 端前3 1 个氨基酸在维持酶热稳定性方面确实有独到的作用。来源于 t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a 的耐高温木聚糖酶t 仅a 和来源于a s p e r g i l l u su s a m i i 高比活木聚 糖酶x y n l i ( g e n b a n k 收录号为：d q l1 4 4 8 5 ) 同属于g 1 1 家族糖苷水解酶，他们的木 聚糖酶催化区域具有较高的同源性；通过结构模拟发现x y n l i 的前3 3 个氨基酸的结构 与t f x a 的前4 0 个氨基酸的结构相似，因此以t f x a 前4 0 个氨基酸替换掉x y r d i 的前 3 3 个氨基酸，构建重组酶x y n l i a b ，x y n i i a b 可能会有较好的耐热性。 m i y a z a k ik 【4 2 】等人运用d n as h u f f l i n g 技术对来原于b a c i l l u ss u b t i l i s 的g ll 家族木 聚糖酶2 d c zb ( g e n b a n k 收录号为：9 0 1 0 9 2 0 1 ) 进行操作，筛先得到了一株最适反应 温度提高了1 0 c ，热稳定性提高二十倍突变酶，后续的研究发现热稳定性提高的原因是 该酶发生了q 7 h ，n 8 f 和s 1 7 9 c 突变。木聚糖酶2 d c zb 与x y n i i 的序列同源性达到 4 2 9 3 ；分别对它们进三维结构的模拟，发现它们的三维结构十分相似，进一步的分析 发现2 d c zb 热稳定性提高的原因很有可能是s 1 7 9 c 突变使酶在表达后的修饰过程中 形成了二聚体。对宇佐美曲霉木聚糖酶x y n l i 引入s 1 7 9 c 可能也会提高其热稳定性。 1 8 课题内容 木聚糖酶高产菌株宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u su s a m i i ) 所产木聚糖酶具有在酸性环境 中活性非常高，非常适合于木聚糖酶的工业化生产和在造纸、纺织、饲料中的应用等优 点。该菌株能产生两种木聚糖酶- x y n i 和x y n l i ，本实验室已经分离纯化出木聚糖酶 x y n l t 4 5 】和x y n i i | 4 6 1 ，并克隆了他们的编码基因1 4 6 4 引，其中的x y n l i 属于g 1l 家族，是 一种具有优良性质的高比活木聚糖酶，它的成熟肽已经在大肠杆菌【4 9 】和毕赤酵母【4 3 】中获 得了成功的表达。但该酶的热稳定性较差，限制了其在工业上的应用；本研究的目的旨 在提高宇佐美曲霉木聚糖酶x y n l i 的热稳定性，本论文的内容梗概下，具体内容会在后 面的各章节中详细表述。 一、n 端替换重组木聚糖酶x y n l i a b 在大肠杆菌中的表达； 二、y 6 s 突变酶在大肠杆菌中的表达； 三、s 1 7 9 c 突变酶在大肠杆菌中的表达及其与原酶x y n l i 酶学性质的比较； 四、s 1 7 9 c 突变酶在毕赤酵母中的表达，突变酶的分离纯化及其与原酶x y n l i 酶学性质 的比较。 7 江南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料 2 , 1 1 菌株与载体 本实验所用到的菌株与载体详见表2 - 1 。 表2 - 1 菌株与载体 t a b 2 - 1t h es t r a i na n dp l a s m i d 2 1 2 工具酶、试剂和引物 2 1 2 1 工具酶和试剂 t 4d n a 连接酶、t a qd n a 聚合酶、各种限制性内切酶、i p t g 等购自聊 - - j 、研究和生活中得到周晨妍师姐的热心帮助和大力支持，在此致以 由衷的感谢；特别感谢李东风、邓珊珊、盛金萍、张树飞、王谨、王超凯、徐春梅、徐 大庆等在实验和生活中给予的帮助；特别感谢张梅、唐存多、谭中标、张慧敏、高金湖 等师弟师妹在实验和生活中给予的帮助；同时也特别感谢庞建勋、吴会广、恽丽红、霍 惠芝、施晓燕，陈绵龙等给于的支持；真诚的祝愿我们的友谊长存! 最后我要感谢我的父亲、母亲，你们的支持和理解是我前进的最大动力；你们的鼓 励和关怀让我在崩溃的边缘找到了继续前行的力量。没有你们，我将一事无成! 真诚的 祝愿爸爸妈妈身体健康，万事如意! ! ! 孙军亭 2 0 0 9 年4 月 参考文献 参考文献 【1 】ams t e p h e n t h ep o l y s a c h a r i d e s m a c a d e m i cp r e s s 9 8 - 1 9 3 【2 】jp u l s ，kp o u t a n e n e n z y m es y s t e m sf o rl i g n o c e l l u l o s ed e g r a d a t i o n m e l s e r v i e ra p p l i e ds c i e n c e 1 5 卜1 6 6 【3 】hk o m i y a m a , ak a t o ，ha i m i ，e ta 1 c h e m i c a ls t r u c t u r eo fk e n a fx y l a n c a r b o h y d r a t ep o l y m e r s j 2 0 0 8 ，( 7 2 ) ：6 3 8 - 6 4 5 【4 】w h i s t l rrl ，r i c h a r d sel ，h e m i c e l l u l o s e s i n ：p i g m a nh o r t o nd ( e d s ) t h ec a r b o h y d r a t e s j a c a d e m i c p r e s s n e wy o r k , 19 7 0 ：4 4 7 - 4 6 9 【5 】张红莲，姚斌，范云六木聚糖酶的分子生物学及其应用【j 】生物技术通报，2 0 0 2 ，( 3 ) ：2 3 2 6 【6 】w o n gky s a d d e rjn m u l t i p l i c i t yo fm i c r o o r g a n i s m s ：f u n c t i o n sa n da p p l i c a t i o n s j m i c r o b i o l o g yr e v , 1 9 9 8 ，5 2 ：3 0 5 - 3 1 7 【7 】侯炳炎木聚糖酶及其应用【j 】a n i m a ls c i e n c e & v e t e r i n a r ym e d i c i n e ，2 0 0 2 ，1 9 ( 4 ) ：5 2 5 3 【8 】石军，陈安国木聚糖酶的应用研究进展【j 】中国饲料，2 0 0 2 ，4 ：1 0 1 2 【9 】c a s p e r sm 只l o kf s i n j o r g okm ，e ta 1 s y n t h e s i s ，p r o c e s s i n ga n de x p o r to fc y t o p l a s m i c e n d o - b e t a - 1 ，4 x y l a n a s ef r o mb a r l e ya l e u r o n ed u r i n gg e r m i n a t i o n j p l a n tj ，2 0 0 1 ，2 6 ( 2 ) ：1 9 1 - 2 0 4 【10 】h e n r i s s a tb ，b a i r o c ha n e wf a m i l i e si nt h ec l a s s i f i c a t i o no fg l y c o s y lh y d r o l a s e sb a s e do na m i n oa c i d s e q u e n c es i m i l a r i t i e s j b i o c h e mj ，19 9 3 ，2 9 3 ( 3 ) ：7 81 - 7 8 8 【l1 】j e f f i i e stw b i o c h e m i s t r ya n dg e n e t i c so fm i c r o b i a lx y l a n a s e s j c u r ro p i nb i o t e c h n o i o g y , 19 9 6 ， 7 ( 3 ) ：3 3 7 3 4 2 【12 】s u b r a m a n i y a ns ，p r e m ap b i o t e c h n o l o g yo fm i c r o b i a lx y l a n a s e s ：e n z y m o l o g y , m o l e c u l a rb i o l o g ya n d a p p l i c a t i o n j c r i tr e vb i o t e c h n o l ，2 0 0 2 ，2 2 ( 1 ) ：3 3 6 4 【1 3 】包怡红，李雪龙木聚糖酶在食品中的应用及其发展趋势食品与机械【j 】，2 0 0 6 ，2 2 ( 4 ) ：1 3 0 - - 1 3 3 【14 】k u l k a r n in ，s h e n d y ea ，r a om m o l e c u l a ra n db i o t e c h n o l o g i c a la s p e c t so fx y l a n a s e j f e m s m i c r o b i o ir e v , 1 9 9 9 ，2 3 ：4 11 - 4 5 6 【15 】s u b r a m a n i y a ns ，p r e m ap b i o t e c l m o l o g yo fm i c r o b i a lx y l a n a s e s ：e n z y m o l o g y , m o l e c u l a rb i o l o g y , a n d a p p l i c a t i o n j c r i tr e vb i o t e c l m o l ，2 0 0 2 ，2 2 ( 1 ) ：3 3 - 6 4 【16 】j i a n gzq ，k o b a y a s h ia ，a h s a nmm ，e ta i c h a r a c t e r i z a t i o no fat h e r m o s t a b l ef a m i l y10e n d o - x y l a n ( x y n a ) f r o mt h e r m o t o g am a r i t i m at h a tc l e a v e sp - n i t r o p h e n y l b e t a - d x y l o s i d e j b i o s c ib i o e n g , 2 0 01 ，9 2 ( 5 ) ：4 2 3 - 4 2 8 【1 7 】陆健，曹钰，陈坚运用定点突变提高重组木聚糖酶在毕赤酵母中的表达【j 】微生物学报， 2 0 0 2 ，4 2 ( 4 ) ：4 2 5 4 2 9 【1 8 】张红莲，姚斌，王亚茹链霉菌s t r e p t o m y c e so l i v a c e o v i r i d i s a l 木聚糖酶基因x y n a 在大肠杆菌及 毕赤酵母中的高效表达【j 】生物工程学报，2 0 0 3 ，1 9 ( 1 ) ：4 1 q 5 【1 9 】李春华，李翔，马立新酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达【j 】微生物学通 报，2 0 0 5 ，3 2 ( 6 ) ：8 9 - 9 5 【2 0 】王向明，欧阳嘉，严明里氏木霉木聚糖酶x y ni i 基因在毕赤酵母中的分泌表达阴林产化学 与工业，2 0 0 7 ，2 7 ( 5 ) ：8 2 - 8 7 【21 】w a l s hdj ，b e r g q u i s tpl e x p r e s s i o na n ds e c r e t i o no fat h e r m o s t a b l eb a c t e r i a lx y l a n a s ei n k l u y v e r o m y c e sl a c t i s j a p p le n v i r o nm i c r o b i o l ，1 9 9 7 ，6 3 ：3 2 9 7 3 3 0 0 【2 2 w a l s hdj ，g i b b smd ，b e r g q u i s tpl e x p r e s s i o na n ds e c r e t i o no fax y l a n a s ef r o mt h ee x t r e m e t h e r m