（微生物学专业论文）Δ6脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达及表达条件的探索.pdf

南肝人学坝h d f 宄生毕业( 学位) 论义中史摘要 中文摘要 y 亚麻酸( y l i n o l e n i ca ( ：id ，g l a ) 作为人体的一种必需脂肪酸，是具 有重要生理活性物质的前列腺素p g i 和p g l i 的前体，它在人体内由o 脂肪酸脱 氢酶( b f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ) 催化亚油酸转化而来。同时g i a 还具有抗革兰氏 阳性菌、阴性菌，抗i t l v 感染，抗肿瘤，抗多种炎症和抗粥性硬化等作用，具有 很高的药用价值。然而传统来源的g l a 由于受许多自然条件的限制，资源有限不 能满足市场需求，开发新的g l a 来源已备受关注。 毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统是近年来应用较多的种外源基因表达 系统，其中含有底物亚油酸以及丰富的油酸( 亚油酸的底物) ，是生产g l a 很有 潜力的表达系统。 为了在毕赤酵母中建立一种新的合成y 一亚麻酸的表达体系，本研究将高山被 孢霉和少根根霉6 一脂肪酸脱氢酶基因与毕赤胞内表达载体p p i c 35 k 连接， s a c l 线性化后电击法转化毕赤酵母g s l l 5 ，获得的转化子经p c r 鉴定目的基因已整合 到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达，通过脂肪酸气相色谱和气相色谱一质谱 ( g c m s ) 联用分析表明6 一脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达，y 可e 麻 酸含量分别占总脂肪酸的1 7 0 2 和62 。与此同时，转基因酵母细胞中还检测到 了c 1 6 ：2 6 , 9c 1 6 ：2 6 , 9c 1 6 ：2 6 ，- 、c 1 8 ：4 8 1 4 1 7 0 t a 的合成，这说明了6 脂肪酸脱氢酶在毕赤酵母中的催化功能没有链长特异性，而只有键位特异性。但 从脂肪酸的合成量来说，矿脂肪酸脱氢酶偏好于亚油酸。 对少根根霉6 脂肪酸脱氢酶基因转译起始密码子进行改造，提高了基因在毕 赤酵母巾的表达量。y 一亚麻酸含量从原来的6 2 提高到1 0 4 。以高山被孢霉 。脂肪酸脱氢酶基因为代表进行转基因毕赤酵母最佳表达条件的探索。将不同宿主 的转基因毕赤酵母分别在不同甲醇浓度、不同诱导温度、不同诱导时间、不同通 气量、甲醇一甘油混合诱导等条件下培养。结果表明在以毕赤酵母g s l l 5 为表达宿 主，终浓度0 5 的甲醇为诱导物，诱导温度2 0 。c ，诱导时间7 2 小时，高通气量的 条件下，驴脂肪酸脱氢酶的活性最高，y 一亚麻酸在总脂肪酸中含量达到1 7 0 7 。 本研究是国内外首次将6 脂肪酸脱氢酶基因转化入毕赤酵母表达系统进行 研究的报道。 关键词：a6 胡目肪酸脱氢酶，毕赤酵母，基因表达，转译起始密码子，y 亚麻 酸，高山被孢霉，少根根霉 塑翌尘兰塑! 塑塾兰兰些! 堂些! 堡兰 墨兰塑茎 a b s t r a c t y l i n o l e n i ca c i d ( g l a ，c18 ：3a 6 ，9 1 2 ) ，a ne s s e n t i a lp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ， p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nh o r m o n er e g u l a t i o na n df a t t ya c i dm e t a b o l i z a t i o n ao f a t t y a c i dd e s a t u r a s e ( d 6 d ) i st h er a t e l i m i t i n ge n z y m eo ft h ed e s a t u r a t i o no fl i n o l e i ca c i d ( c 18 ：2 “1 i nt h ep r o d u c t i o no fy l i n o l e n i ca c i dad e f i c i e n c yo fg l am a yh a v e o c c u r r e dw h e nao f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea c t i v i t yd e c r e a s e si n a g i n g ，s t r e s s ，d i a b e t e s ， e c z e m a ，a n ds o m ei n f e c t i o n s p i c h i ap a s t o r i sh a sb e e nd e v e l o p e di n t oah i g h l ys u c c e s s f u le x p r e s s i o ns y s t e mf o r t h ee f f i c i e n t p r o d u c t i o n o fav a r i e t yo fh e t e r o l o g o u s p r o t e i n s b e c a u s e i tc o n t a i n s p l e n t i f u l o l e i ca c i da n dl a ，p i c h i ap a s t o r i si sao p t i m a le x p r e s s i o ns y s t e mf o rt h e p r o d u c t i o no f g l aa n df u n c t i o n a la n a l y s i so fa 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e t oe s t a b l i s han e w e x p r e s s i o ns y s t e mf o r o f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ei np i c h i a p a s t o r i s ，w h i c hi s a ni n c r e a s i n g l yp o p u l a rh e t e r o l o g o u sg e n ee x p r e s s i o ns y s t e m ，t h e g e n e se n c o d i n g o f a t t y a c i dd e s a t u r a s ef r o mm o r t i e r a l l a a l p i n e a n d r h i z o p u s a r r h i z u sw e r ei s o l a t e db yp c r a n a p l i l i c a t i o n t h ep c rp r o d u c tw a st h e nd i g e s t e db y e c o r l n o t i ，b a m h l n o t ir e s p e c t i v e l ya n ds u b c l o n e di n t ot h ei n t r a c e l l u l a re x p r e s s i o n v e c t o r p p i c 3 5 k t o g e n e r a t e t h er e c o m b i n a n tv e c t o r s p p i c 3 5 k - m a d r a d 6 t h e r e s u l t i n gv e c t o r sw e r el i n e a r i z e db y s a c ia n de l e c t r o p o r a t e di n t op p a s t o r i sg s 115 ( h i s 一) h o s tc e l l s t oi d e n t i f yt h ed 6 d c o n s t r u c t st h a tw e r e p r o d u c e d ，c h r o m o s o m a ld n a o ft h e t r a n s f o r m a n t sw e r ep r e p a r e da n du s e da st e m p l a t ef o rp c rw i t ht h ep r i m e r5 a o x a n d3 a o x t h ep c r p r o d u c to fm u t l r e c o m b i n a n t sw a ss h o w na sab a n do f1 6 k bo f d 6 dg e n ea n dt h e p r o d u c t o f2 2 k bo fa o x i g e n e ，w h i l et h ep r o d u c to fm u t 5 t r a n s f o r m a n t so n l yw a ss h o w na sab a n do f1 6 k bo ft h ed 6 d g e n e t of u r t h e rc o n f i r m t h et r a n s f o r m a n t sc o n t a i n i n gaf u n c t i o n a ld 6 d g e n e ，t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e l e c t e d a n di n d u c e d b ym e t h a n o lf o re x p r e s s i o n t h o s ei n d u c e dc u l t u r e sw e r et a k e nf o r a n a l y s e so f t h ei n t r a c e l l u l a rf a t t ya c i dc o m p o s i t i o n b yg c t h e r e s u l t a n tc h r o m a t o g r a m s o ff a t t ya c i d m e t h y le s t e r ss h o w e dt h a tan o v e lp e a kw a sd e t e c t e d w h i c hw a sn o t a p p a r e n ti nt h ec a s eo f c o n t r 0 1 c o m p a r i s o n so f t h er e t e n t i o nt i m e so ft h en e w l yy i e l d e d p e a k sw i t ht h o s eo fa u t h e n t i cs t a n d a r d sh a v ea n t i c i p a t e dt h a tt h ef a t t ya c i di sg l a a n d t h i sp r o s p e c t sw a s p o s i t i v e l ys u p p o r t e db yd e f i n i t i v ea s s i g n m e n t so ft h ec o m p o u n d sb y g c m s a n a l y s e s y l i n o l e n i c a c i dr e a c h e d1 7 0 7 o ft h et o t a l f a t t y a c i di n g s 3 5 k m a 6a n d62 i ng s 35 k r a d 6 a n d f a t t ya c i da n a l y s i so ft h er e c o m b i n a n t y e a s t s a l s os h o w e dt h a tt h e c o d i n gp r o d u c t si n t r o d u c e d an e wd o u b l eb o n di n t o a p p r o p r i a t ef a t t ya c i ds u b s t r a t e si n c l u d i n gc 1 6 ：1 9 ，c 1 7 ：1 9 ，c 1 8 ：1 9 ，a l aa t a 6 南开人学坝h d 究生毕业( 学位) 论文 挺义摘要 p o s i t i o nw i t h o u tc h a i nl e n g t hs p e c i f i c i t yo ff a t t ya c i d s ，b u th a ds u b s t r a t ep r e f e r e n c ef o r i a b e c a u s et h el o we x p r e s s i o no f a 。一f a t t ya c i df r o mr h i z o p u sa r r h i z si np i c h i d p a s t o r i ，w em o d i f i e dt h es e q u e n c ef l a n k i n ga u gc o d o nt oi n c r e a s et h ee x p r e s s i o n l e v e la c c o r d i n gt ot h ek o z a ks e q u e n c et h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fg l a w a s i n c r e a s e df r o m6 2 t o1o4 a f t e rt h em o d i f i c a t i o n7 f h eo p t i m a le x p r e s s i o nc o n d i t i o n s w e r ee x p l o r e df o rt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no f m e t h a n o l ，i n d u c i n gt e m p e r a t u r e ，i n d u c i n g t i m e ，a e r a t i o nr a t ea n dm i x i n gg l y c e r o lw i t hm e t h a n o li nt h ei n d u c a t i o np r o c e s s a sa r e s u l t ，w ef o u n dt h a tt h el a r g e s tc o n t e n to fg l a r e a c h e d17 0 7 i ng s 3 5 k m a 6b y 0 5 f i n a ic o n c e n t r a t i o n o f m e t h a n 0 1 2 0 i n d u c i n g7 2h o u r sa n da b u n d a n t a e r a t i o n i tw a st h ef i r s tr e p o r ta b o u tt h ee x p r e s s i o no fd 6 d g e n ef r o mm o r t i e r a l l ad p i n e a n d r h i z o p u ，a r r h i z u si npp a s t o r & k e yw o r d s ：6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ，p i c h i ap a s t o r 西，e x p r e s s i o n ，i n i t i a t i o nc o d o n ， y l i n o l e n i ca c i d ，m o r t i e r e l l aa l p i n a ，r h i z o p u sa r r h i z u s i i i 南开人学碗l 研究生毕业( 学位) 论义绪论 第一章绪论 第一节多不饱和脂肪酸的研究概况 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a ) 是指含有两个或两个以 i 双键、碳原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸i “。一般采用x ：y a n z 表示，其中，x 代表脂肪酸碳链中碳原予的数目，y 表示双键的个数，后的数字表示从碳链的 羧基端碳原子丌始数的双键的精确位置，n z 表示脂肪酸在p u f a s 中的类别或者 合成途径。如亚油酸( l i n o l e i ca c i d ) 表示为1 8 ：2 4 ”瞳n 6 。在生物体巾存在的的主要 不饱和脂肪酸如表1 - 1 所示。 表1 1 主要的多不饱和脂肪酸 t a b l e1 - lt h em a i np o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s f o r m u l ac o m m o nn a i i l c sc h i n e s er l a i t l e s a b b m v i a f i o n 1 8 ：2 a 9 12 1 6 l i n o l e i ca c i d 、眨油酸 l a l8 ：3z 垒69 ”n 6 y - l i n o l e n i ca c i d y 麻酸 g l a 1 8 ：3 a 9 - 12 ，”n 3d l i n o l e n i ca c i d仪一h e 麻酸 a l a l8 ：4 a 8 “7 n 3o c t a d e a c a t e t r a e n o i ca c i d h 碳四烯酸 o t a 2 0 ：3 x “n 6 d i h o m o yl i n o l e n i ca c i d高y 一_ e 麻酸d h g l a 2 0 ：4 a 5 。8 1 ”。“n 6 a r a c h i d o n i ca c i d 花生四烯酸 a a 2 0 ：5 a5 。8 ，1 。1 1 4 n 。3 e j c o s a p e n t a e n o i ca c i d二十碳五烯酸 e p a 2 2 ：6 g 4 5 8 ”+ ”- ”n 一3d o c o s a h e x a e n o i ca c i d 十二碳六烯酸d h a 一、多不饱和脂肪酸的生物合成途径川3 】 多不饱和脂肪酸的生物合成是以长链的饱和脂肪酸硬脂酸( 十八烷酸) 为底物，经一系列碳链延长( 增加两个碳原子) 和脱饱和( 引入个双键) 反应 完成的。其中，碳链延长是由延长酶( e l o n g a s e ，e l ) 催化，把供体( 乙酰辅酶 a 或丙：二酰辅酶a ) 上的两个碳原子引入碳链，增加其长度。脱饱和作用是由膜结 合的细胞色素b s ( c y t b s ) 、n a d h c y t b 5 还原酶和脂肪酸脱氢酶( f a t t ya c i d d e s a t u r a s e ，d s ) 组成的酶系催化完成。整个合成途径中在油酸( 1 8 ：1 9 ) 和亚 油酸( 1 8 ：2 a 9 “) 位点各有一个分支点，按照代谢方式不同分为n 6 和1 3 , 一3 两个 途径。 【a 是共同前体，在此基础e 经一系列的碳链延跃和脱氢反应，合成a a 、 南开人学坝l j 州宄生毕业( 学位) 论文 绪论 o h a * 1 e p a 等具有生物活性的长链p u f a 。生物合成路线如图1 1 。其巾：实心箭 头代表反应在高等植物中很普遍；空心箭头代表反应只在一些植物中出现；虚线 箭头代表仅在较低等生物中出现。 ldlla-dcsatura。se，。，。 1 8 ：2 n 6f l a ) 仁= 二= 今1 8 。：3 n 3 ( a l a ) 1 1 4 曲一 飞 18 ：3 n 6 ( g l a )1 8 ：4 n 3 ( o t a ) ：e l o n g a s e r 一： 丫v 2 0 ：3 n 6 ( d h ( 3 l a )2 0 ：4 n 3 ( e t a ) ：“a 5 。d c s a l u r a s e 一，： a 1 7 心；。 2 v 0 ：4 n 6 ( 从一i 。：黜i 搿_ 2 0 罩：5 n 3 ( e p a ) ( a a ) - - _ - - - a ) n ，6 龟g a s e ； v 2 2 ：5 n 3 ( d p a ) 岔。d e s a t u r a s e ： v 2 2 ：6 n 3 ( d h a l n 3 幽1 1多不饱和脂肪酸的生物台成选径 f i gl lt h eg e n e r a lb i o c h e m i c a lp a t h w a y o f i nv i v os y n t h e s i s o fp u f ai nv a r i o u so r g a n i s m s p u f a 合成过程中脂肪酸链的延长和脱饱和作用随着对哺乳动物的系统研究 以及在真核微生物线粒体中活性酶的发现，表明此类反应有可能在细胞质的内质 网中发生。 二、p u f a s 的生理功能 过去二十几年的研究揭示t p u f a s 在生物体内具有广泛的生物学功能，特别 在营养学和医学方面f ”。近年来，随着公众对健康食品的重视程度的增加，p u f a s 的生理功能和生物合成的研究越来越得到广泛重视，其重要的生理功能如f ： 南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文 绪论 ( 一) 生物膜的重要组成成分，调节与膜有关的生理过程 p u f a s 足磷脂结构功能的主要部分。磷脂在所有膜系统中均存在，足细胞和 生物膜的关键组分，它们对生物膜结构、机能、相转变、通透性的调节及膜相关 过程的控制有重要作用。膜上磷脂分子中缺少相当数量的不饱和脂肪酸时，细胞 膜的完整性与流动性降低，细胞功能减退1 4 f 。p u f a s 自p 调节膜结合蛋白如a 。f p 酶、 转运蛋一、组织相容性复合物，并控制与脂肪酸结合蛋白的反应扯i 。 ( 二) 抗肿瘤和抗炎 膳食中的n 一3p u f a s 在动物体内能抑带u p e g 2 的产生，因此起到抑制肿瘤的作 用共轭亚油酸( c o n j u a t e d l i n o l e i ca i c d ，c l a ) 是必需脂肪酸皿浊酸的异构体， 它有抗氧化作用，c l a 在食物脂肪中的含量达0 2 5 时抗氧作用最强；1 时对肿 瘤生长的抑制作用最大。p u f a s 通过影响白介素的代谢，减少踹息性气管炎、风 湿性关节炎等慢性炎症性疾病j 。 ( 三) 降血压、降血脂、防治心脑血管疾病 缺血性心脑血管疾病的主要病理基础是动脉粥样硬化，可由高血压、高血脂、 虹管细胞、血液细胞、凝血系统和纤溶系统等诸因素失调或相互影响造成。c l a 可使血液中总胆同醇，非高密脂蛋白胆固醇及血清中甘三酯的含量显著降低，防 止动脉粥样硬化症的发生一l 。a a 是人体中含量最高、分布最广的一 中p u f a ，具 有促进生物体内脂肪代谢，降低血脂、血糖、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇 ( l d l c ) 和载脂蛋白a p o b ，增加高密度脂蛋白( h d l c ) 和载脂蛋a p o a 的 作用，因此，对心脑血管疾病的预防具有重要的作用博j 。体内e p a 的增加可使红 细胞膜的可塑性增大，变形能力增强，降低血液粘稠度，利于缺血性疾病的改善 和治疗。e p a 和d h a 能抑制血小板凝集，减少血栓素的形成，具有预防心肌和脑 梗塞的功能。 ( 四) 免疫调节 n 3 和n 6p ij f a s 合成具有免疫应答生理活性的前列腺素和白三烯的前体，同 时脂质中的多不饱和脂肪酸又可作为生物体内细胞因子基因转录的响应因子。 c l a h g 促进了脾脏淋巴细胞的增埴及白细胞介素2 ( i l 2 ) 和抗体的合成，使动物血 清中l g g 和l g m 浓度上升h l 。c l a 还能提高肝细胞中胰岛素受体的敏感性，使受损 的葡萄糖耐受性恢复正常，对糖尿病有防治作用。g l a 能增j ；n d , 鼠腹腔巨噬细胞 吞噬鸡红细胞的能力，增强小鼠的迟发性过敏反应，能提高糖尿病模型大鼠t 细 胞b 细胞的水平；能消除实验免疫脑脊萌炎( e a e ) i i 盎床和组织症状，促进伴刀豆 蛋白对t 一细胞的分化，能抑f 1 j l l 2 的生成o j 。近期研究表明：膳食中的脂肪酸含 南开入学顺 埘究生毕业( 学位) 论文 结论 量及其组成，与机体免疫力有关。 ( 五) 有利大脑与视网膜 视网膜中存在大量d h a ，它对婴幼儿眼的机能发育及保护视力是必需的。 d h a 是大脑皮质的主成分，对神经系统有重要作用。最近，l a u r i t e n 等“1 证明在 暂时缺血性萎缩动物模型中，g l a 能, 阻 t 神经死亡。p u f a s 能激活大脑中k + 通道， 对神经系统起保护作用，而饱和脂肪酸不能激活，不起保护作用。 三、p u f a s 的来源 p u f a s 的存在方式主要有两种，一是以膜脂的形式存在，另一种是以贮存脂 的形式存在i ”i ，通常膳食性的油脂指的是后者。h i f a s 广泛存在于各种生物中， 目前市场上的p u f a s 主要来源于植物和动物( 表卜2 ) 。 ( 一) 动物来源 动物性食物，尤其是蛋黄、肉、肝及其他内脏肉中，则含有a a 和i ! p a 。a a 广泛分却于动物的中性脂肪中，牛乳脂、猪脂肪、牛脂肪、血液磷脂、肝磷脂和 脑磷脂中含量约为1 。在高脂鱼及海洋哺乳动物中e p a 和d h a 的含量最高，c 1 8 的多不饱和脂肪酸相对较少。如鲱鱼( m e n h a d e n ) 、沙丁鱼( s a r d i n a ) 等，鱼油中 e p a 占总脂肪酸的1 6 0 3 ，而d h a l 0 。8 3 。 ( ：一) 植物来源 大多数植物油以l a 为其主要的脂肪酸，如玉米胚芽油、棉籽油、燕麦油、 芝麻油、大豆油、红花籽油和葵花籽油等。a l a 的部分来源为富含多不饱和脂肪 酸的植物油，如大豆油、紫苏油、亚麻籽油和低芥酸菜籽油，亚麻酸与亚油酸常 存在于同一植物油中，只是不同种类油中两者相对比例和含量差别很大。高等植 物中具有g l a 的很少，某些不常见的油，如月见草油、琉璃苣油和黑加仑籽油含 有较高的g l a 。 ( 三) 低等真核生物来源 。些低等生物包括真菌、藻类、昆虫和一些无脊椎动物具有独特的生物合成 p u f a s 自p 力，它们是自然界中主要的p u f a s 生产者，也是解决供应不足的一个重 要来源。目前，从其他途径获取p u f a s 的两个主要方向：一个是微生物发酵，如 深黄被孢霉发酵生产g l a ，高i u 被孢霉发酵生产从，破囊弧菌( t h r a u s t o c h y t t i t 。 i t l 5 印) 发酵生产e p a ；另一个是微藻培养，微藻合成p u f a s 的过程与其他微生 物基本一致，微藻也是海洋食物链中p u f a s 的最初生产者，利用藻类生产p u f a s 南开人学坝i 研究生毕业( 学位) 论史绪论 具有含量高，提取的h j f a s 没有鱼腥味，乍q 用作食品添加剂，而且不含胆固醇等 用优点。美图m a r k e t 公司已利用微藻( c r y p t h e c o d i n i u mc o h n i i ) 大规模生产富含 r l - 3 p u f a s 的油脂，它只形成d h a ，不形成e p a ，微藻提取的油脂含量达4 0 以 上。需山都公司选用另一种微藻s c h l z o c h y t y i u 来生产富含d h a 的油脂l ”i 。 表l 。2 主要1 7 1 3 和n 一6p u f a s 现有来源和替代来源”1 t a b t e1 2c u r l e n ta n da l t e r n a t i v es o u r c e so f t h em a i nn 3a n dn 一6p u f a s p u f ac u r r e n ts o u r c e sa i t e m a t i v es o u r c e s a i a a a 植物：月见草( o e n o t h e r a s p p ) 、琉璃苣( b o r a g os p p ) 、 虎眼万年青( o r n i t h o g a l u m s p p ) ( 13 一76 ) 植物：油柒( b r a s s i c as p p ) z g & c m es p p ) 、胡桃( j u g l a n s 砸麻( l i n u m s p p 1 鱼类：油鲱鱼( b r e v o o r t i a s p p ) 、沙丁鱼( s a r d i n as p p ) 、 鲱鱼( c l u p e as p p ) f 0 2 0 6 ) e p a 鱼类：油鲱鱼( b r e v o o r t i a s p p ) 、沙丁龟( s a r d i n as p p ) 、 鲭鱼( s c o r n b e t s p p ) ( 17 一6 2 ) d h a 油鲱鱼( b r e v o o r t i as p p ) 、沙 - n ( s a r d i n as p p ) 、鲭鱼 ( s c o m b e r s p p ) ( 1 7 一6 2 ) 真菌：毛霉( m u c o rs p p ) 、被孢霉( m o r t i e r e l l a s p p ) 、曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) ( 3 6 - 45 ) 藻类：小球凛( 幻w ，如s p p ) 、螺旋藻 ( s p i r u l i n as p p ) ( 1 6 3 6 ) 植物：m a c a r o n e s i a ne c h i u m n o tn e e d e d 真菌：被孢霉( m o r t i e r e l l as p p ) 、腐霉 ( p y t h i u ms p p ) ( 34 - 63 ) 藻类：紫球藻( p o r p h y r i d i u ms p p ) ( 1 6 36 ) 藓类：拟垂枝藓( r h y t i d i a d e l p h u ss p p ) 、青 藓( b r a c h y t h e c i u ms p p ) 、美喙藓( e u r h y n c h i u m s p p ) ( o 7 2 4 ) 真菌：被孢霉( m o r t i e r e l l as p p ) 、席霉 f ，尸w h i u ms p p ，) ( 29 64 ) 藻类：小球藻( c h l o r e l l as p p ) 、黄藻( m o n o d u s s p p ) 、紫球藻( p o 印h y r i d i u ms p p ) 微绿藻 ( n a n n o c h l o r o p s i ss p p ) 、隐白藻( c r y p t o l e u r a s p p ) 、红海藻( s c h i z y m e n i as p p ) 、舟彤 藻( n a v i c m a s p p ) ( 1 8 - 48 ) 真菌：破囊弧菌( t h r a u s t o c h y t r i u ms p p ) 、 虫霉( e n t l m o p h t h o r as p p ) ( 0 6 一1 1 ) 藻类：膝沟藻( g o n y a u l a cs p p ) 、甲藻 ( g y r o d i n u ms p p ) 、隐孢藻( c r y p t o c o n i d i u m s p p ) ( 29 4l ) 细菌：红假单孢藻( r h o d o p s e u d o m o n a ss p p ) 5 南开入学硕卜 i f 究生毕业( 学位) 论文 缝论 四、目前p u f a s 来源存在的问题 由于p u f a s 在人类健康所起的重要作用，其市场需求也迅速增长。尽管有些 p u f a s 的生产已经产业化，但是目前除了l a ，i - ，现有来源的其他p ij f a s 在产量和 质量p ：仍不能满足日益增长的市场需求，主要原因有：( 1 ) 受季节和气候的影 响，p u f a s 的质量和产量不稳定； ( 2 ) 所利用的栽培植物的产量低；( 3 ) 复杂 昂贵的下游精加工处理过程大大增加了p u f a s 的生产成本，阻碍了其许多潜在用 途： ( 4 ) 有限的天然海洋渔业贮量和过度捕捞造成渔业资源缺乏；( 5 ) 带有异 味和安全性等问题 2 ，j 。此外，微生物发酵生产p u f a s g 寸，由于p u f a s 存在于菌 体内，其产量受到菌体收率和菌体p u f a s 含量两者的影响，适于细胞大量生长的 条件和积累高含量脂质的条件往往是相左的，所以除e l a # b 的p u f a s 目前均未能 实现工业化生产，而利用微藻生产p u f a s 目前尚处于实验研究和试生产阶段。通 过微生物发酵和微藻培养获得p u f a s 需要多方面加强研究工作，这包括当前昕进 行的工作多在菌种藻种筛选、培养条件优化和反应器设计等方面，但要真工f 使 其生产p u f a s 工业化，最终还要借助于基因工程和原生质体融合等现代生物技 术，对菌种藻种进行基因改造、筛选，完善发酵工艺技术，同时建立简单高效 的p u f a s 浓缩提纯技术。 、概述 第二节脂肪酸脱氢酶盼研究概况 多不饱和脂肪酸的形成是通过系列碳链的脱氢和延长作用来完成的，在这 其中，所有的脱氢作用都是由各种脂肪酸脱氢酶完成的，这些脱氢酶活性的高低 直接影响着p u f a s 代谢的进程。因此，对各种脂肪酸脱氢酶的研究日渐成为学术 界关注的热点。 脂肪酸脱氢酶所涉及的是一个酶的超家族，其中包括所有动植物中发现的能 为脂酰链加上双键的酶。虽然都是利用从电子传递链获得的分子氧作还原等价物 并且还原反应的基本机制十分类似，我们仍可以把他们分为三个主要的亚家族 ： 1 酰基a c p 脱氢酶( a c y l a c pd e s a t m a s e s ) 这类酶只存在于植物质体中，是一种可溶性脱氨酶，催化与脂酰载体蛋白结 合的脂肪酸脱氢。 2 酰基脂脱氢酶( a c y l l i p i dd e s a t u r a s e s ) 这类酶催化甘油脂中的腊肪酸脱氢，是一种膜结合酶，存在于植物、真菌和 南开人学坝i 研究生毕业( 学位) 论义结论 监细菌中。 3 酰基辅酶a 脱氢酶( a c y l 一c o ad e s a t u r a s e s ) 这类酶也属 j 膜整合酶，催化与c o a 结合的脂肪酸脱氢，目前发现主要存在 于动物、酵母和真菌细胞中。 脂肪酸脱氢酸的分子生物学研究起步较晚，2 0 世纪八十年代末和九十年代初 才玎始有一些脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达的报道。由于用常规的生物化学方 法很难分离纯化到这些酶，所以严重限制了对这些酶的研究。近年来，越来越多 的学术工作者开始关注脂肪酸脱氢酶，大大推动r 研究的进展。 二、脂肪酸脱氢酶的结构特点 通过对目前已知的各种膜结合蛋白脱氢酶序列进行分析，发现脱氢酶的结构 具有相当的一致性i 埔l ：n 端和c 端同源性较差；序列中部相对保守，同源性较强； 都有两段长的疏水区，可以形成4 个跨膜区，特别是含有三个极度保守的组氨酸 区。第一个：h x ( 3 0 r 4 ) h h ，第二个：h x ( 2 。，3 ) h h ，第三个：h x ( 2 。3 ) h h ( 5 图1 2 膜结合的脂肪酸脱氢酶的保守医结构域的比较 f ? i gl 。2d o m a i ns l r u c t u r ea n dc o n s e r v e ds e q u e n c ea l i g n m e mg fr e p r e s e n t a t i v em e m b r a n e b o u n df a t t ya c i dd e s a t u r a s e a 膜结台脱氢酶基冈中可分辨区域的幽示灰色区域代表含有超过4 0 个氮基酸残基的疏水 区，此区域可跨膜两次。斑点区域代表质粒上的转移序列，阴影区域代表与细胞色素b 5 类似的区域。空白区域足保守的组氨酸区。b 组氨酸保守区的序列排布。保守的组氨 酸残墓己标出。 南开入学硕 研究生毕业( 学位) 论文绪论 6 脱氢酶中第三个组氨酸区变成_ _ r q x 2 h i i ) 。而且三个组氨酸保守区之间的距 离电是保守的，第一和第二个组氨酸区之间的距离具有高度的保守性，表现存其 跃度为3 1 个氨摹酸。第二个与第二二个组氨酸保守区之间的距离在1 3 2 1 7 7 氨基酸 之削。膜结合的脂肪酸脱氢酶保守区结构域的氨基酸序列分析如图1 2 ，空问结 构如图1 3 。图1 。2 中所示依次为基凶序列号、物种名称、基因名称及基因类型。 从图1 3 膜结合脂肪酸脱氢酶的结构模式中可以看出，脱氢酶的两个疏水区 跨膜4 次，在细胞质一侧有3 个组氨酸保守区与1 个二价铁离子结合，构成脱氢酶 催化的活性中心。三个组氨酸保守区的组成如表1 3 1 9 , 2 0 2 1 所示。 幽1 3 膜结台脂肪酸脱氢酶的拓扑结构模式图 f i g 1 3m o d e lo f t h ep r o p o s e dt o p o l o g yo f t h em e m b r a n e b o u n dd e s a t u r a s e s c o n s e r v e d h i s t i d i n ec o n t a i n i n gr e g i o n sa r ei n d i c a t e d 在膜整合的脂肪酸脱氢酶中，微体膜脂肪酸脱氢酶按其引入双键的方式不同 又可以分为两种，种是羧基定向的脂肪酸脱氢酶，即“f r o n d e n d ”脱氢酶，羧 基定向的脂肪酸脱氢酶催化已有的双键和羧基之间形成另一个双键，属于这类 的酶有4 、3 、6 和8 一脂肪酸脱氢酶。另一种是甲基定向的脂肪酸脱氢酶， 其催化已有的双键和甲基之间形成另一个双键，如”和”( m 一3 ) 一脂肪酸脱 氧酶。每一类型的脱氢酶都有其特征性相同的蛋白质序列结构，比如f p 基端定向 的脱氢酶通常只具有三个保守的组氨酸富集区，而羧基端定向的脱氢酶除了三个 保守的组氨酸富集区外，还有一个n 端类似于细胞色素b 5 ( c y t b 5 ) 的血红素结 台区( h p g g ) ，构成c y t b 5 融合蛋白超家族“。 细胞色素b 5 2 训是一类广泛存在于高等植物、真菌和动物的内质网上的小 分t ( m w1 4 k d ) 血红素结合蛋白。其结构特征是具有h i s p r o g l y g l y ( h p g g ) ，是血红蛋白结合区域。在微粒体的脱氢酶系中c n b 5 作为脱饱和反应的电 了供体。而在质体酶系中不存在c y t b 5 ，其脱饱和反应的电子供体是铁氧还原 蛋白p - q 。 南开人学坝h 研究生毕、比( 学位) 论义结论 表1 - 3 脂肪酸脱氢酶组氡酸保守区的氨基酸组成 t a b l e l 一3c o n s e r v a t i v eh i s t i d i n ec l u s t e ri nt h ef a t t ya c i dd e s a t u r a s e s a m n 3a c i d s 盯es h o w ni nt h es i n g l e l e t t e rc o c i et h es y m b o lxr e f e r st oa n ya m i n oa c i de x c e p th i s i d i n e 三、脂肪酸脱氢酶的催化机理和活性中心 脂肪酸脱氢酶3 个极保守组氨酸区与二价铁离子结合形成酶的活性中心口5 l ， 其作用是作为金属螫合配基，与铁离子结合，在反应中心与氧形成个反应复合 体( f e - o - f e ) 催化双键的形成。氧将作为细胞色素b 5 、铁氧还原蛋白产生的电子的 最终受体。 脂肪酸脱氢酶对底物的识别，一般具有链长特异性和位置特异性，在某些 高等植物中还具有组织特异性。1 9 9 6 年，l i n d q v i s ty 首次得到了蓖麻种子a 9 一 硬脂酰a c p 脱氢酶( d e l t a 9s t e a r o y l a c pd e s a t u r a s e ，s a d ) 的晶体结构，如图1 4 所示，蓖麻s a d 是由3 1 3 个氨基酸构成的单体，包括由11 个a 螺旋组成的单一结构 方式，其中9 个形成反向平行螺旋束。酶亚基含一个f e 2 + 中心，与螺旋束中的四 个。螺旋相配合，铁离子束缚予高度对称环境。从酶表面到内部有一个深的窄穴， 该空穴可能是脂酰基的