（植物营养学专业论文）水稻胚乳淀粉合成相关基因克隆与高温影响稻米品质的分子生理学机制研究.pdf

摘要 水稻稻米淀粉的组成、结构与积累是稻米品质与产量的决定因素。本研究 以籼稻浙7 3 3 和粳稻浙农大1 0 4 为材料，克隆了胚乳淀粉合成部分相关基因，分 析了表达特性及功能；同时探讨了高温影响稻米品质与淀粉合成酶箭关系，结果 如下： l 从水稻未成熟种子全长c d n a 文库中克隆到葡萄糖6 一磷酸，磷酸转运体 ( g p t ) 基因，推导的氨基酸序列与玉米g p t 具有9 1 的同源性。o s g p t 在水 稻基因组中为单拷贝，定位于8 号染色体，并与一个耔粒干粒重q t l 连锁；在 胚乳与根中高水平表达，叶片中只有痕量表达。说叫水稻胚乳细胞中胞浆内碳水 化合物可能是以葡萄糖一6 磷酸进入造粉体用于淀粉合成。 2 水稻胚乳存在西利果 j 【i 激酶，其汪性只受商 浓艘a t p 的抑烈，弧不受高浓 度果糖抑制。通过p c r 从水稻胚乳中获得两个果糖激酶克隆，o s f i g 和o s f k i i 。 o s f k i 和o s f k l l 都具有a t p 结合结构域和果糖激酶特有的幕糖结合结构域，在 大肠杆菌中证明这两个基因表达产物具有果糖激酶活性。o s f k i 和d 删主要 在未成熟种子和根中表达，o s f k i i 在未成熟种子内的表达量高于o s f k i 。两个 果糖激酶基因在水稻基因组中都是单拷贝，分别定位于1 号染色体和8 号染色体 上，并且o s f k l 与一个千粒重q t l 连锁。 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示水稻j 匝乳中存在多种淀粉合( 成) 酶同工 型，根据电泳迁移率可以分为3 类。从水稻胚乳中克隆了3 个s s s i i 基因，并在 大肠杼菌中表达证明了其淀粉合( 成) 酶活性。这三个基因在水稻基因组中都是 单拷贝，分别定位在1 0 号( $ 3 蕊i i - 1 ) ，2 号( s s s l l - 2 ) 和6 号( $ 8 8 i i - 3 ) 染色体 上。这3 个基因3 端的6 个外显子的排列完全一致，说明有共同进化来源。在 5 端差异很大，可能由此赋予了不同的功能。s s s i i - 2 在水稻中为低水平组成性 表达；s s s i i - 1 主要在胚乳中表达，但在叶中也有少量表达；s s 5 v i - 3 则只在胚乳 中表达。s s s l l - 3 与a l k 基因紧密连锁，而s s s l l - 1 也同一个千粒重q t l 连锁，说 明s s s i i - 1 和s s s 7 1 - 3 征稻米淀粉积累与i 锗质形成方面只有重要作用。 4 候选克隆( c a n d i d a t e g e n ea p p r o a c h ) 和凹位候选克隆( p o s i t i o n a lc a n d i d a t e c l o n i n g ) 已成为基因克隆与基因功能分析的重要途径。本研究通过生物信息学方 法定位了水稻胚乳淀粉合成与积累相关的5 6 个候选基因，发现有3 1 个基因与z k 珏 稻干粒重和糊化温度、胶稠度等q t l 连锁，说明水稻胚乳淀粉积累与淀粉结构 可能与这些基因相关。为进一步研究水稻产量的形成和稻米品质形成的分子基础 提供了参考。 5 稻米品质明显受环境温度的影响。为t g f ，z 高温影响稻米品质的分子生 理学机制，以浙7 3 3 为材料，开花后分别移植于高温( 2 9 3 5o c ) 和适温( 2 2 ，2 8 o c ) 生长，分析了稻米品质变化和胚乳淀粉合成相关基因的表达变化。灌浆期高 温改变稻米淀粉的组成与结构，使直链淀粉含量降低和支链淀粉长b 链比例增 加，从而降低稻米蒸煮品质，原因是胚乳颗粒结合淀粉合( 成) 酶和淀粉分支酶 的表达与活性降低。高温加速了籽粒的灌浆，缩短了灌浆期，降低了籽粒的充实 度，从而增加稻米垩白面积并降低了稻米的整精米率。水稻成熟时，胚乳中以及 茎叶中残留的可溶性总糖含量增加。与此相对应，高温对叶片蔗糖磷酸合成酶活 性影响不大，而胚乳蔗糖合( 成) 酶、a d p 饷萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合 ( 成) 酶活性在灌浆高峰期活性略有增加，但在灌浆后期迅速下降。说明商沮主 要是通过影响胚乳的淀粉合成而影响籽粒产量和稻米品质。 关键词：葡萄糖- 6 一磷酸转运体，己糖激酶，淀粉合( 成) 酶，高温，淀粉 合成，稻米食用品质，水稻 1 1 1 a b s t r a c t t h eq u a l i t yo fr i c e g r a i n i sc h a r a c t e r i z e db yt h ec o m p o n e n t ，s t r u c t u r e a n d a c c u m u l a t i o no fs t a r c h s i xg e n e sf o rs t a r c hs y n t h e s i sw e r ec l o n e da n dc h a r a c t e r i z e d i nr i c e a n dt h ee f f e c t so fh i g ht e m p e r a t u r eo nt h eq u a l i t yo fr i c eg r a i na n dt h eg e n e s i n v o l v e di ns t a r c h s y n t h e s i s w e r ei n v e s t i g a t e dt h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da s f o b o w s ： 1ac d n ac l o n ee n c o d i n gg l u c o s e6 - p h o s p h a t e p h o s p h a t et r a n s o c a t o r ( g p t ) w a s i s o l a t e df r o mae d n a l i b r a r yo f i m m a t u r es e e d so fr i c ea n dn a m e da so s g p t , t h e p u t a t i v ea m i n oa c i d ss e q u e n c eo fo s g p t s h a r e d9 1 i d e n t i t yw i t hm a i z eg p tt h e o s g p t g e n ew a sm a p p e do nc h r o m o s o m e8l i n k e dt o aq u a n t i t a t i v et r a i tl o c u sf o r 1 0 0 0 一g r a i nw e i g h t ，o s g p tw a sm a i n l ye x p r e s s e di nh e t e r o t r o p h i ct i s s u e s ，t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a tg l u c o s e 6 一p h o s p h a t ei m p o r t e dv i ag p t s h o u l db eu s e df o rs t a r c h b i o s y a t h e s i si na m y l o p t a s to f r i c ee n g o s p e r m s 2t w oi s o f o r m so ff r u c t o k i n a s e sw e r ed e t e c t e di nr i c ee n d o s p e r m b yn a t i v e ，p a g e ， a n dt h e i ra c t i v i t i e sw e r ei n h i b i t e db y5 0m m o l la t p , b u tn o ti n h i b i t e db y5 _ 0m m o l l f r u c t o s e ，t w oe d n ac l o n e s ，o s f k ia n d o s f k i i , e n c o d i n g f f u c t o k i n a s e sw e r e i s o l a t e df r o mr i c e e n d o s p e r mb yp o l y m e r a s e c h a i n - r e a c t i o n t h ed e d u c e dp r o t e i n s p o s s e s s a n p 汀p - b i n d i n g m o t i fa n da p u t a t i v es p e c i f i c s u b s t r a t e r e c o g n i t i o ns i t e i d e n t i f i e di nb a c t e r i a lf r u c t o k i n a s e s t h e i d e n t i t y o fo s q ga n do s f k l l a s f r u c t o k i n a s ew a sc o n f i r m e db ye x p r e s s i o no ft h ee n z y m ea c t i v i t yi ne c o l i o s f k i a n do s f k i i e x p r e s s e dp r e d o m i n a n t l yb o t ho f j m m a t u r es e e d sa n dr o o t s t h em r n a c o r r e s p o n d i n gt oo s f k i ia c c u m u l a t e d t oh i g h e rl e v e l si ny o u n g d e v e l o p i n gr i c es e e d s a n di t st r a n s c r i p tw a sr e m a r k a b l yh i g h e rt h a nt h a to fo s f k i t h er e s u l t si n d i c a t et h a t b o t ho s f k ja n do s f k i ia r es i n ks p e c i f i cb o t h g e n e se x i s ta sas i n g l ec o p yi nt h er i c e g e n o m ea n dw e r em a p p e do nc h r o m o s o m e1 a n dc h r o m o s o m e 8 ，r e s p e c t i v e l y o s f k i i sl i n k e dt oaq u a n t i t a t i v et r a i tl o c u sf o r10 0 0 一g r a i nw e i g h to r lc h r o m o s o m ei 3n i n ei s o f o r m so fs t a r c h s y n t h a s e w e r ed e t e c t e d i n r i c e e n d o s p e r mh y n a t i v e - p a g e ，a n dt h e yc o u l db ed i v i d e di n t ot h r e ec l a s s e s a c c o r d i n g t ot h e e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t y t h r e eg e n e s ，s s s i i - i ，s s s i i - 2a n ds s s i t - 3w e r ei d e n t i f f e d a n dc l o n e di nr i c e a n dt h ei d e n t i t y o ft h et h r e e g e n e s a ss t a r c hs y n t h a s ew a s c o n f i r m e db ye x p r e s s i o no fe n z y m ea c t i v i t yi ne c o i le a c ho ft h eg e n e se x i s t e da sa s i n g l ec o p yi nr i c eg e n o m e a n dw a sm a p p e do i lc h r o m o s o m e10 ，c h r o m o s o m e 2a n d c h r o m o s o m e 6 r e s p e c t i v e l y s s s l l - ii s l i n k e dt oaq t lf o r1 0 0 0 g r a i nw e i g h t ，w h i l e s s s i i - i sl i n k e dt ot h ea kg e n e ，l o w e rt r a n s c r i p t o fs s s i i - 2w a sc o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d s s s l l - 1w a se x p r e s s e dm a i n l yi ni m m a t u r es e e d sa n dl e a v e s s s s i l 3w a n o n l ye x p r e s s e di ne n d o s p e r mo f r i c e t h er e s u l t si n d i c a t et h a ts s , 5 1 7 1 - 1a n ds s s i i - 3a r e i n v o l v e di nt h ef o r m i n go f s t a r c hy i e l da n dg r a i nq u a l i t yi nr i c e 4 f i l l y s i xg e n e sf o rs t a r c hs y n t h e s i sw e r em a p p e do n r i c ej r g p r f l p m a p ( 2 0 0 0 ) b yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d ，a n dt h el o c i o ft h i r t y - o n eg e n e sa m o n gt h e mw e r ef o u n d l i n k e dw i t hq t l sf o r10 0 0 g r a i nw e i g h t ，g e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r ea n db r e a k d o w n v i s c o s i t y t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e s eg e n e sb ei n v o l v e di nt h ey i e l da n dq u a l i t yo f r i c eg r a i n s 5r i c e g r a i nq u a l i t y i s p r o n e t oe n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r e t oi n v e s t i g a t e p h y s i o l o g i c a lm o l e c u l a r m e c h a n i s m so ft h ee f f e c to f h i g ht e m p e r a t u r e o nr i c eg r a i n ，a n o n w a x yi n d i c ar i c e ( z h e 7 3 3 ) w a sg r o w nu n d e rt w ot e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s ，( 2 9 3 5 。c ) a n d ( 2 2 2 8o c ) ，d u r i n gr i p e n i n gs t a g ei nt w op h y t o t r o n s t h ea c t i v i t i e sa n dg e n e e x p r e s s i o no f t h ek e ye n z y m e sf o rt h eb i o s y n t h e s i so f a m y l o s ea n da m y l o p e c t i nw e r e e x a m i n e d t h ea c t i v i t ya n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fs o l u b l es t a r c hs y n t h a s e1 ( s s s oi n e n d o s p e r mw a ss l i g h t l yh i g h e ra t2 9 3 5 。ct h a nt h a t a t2 2 2 8 。ci nc o n t r a s t ，t h e a c t i v i t i e sa n de x p r e s s i o nl e v e l so fr i c eb r a n c h i n ge n z y m e l ( r b e i ) a n dg r a n u l e b i n d i n gs t a r c hs y n t h a s e ( g b s s ) o fe n d o s p e r mw e r el o w e ra t2 9 1 3 5 。ct h a nt h o s ea t 2 2 2 8 t h er e s u l t s s u g g e s t t h a tt h ed e c r e a s e d a c t i v i t y o fr b eir e s u l ti nt h e r e d u c t i o no ft h eb r a n c h i n gf r e q u e n c yo ft h el o n g e rb r a n c h e so fa m y l o p e c t i n ，a n d c o n s e q u e n t l yr e s u l t i nt h ei n c r e a s eo fa m o u n to fl o n gbc h a i n so fa m y l o p e c t i no f e n d o s p e r mi nr i c eg r a i na th i g ht e m p e r a t u r eh i g ht e m p e r a t u r er e d u c e dh e a dr i c er a t e a n di n c r e a s e dt h er a t eo fc h a l k i n e s s b ya c c e l e r a t i n g t h e f i l l i n g a n d s h o r t i n gt h e d u r a t i o no f f i l l i n g t h eh i g ht e m p e r a t u r eh a dl i t t l ee f f e c to nt h ea c t i v i t i e so fs u c r o s e p h o s p h a t es y n t h a s e i nl e a v e s ，b u ti n c r e a s e dt h ea c t i v i t i e so fs u c r o s es y n t h a s ea n d a d p - g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e i n e n d o s p e r m sa t t h em i d d l e f i l l i n gs t a g e t h e v a c t i v i t i e so ft h e s ee n z y m e sr e d u c e dr a p i d l ya tt h el a t e rf i l l i n gs t a g e a tt h es a m et i m e ， h i g ht e m p e r a t u r ei n c r e a s e dt h er e s i d u er a t eo fs o l u b l es u g a r s i nm a t u r eg r a i n sa n d s t e m s s h e a t ht h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a th i g ht e m p e r a t u r er e d u c e dt h ey i e l da n de d i b l e q u a l i t yo fr i c eb yr e g u l a t i n gt h ea c t i v i t i e so f t h ek e ye n z y m e so fs t a r c hs y n t h e s i si n r i c ee n d o s p e r m s k e yw o r d s ：g l u c o s e - 6 一p h o s p h a t e p h o s p h a t et r a n s l o c a t o f i h e x o k i u a s e ；s t a r c h s y n t h a s e ；h i g ht e m p e r a t u r e ；s t a r c hb i o s y n t h e s i s ；e d i b l eq u a l i t yo f r i c e ；r i c e ( o r y z a s a l i v al ) 致谢 本论文的研究是在导j j i l j 吴平教授的悉心指导下完成的。导师严谨的治学态 度、执著的事业心和一丝不萄的工作作风使我受益无穷，终身难忘。 论文中淀粉合( 成) 酶与果糖激酶c d n a 克隆以及在大肠杆菌中表达与活性 测定工作是与佃蔚敏同学合作完成的。 感谢易可可老师、吴运荣技术员、朱诚老师、刘非燕老师、黄建中老师、胡 彬老师、王酋锋老师、正君晖老! j j i 、曾、。文老师羽i 夏铭l i | 土在本论文完成过程巾 的指导和帮助。同时感谢实验室张卫萍、李海波、沈晓莹、杨玲、金维正、吴敏、 王小兵、陈青爽、郝海凌、郑炳松、毛传澡、吴忠长、陈双燕、杜黎明、张帆、 黄帼、侯兴亮、朱世华、刘洪家、张麝龙、王芳、樊叶杨、周洁、齐小朋等同学 给予我的建议与帮助。 最后，感谢我的家人和朋友对我的关心、支持和帮助。 a d p a d p g a g p a g p p p l t p b d v b s a d b e d t t e d t a e s t f r c 6 p f r k g b s s g l c l p g l c 6 p g p t g t h e p e s h x k l n v i p t g m g p m t t n a d p n r o r f o s g p t o s f k o s s s s l f p a g e p e p p m s q t l 缩略词 a d e n o s i n e5 - d i p h o s p h a t e a d p g l u c o s e a d p g l u c o s et r a n s l o c a t o r a d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e a d e n o s i n e5 - t r i p h o s p h a t e b r e a k d o w n v i s c o s i t y a i b u m i nb o v i n e s t a r c hd e b r a n c h i n ge n z y m e d i t h i o t h e i t o l e t h v l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s f m c t o s e - 6 - p h o s p h a t e f r u c t o k i n a s e g r a n u l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s e g l u c o s e - 1 p h o s p h a t e g l u c o s e - 6 一p h o s p h a t e g l u c o s e - 6 一p h o s p h a t e p h o s p h a t e t r a n s | o c a t o r g e l a t i n i z a t i o nt e m p e r a t u r e n _ 【2 - h y d r o x y e f l l y l 】p i p e r a z i n e n - 【2 一e t h a n e s u l f o n i ca c i d 】 h e x o k i n a s e i n v e r a s e i s o p r o p y l1 3 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e j a p a n e s er i c eg e n o m ep r o g r a m 3 一 4 ，5 d i m e t h y l t h i a z o l - 2 一y l 】一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e n i t r a t er e d u c t a s e o p e nr e a d i n g - f r a m e o r y z a s a a v a g l u c o s e 6 p h o s p h a t e p h o s p h a t et r a n s l o c a t o r o i y z a s a l i v af r u c t o k i n a s e o r y z a s a l i v as o u b l es t a r c hs y n t h a s e1 1 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h o e n o l p y r u v a t e p h e n a z i n em e t h o s u l f a t e q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i r b e r f l p r t 。p c r s b e s b v s d s s s s s s s u s y t r i c i n e u d p u g p p r i c e b r a n c h i n ge n z y m e r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e s e t b a c kv i s c o s i t y s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s t a r c hs y n t h a s e s o l u b l es t a r c hs y n t h a s e s u c r o s es y n t h a s e n - t r i s h y d r o x y m e t h y l m e t h y l g l y c i n e u r i d i n e 5 - d i p h o s p h a t e u d p - g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e 第一部分文献综述 水稻胚乳淀粉粒的合成：途径与基因 稻米不仅是重要的食粮，而1 1 还是有很多用途的工业原料。淀粉占稻米干重 9 0 左右，是决定水稻籽粒产量和稻米品质的关键成分。因此，对水稻胚乳淀粉 合成生化途径及其基因的研究是运用基因操作手段增加水稻籽粒产量、改良稻米 品质和提供新型淀粉原料的科学基础。 1 水稻胚乳淀粉合成的生化途径概要 根据目前的研究，水稻胚乳细胞中淀粉的生化合成途径可概括如下：蔗糖是 淀粉合成的前体，进入胚乳细胞后通过糖酵解途径代谢转化成葡萄糖6 磷酸和葡 萄糖1 - 磷酸；a d p 葡萄糖( a d p g l u c o s e ，a d p g ) 在细胞浆和造粉体两位点合 成；葡萄糖6 磷酸可能还有a d p g 通过造粉体被膜上的载体进入造粉体。在造 粉体内，a d p g 作为底物在淀粉合( 成) 酶( s t a r c hs y n t h a s e ，s s ) 、淀粉分支酶 ( s t a r c hb r a n c h i n ge n z y m e ，s b e ) 和脱支酶( s t a r c h d e b r a n c h i n ge n z y m e ，d b e ) 的共同作用下合成淀粉( 图1 1 ) 。下而我们将详细讨论此途径中主要成员的特征 与功能。 2 蔗糖的转化 水稻籽粒淀粉的合成是以转运到胚乳细胞的蔗糖为底物的。但蔗糖不能直 接形成淀粉，必须经过一系列代谢转化成a d p 葡萄糖后才能由淀粉合( 成) 酶 将葡萄糖单元转移到引物上从而合成淀粉分子。蔗糖代谢转化途径中最重要的是 蔗糖合( 成) 酶( s u c r o s e s y n t h a s e ，s u s y ) 和己糖激酶( h e x o k i n a s e ，h x k ) 果糖激酶( f r u c t o k i n a s e ，f r k ) 。 在水稻胚乳细胞中，蔗糖的水解是蔗糖代谢和淀粉合成的第一步。水稻体内 有转化酶( i n v e r a s e ，i n v ) 和s u s y 等能催化蔗糖水解，但r h 于水稻胚乳细胞中 s u s y 活性大大高于l n v 活性，并且胚乳s u s y 活性也大大高于叶片s u s y 活性， 因此在水稻未成熟种子胚乳细胞中主要由s u s y 催化蔗糖水解( n a k a m u r a 等， 1 9 8 9 ) ，进而形成u d p - 葡萄糖和果糖。目前在水稻中已经分离出s u s y 的三种同 工型，由三个不同基因编码。通过w e s t e r n 杂交和原位杂交分析表明三利，s u s y 圈1 - i 水稻胚乳合成的生化途径 f i g 1 - i t h em a j o rm e t a b o l i t e sa n de n z y m e si n v o l v e di nt h ec o n v e r s i o no f s u c r o s et os t a r c hi nr i c ee n d o s p c r m s s a c r o s cs y n t h a s c ；h e x o k i n a s ea n d f r u c o k i n a s e ；u d p g l cp y r o p l l o s p l l o r y l a s e ；a d p g i cp y r o p h o s 9 h o r y l a s e ； p h o s p h o g l u c o s ei s o m e r a s e ；p h o s p l l o g i u c o m u i a s e ；s t a r c hs y n t h a s e ( g b s s l ) ； s t a r c t ls y n t h a s e ( s s ) a n ds t a r c h b r a n c h i n ge n z y m e ( s b e ) ；a g p ：a d p g i c t r a n s l o c a t o r ；g p t ：g i c 6 p p it r a n s l o c a t o r 基因在未成熟种子都有表达，但是它们的表达存在时空差异。s u s y l 主要在胚乳 发育早期表达，大多分布在糊粉层细胞；s u s y 2 表达与分布无特异性；s u s ) ，3 表 达较晚，其高峰期在花后6 一1 2 天，也就是灌浆高峰期内，主要分布在胚乳细胞。 三种s u s y 表达的组织特异性结果表明，s u s y i 生理 乍用是将糖转运到胚乳细胞， 在胚乳细胞内蔗糖主要由s u s y 3 水解，s u s y 2 则是组成性表达，起看家基因作用 ( w a n g 等，1 9 9 9 ) 。水稻s u s y 受钙依赖的蛋白激酶磷酸化激活，并可能由此 调节蔗糖的转化和淀粉合成与积累( a s a n o 等。2 0 0 2 ) 。 在水稻胚乳细胞中，蔗糖经降解后的形成果瓣和u d p 一葡萄糖。由于细胞内 果糖的积累会抑制s u s y 和f r k 的活性( r e n z 和s t i t t 。1 9 9 3 ) 。因此果糖必须尽 快被磷酸化进入糖酵解和淀粉合成途径。在植物中，h x k 和f r k 两利- 酶均可以 催化果糖磷酸化。因为f r k 对果糖的亲和力远远大于h x k ，所以般认为f r k 2 在催化果糖磷酸化时起主导作用( p e g o 等，2 0 0 0 ) 。展近，我们从水稻胚乳中已 经克隆到两个f f k 的c d n a 克隆和两个h x k 的e d n a 克隆t 推导出的氨基酸 序列同已经研究的植物f r k h x k 具有很高的同源性，都具有保守结构域，并已 在大肠轩菌中验证了两个f r k 克隆表达产物的催化活性。表达分柢表明，四个 基因在胚乳中都有表达，但f r k 2 的表达量远远高于其它三个基因，说明胚乳巾 f k k 2 可能足果糖磷酸化桷主要同工型( j i a n g 等，2 0 0 2 a ) 。 3 质体被膜的糖转运体 水稻胚乳细胞中淀粉的合成在造粉体中进行，在细胞浆中形成的淀粉合成前 体物必须转运到造粉体内才能直接进行淀粉合成。对淀粉合成器官的离体研究发 现，淀粉合成的前体物可能是暂萄稚6 磷酸，转运到质体质有质体磷酸衙萄椭变 位酶的催化转变成葡萄糖1 - 磷酸作为a g p p 的底物( h i l l 和s m i t h ，1 9 9 1 ； n e u h a u s 和m a a s ，1 9 9 6 ) 。从玉米、马铃薯取i 豌豆t t l 已经觅隆斟葡萄糖6 磷酸 磷酸转运体( g l u c o s e6 - p h o s p h a t et r a n s l o c a t o r ，g p t ) 的c d n a ，并在酵母中证 明此e d n a 表达的蛋白质进行葡萄稚6 磷酸和无机磷酸，三碳糖磷酸的1 ：1 反向 运输( k a m m e r e r 等。1 9 9 8 ) 。水稻胚乳e d n a 文库中也分离出包含g p t 全长 c d s 的c d n a 克隆，推导的氨基酸序列与玉米g p t 的同源性高达9 1 ，位于8 号染色体，与一个千粒重q t l 连锁。水稻g p t 在光合组织r f j 基本没有表达而 在根和未成熟利，子等异养组织中高丰度表达，说i ! j _ j 水稻胚乳通过g p t 将葡萄糖 6 。磷酸从细胞浆中转运到造粉体作为淀粉合成翦体( i i a n g 等，2 0 0 2 b ) 。 但是，在水稻胚乳中a g p p 活性也存在于细胞浆中( 见下节) ，g p t 可能不 是碳源进入造粉体的唯一途径。在玉米中，b r i t t l e l 蛋白起着a d p g 转运体 ( a d p - g l u c o s et r a n s l o c a t o r ，a g t ) 的作用，它被认为是淀粉合成底物进入造粉 体的另一条途径( s u l l i v a n 等，1 9 9 5 ) 。最近，我们从水稻中分离到与玉米b n t e 1 基因尉源性很高的e d n a 克隆，在胚乳发育早坍表达，但是摊导船氨基酸序列 中没有被认为是a d p g 结合位点的氨瑟酸序列k t g g l ，取而代之f l ，j 是 k t g g g l 。此外目前克隆的编码水稻a g p p 的4 个基因的氮慕酸序殉酃存在商 定位于质体的前导肽。因此，在水稻胚乳细胞中是否与玉米的类似，细胞浆中合 成的a d p g 遇过质体被膜上的a g t 破转运到质佟肉还有待送一步研究。 4a d p g 的合成 在植物体内淀粉合成的直接前体足a d p g 。a d p g 由a d p 一葡萄糖焦磷酸 化酶( a d p g l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ，a g p p ) 催化合成。a g p p 由大小两个亚 基组成，从氨基酸序列可以区分大小驱基。此酶催化部位位于小亚基而调节部位 位于大亚基上( s m i t h 等，1 9 9 7 ) 。在水稻中，a g p p 至少由4 个基因编码，2 个 编码大亚基( n c b 登录号为：a f l 0 1 0 4 5 a y 0 2 8 3 1 4i d 5 0 3 1 7 ) ，2 令编码小亚 基( n c b i 登录号为：a y 0 2 8 3 1 5 和j 0 4 9 6 0 ) 。水稻胚乳a g p p 同叶片a g p p 一样 受3 磷酸甘油酸激活和无机磷酸抑铷，并且具有热稳定性。早期报道认为水稻胚 乳细胞中a g p p 主要位于造粉体内( n a k a m u r a 等，1 9 8 9 ) ，但是最近又有研究表 明水稻胚乳细胞中a g p p 活性与大麦、小麦和玉米一样，主要位于细胞浆中，只 有少部分( 1 0 ) 位于造粉体内( s i k k a 等，2 0 0 1 ) 。从水稻a g p p 的4 个基因编 码的蛋白质氨基酸序列分析发现都有定位于叶绿体的前导肽存在，说明它们都位 于造粉体。在水稻是否还存在编码细胞质a g p p 基因，或者是出于a g p p 基因 存在不同的剪接方式提供细胞质中的a g p p 活性还有待进步研究。 5 支链淀粉的合成 从化学结构来看，支链淀粉是由葡萄糖单位以1 ，4 糖苷键和c t - i ，6 糖苷 键共同连接形成的高度分支的多聚物。支链淀粉中没有分支的葡聚糖链称为a 链，a 链以其还原端通过m 1 ，6 糖苷键连接在b 链上。b 链指支链淀粉中具有 个或多个分支的葡骧城链。处于分支点上的 l i j f 绚摊残基占整个支链淀粉的5 左右。支链淀粉分子中，a 链和b 链的都有定的长度范围，而且分支点也不 是随机的，这些分支成簇排歹i j 在淀粉分子中。在淀粉粒中。支链淀粉支链鹋锥还 原端向外呈放射状排列，并有规则地包裹起来，形成9 - 1 0 n m 宽的晶体层和无定 型层交替排歹l j 的半晶体结构。晶体层由同一分支簇内桶邻纳a 链或bj l j i 问相互 形成双螺旋紧密排列而成，而无定型层则是由松散包裹分支点结构组成( s m i t h 等，1 9 9 7 ；b a l l 等， 】9 9 8 ；s m i t h ，1 9 9 9 ；m y e r s 等，2 0 0 0 ) 。山于分文簇的 形成及其规则地排列对a 链和1 3 链的k 度具有严格的要求，所以要了解支链淀 粉合成的生化机制，必须研究形成支链淀粉a 链和b 链的控制因子。 5 1 淀粉合( 成) 酶 同支链淀粉分支链长有关的第一个酶是淀粉合( 成) 酶( s s ) 。s s 催化转 移a d p g 上的葡萄糖单元通过形成新吐一i ，4 糖f 1 ：键连接到淀粉分子克链非还原 端，从而延伸葡聚糖链。在淀粉合成组织中具有多种s s 同工型，并且在支链淀 粉和，或直链淀粉合成过程中都具有特殊作用。根据氨基酸序列同源性，这些s s 同工型至少可以分为五个类型。第一个类型是颗粒结合的淀粉合( 成) 酶 ( g r a n u l e b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ，g b s s ) ，主要合成直链淀粉( s a n o ，1