（食品科学专业论文）采用复合酶有限水解青鳞鱼蛋白的研究.pdf

摘要 摘要 本文以青鳞鱼蛋白为原料，用复合酶有限水解技术制备蛋白水解物 并对其进行了食品功能特性及抗骨质疏松活性研究。 在原料特性的研究中，主要研究了原料蛋白质和分离组分氨基酸构 成。结果表明青鳞鱼蛋白含1 8 种氨皋酸( 呈味氨基酸占4 4 0 、疏水氨 基酸占4 1 9 ) ，其组分分子大小为肌浆蛋白 基质蛋白 碱溶性蛋白 肌原 纤维蛋白。由于基质蛋白高达5 2 4 6 、肌原纤维蛋白仅为4 1 9 ，故青 鳞鱼不适合制作鱼糜制品，但适合制作功能食品基料、明胶、活性肽制 品及海鲜调味料等。 在木瓜蛋白酶、风味酶等复合酶有限水解过程巾，首先采用正交试 验确立了水解时间为1 2 0 m i n 时酶对青鳞鱼蛋白质的最适水解条件。其次， 研究了以水解时间为变量因子的三种酶的水解产物。结果表明，复合酶 用量比其2 种前体酶减少了2 2 倍，最适宜p h 接近鱼肉水悬液自然p h ； 它在最适宜条件下存在三组线性关系，即：d h = 0 0 2 6 1 t + 8 8 4 8 6 ( t = 1 0 2 1 0 m i l 3 ，r = 0 9 8 3 4 ) 、m i p l - 一0 0 2 4 1 1 t + 1 1 5 6 1 6 ( t 0 ，r = 一0 93 6 9 ) 和t f a a = 0 15 5 8 t + 3 8 7 6 ( t = 3 0 1 2 l o m i n ，r = 0 9 8 9 1 ) ；它对胱氨酸和苯丙氨 酸+ 酪氨酸表现出高底物特异性，而对2 种前体酶都不能水解的色氨酸连 接的肽键具有一定的水解能力。 按照研究和实验分析，得出复合酶有限水解动力学模型及相关参数， 分别为：d h = 5 8 8 2 l n 1 + ( o 0 5 3 6 2 e 。so - - 0 0 0 3 2 ) t 和 r - ( 0 3 l5 4 e o - - 0 0 1 8 6 s 。) e x p ( 一0 17 0 d h ) ，复合酶失活常数k 。= 0 0 5 3 6 m i n ， 复合酶水解反应能够顺利进行的条件：e 。so co ( 其中常数c 。= 5 9 0 1 0 ) 。 采用复合酶有限水解可大大改善青鳞鱼蛋白的溶解性，水解产物的 n s i 为8 9 3 一9 8 5 而且在酸性p h 范围n s i 略高于碱性p h 范围；复合 酶可以显著提高蛋白质的乳化活力，水解产物在酸性范围具有相对恒定 且最高乳化活力指标，在碱性范围则表现出较低的乳化活力；随着d h 的 增加，最高乳化活力指标表现的p h 范围更宽广，但都保持在1 1 2 m 2 g 以 上。复合酶对乳化稳定性有降低趋势，在酸性范围比碱性范阿具有相对 较高的乳化稳定性；同时，较低d h 的水解产物比较高d h 的具有相对较 低的抗热处理能力。蛋白质浓度为1 5 时，f p 随浓度的增加而增加； 泡沫形成后的1 m i n 内，1 蛋白质浓度的泡沫较3 和5 的稳定，而15 m i l 3 后，泡沫的稳定性随蛋白质浓度的增加而增加。浓度为3 、d h 为19 9 的水解产物，p h 4 0h 、j 具有最低的起泡性能，而p h l0 0 时具有最高的起 泡能力；p h 4 0 和8 0 是泡沫最不稳定的p h 点，而p h l 0 0 时泡沫最稳定。 华卣理工大学博士学位沦文 在p h l 0 0 时，水解产物( 1 ) 的起泡能力随d h 从0 到8 4 的增加而降 低，随d h 从8 4 到1 9 9 的增加而提高；泡沫形成后，不经水解的蛋白 质具有最高的稳定性。 动物实验表明，大鼠去卵巢后，其骨吸收速度相对高于骨形成的速 度，从而打破了正常的骨代谢平衡，导致骨质疏松。雌激素己烯雌酚 ( 1 0 u g k g d ) 能使骨代谢的骨形成作用得到加强并重新恢复到正常的骨 代谢平衡状态，从而达到治疗骨质疏松的目的。但是这种雌激素对大 鼠子宫有强烈的刺激作用等副作用。水解产物的抗骨质疏松活性与雌激 素一样是使骨形成作用增强从而使去卵巢大鼠的骨代谢恢复到正常水 平。在其发生作用的过程中，蛋白质的d h 变化以及超滤与否有一定的影 响，低d h 的水解产物比高d h 的效果要明显，超滤在一定程度e 会减弱 这种作用。水解产物对去卵巢大鼠子宫没有刺激作用等副作用。d h l l 。8 0 经过超滤的水解产物( 5 m l k g d ) 与己烯雌酚( 1 0 u g k g d ) 的联合使用在 增强骨形成方面具有增效作用，而在对子宫的刺激方面则有拮抗作用。 因此，可以用水解产物部分或金部代替雌激素治疗骨质疏松以避免单独 使用雌激素而山现的副作用。 关键词：水解产物；有限水解：动力学模型；功能特性；抗骨质疏松活 性 摘要 a b s tr a c t i nt h isp a p e r ， s t u d ie s o np r e p a r a t i o no fh y d r 0 1ys a teb yu s e o fc o n t r 0 1 1 e dc o m p l ic a te d e n z y m e sh y d r o ly s iso f 曰盘，p 力占“矗三7 “力a s b 1e e k e rp r o t e i n s ，f o o df u n c t i o n a l i t ya n da n t i o s te o p o r o s isa c t i o n w e r ec a r r i e do u t t h es t u d i eso nm a te r i a lp r o t e i np e c u l i a r i t ya n di tsp r o t e i n f r a c ti o ns h o w e dt h a tt h ep r o t e i no f a r e 仃占az u 仃a s jb 1e e k e rc a n b eu s e di nm a n u f a c t u r i n gf u n c t i o n a l f o o d ，g e l a t i n ， b i o a c t i v e p e p t i d e sa n ds e af r e s hc o n d i e n te x c e p tf o rf i s hf i l l i n gbec a u s e t h er a t i o so ft h ec o n te n to ft a s t ea m i n oa c i d sa n dt h ec o n t e n to f h y d r o p h o b ica m i n oa c id s t ot h et o t a lc o n t e n to fa m i n oa c i d si n p r o t e i nw e r e4 4 0 a n d4 1 9 ， r es p e c t i v e l y ， a n dt h a tt h er a t i o s o ft h ec o n te n to fs t r o ap r o te i na n dt h ec o n te n to fm y o f i b r i l a r p r o te i nt ot h et o t a lp r o t e i nw e r e5 2 4 6 a n d4 1 9 ，r e s p e c t i v e l y m e a n w h i let h em 0 1e c u l es iz eo fp r o t e i nf r a c t i o nw a sm y o g e n s t r o m a p r o t e i n a l k a l i s 0 1 u b lep r o te i n m y o f i b r i l a rp r o t e i n 工no r d e rt oes t a b l is h t h ed r o c e s so ft h e c o n t r 0 1 1 e d c o m p l ic a te de n z y m o sh y d r 0 1 y s is ， f i r s tt h e o p t i m u m c o n d i t i o n so f p a p a i n ， f l a v o r e a s ea n dc o m p l ic a t e d e n z y m esw e r e es t a b l is h e db yo r t h o g o n a lt r i a lw i t ht h ec o n s t a n tt i eo f2h o u r s ， s e c o n d l y ， t h eo b t a i n e dh y d r 0 1y s a te sb yt h e ma tv a r y i n gh y d r o l ys is t i m ew e r es t u d ie d t h er e s u l tss h o w e dt h a tt h eu s a g eo ft h e c o m p l ic a t e d e n z y m e s o b t a i n e d b yp a p a i na n df l a v o r e a s em a yb e d e c r e a s e d2 2t i m e st h a ni ts p r e e n z y m e a n di ts o p t i m u mp h a p p r o a c h est ot h ep ho f f i s hm e a td is s o l v e di nw a te r ：t h a tt h e h y d r 0 1 y s i sc o u r s ef o r t h ec o m p l ic a t e de n z y m esisd es c r i b e dw i t h 31 i n e a r r e l a t i o n s h i pb e i n ge x p r es se d a sf o l l o w s ： d h = 0 0 2 6 l t + 8 8 4 8 6 ( t = 1 0 一2 1 0 m i n ，r = 0 9 8 3 4 ) 、m l p l = 一o 0 2 4 1 1 t + 1 1 5 6 1 6 ( t 0 ，r = 一0 9 3 6 9 ) a n dt f a a = o 1 5 5 8 t 十3 8 7 6 ( t = 3 0 2 1o m i n ，r = o 9 8 9 1 ) ： a n dt h e c o m p l ic a t e de n z y m es h a st h e s t r o n g e s t h y d r 0 1 y s i s s p e c i f ic i t y t o w a r dt h ep e p t i d e1 i n k a g es s u p p l i e d b yc ys te i n e ， p h e n y l a l a n i n ea n dt y r o s i n ea n di tc a nb r e a kt h eb o n ds u p p l ie db y t r y p t o p h a n e ， b u tp a p a i na n df l a v o r e a s ec a nn o t t h ek i n e t icm o d e la n d r e l a t i v ed a r a m e te ro f i i i 兰重堡三查堂堡兰垡笙兰 c o n t r o l l e d c o m p l i c a t e de n z y 皿e sh y d r o l y s isa r eo b t a i n e db yu s eo f a n te r i o rr e s u l tsa n d e x p e r i m e n t a la n a l y s is t h er e s u l tsis e x p r ess e d a sf o l l o w s ：t h ek i n e t ic f o r m u l ais d h = 5 8 8 2 1 n 1 + ( 0 0 5 3 6 2 e 。s 。一o 0 0 3 2 ) t a n d r = ( o 3 15 4 e 。一0 0 1 8 6 s 。) e x p ( 一o 17 0 d h ) ： t h ek i n e t ic p a r a m e t e r is kd = o 0 5 3 6 m i n 一1 ： t h en o r m a l h y d r 0 1 y s is r e a c t i o nc o n d i t i o nb y c o p l i c a t e de n z y e s is e 。s 。 c 。a n dc 。= 5 9 0 1 0 _ 。 t h es t u d yo n f u n c t i o n a l i t y o f h y d r 0 1 y s a t eo fp r o t e i nb y c o m p lic a t e de n z y m e ss h o w e dt h a tt h e c o m p lic a t e de n z y m es c a n i m p r o v e s i g n i f ic a n t l yt h es o l v a b i l i t yo fp r o t e i na n dt h e n s io f t h eh y d r o l y s a teisf r o 8 9 3 t o9 8 5 i nt h ep hr a n g e2 一l oa n d t h ed a teish i g h e ra ta c i d icp ht h a na l k a l i n ep h t h eh y d r 0 1 y s is m e t h o do ft h e c o m p l ic a te de n z y m e sc a ni n c r e a ses i g n i f i c a n t l y e m u ls i f y i n ga c t i v i t yi n d e xo ft h eh y d r 0 1 y s a te t h eh y d r 0 1 y s a t eh a s t h eh i g h es te m u ls i f y i n ga c t i v i t yi n d e xw i t hh a r d l ya n yc h a n g ea t a c id icp h ，b u ti th a s t h el o w es te m u ls i f y i n ga c t i v i t yi n d e xa t a l k a l i n ep h t h op hr a n g eo ft h eh ig h e s te u ls i f y i n ga c t i v i t y i n d e xo ft h eh y d r o l y s a teisw i d o rw i t hd hi n c r e a s ea n dt h ed a t e e x ce e d1 1 2 m z g t h em e t h o dc a nd e c r e a s es l i g h t l yt h ee m u ls i f y i n g s t a b i l i t y ， a n d t h ed a t eo fh y d r 0 1 ys a teis h i g h e ra ta l k a l i n ep h t h a na c i d ic p h m o r e v e r ， t h el o w e r d h h y d r 0 1 ys a t e h a s1 0 w e r a n t i h e a t i n ga b i l i t yt h a nt h eh i g h e rd hh y d r o l ys a te t h ef o a i n g c a p a c i t y o f h y d r o l y s a t e i n c r e a s e sw i t h p r o te i nc o n s is te n c y i n c r e a s i n g f r o m1 t o5 ， a n dt h ef o a mism o r es t a b lea t1 o f p r o te i nc o n s is t e n c yt h a n3 a n d5 o ft h a ta f te rt h ef o a mh a sf o r m e d f o r1m i n ， h o w e v e r ，t h ef o a ms t a b i l i t yi n c r e a s esw i t hp r o t e i n c o ns is t e n c yin c r e a s i n ga f t e rt h ef o a mh a sf o r m e df o r15m i n t h e h y d r 0 1 y s a tea t3 o fp r o t e i nc o ns is t e n c ya n d1 9 9 o fd hh a st h e h i g h e s tf o a m i n gc a p a c i t ya tp h l o 0a n dt h e1 0 w e s tf 。a m i 兀gc a p a c i t y a tp h 4 o ， e a n w h i l e ， t h ef o a ms t a b i l i tyist h ep o o r e s ta t p h 4 o a n d8 o ，b u ti tish i g h es ta t p h l 0 0 t o w a r dt h eh y d r 0 1 y s a tea t 1 o fp r o te i nc o n s is t e n c y ，t h ef o a m i n gc a p a c i t yd e c r e a s est ot h e l o w e s tle v e lw i t hd hi n c r e a s i n gf r o o t o8 4 ， b u ti n c r e a s o sw i t h d hi n c r e a s i n gf r o m8 4 t o1 9 9 a f te rt h ef o a mh a sf o r m e d t h e n o n h y d r 0 1ys a t e ist h em o s ts t a b l et h a nt h e h y d r o l y s a te ， a n d i v d h 8 4 一h y d r 0 1 y s a tei sm 0 1 es t a b let h a r t t h e0 t h e rh y d r o l y s a t e t h ea n t i 一0 s t e o p 0 1 0 s isa , c t i v ee v a ll 1 a t i 0 1 1w o , sc a r t ie do u tw i t h m ice ( s o ) r e s u l tss h o wt h a tt h e0 s t e 0 1 9 0 1 - o s ish a sb e e nc o n d u ce db y t h en o n b a l a n ceb o n ei l l e t a b o l is mc 8 , 1 1 s e db yt h es p e e d0 fb o n e a b s o r p t i o r le x c e e d i n gt h a t0 fb o i l ef o r m a t i o nin0 v a r ie c t o m ym ic e ： t h e玎1 ic ec a nr ec o v e r a g a i r lf r o l no s te o p 0 1 0 s is b y d ie t h y ls t i l bo s t r 0 1 ( 1 0 u g k g d ) w h i c h c a nl e a dt 0n o r m a lb o n e m e t a b o l is g lt h r o u g hs t r e n g t h e n in gt h eb o n e f o r m a t i o n ，b 1 1 t t h e h o r m o n 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a n dd ie t h y ls t i l be s t r o l ( 1 0 u g k g d ) c o j n s t r e n g t h e l l t h eb o n e f o r m a t i o f to fm i c ea n dd e c - e a s et h es t i m u l a t i o no nu te i u s0 fi n ic e k o y w or d s ：h y d r 0 1y s a te ，c o n t r o l l e dh y d r 0 1 y s is ，k i l i e t ic m o d e l ， r u n e t i o h a l i t y 8 r t t i o s t e 0 1 3 0 r 0 s isa c t i o n v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：卅南凄日期：3 卿年6 月堵 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学刚以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制丁段保存 和汇编木学位论文。 保密可，在二二_ 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“d ”) 作者签名：卅南凑日期：坷年6 月曲 几 翩虢彳； 蒡嘿坼6 月衄 f 第一章引言 第一章引言 水解鱼蛋白是以鱼肉、鱼粉或鱼卜i 脚料为原料经水解而制得的蛋白水解物， 属水解动物蛋白( h a p , h y d r o l y z e d a n i m a lp r o t e i n ) 。由于世界蛋白质缺乏仍然是 全人类的共同面临的严峻问题，而鱼类资源量大而质优，有着巨大的开发潜力。 自1 9 4 6 年f a o 倡导开发渔业资源以来，世界各国已开展了大量的鱼类加工研究 6 i 。鱼蛋白经酶催化水解后，功能和品质都会得到大幅度的改善 7j 。长期以米， 人们一直认为蛋白质进入人体后，必须消化为氨基酸才能被人体吸收和利用，然 而，自2 0 世纪5 0 一6 0 年代，n e w a y 和s m i t h 首次提出了肽也可以被吸收的概念， 直到8 0 年代，肽被完整吸收的理沦及其生理功能的爿被人们所重视，有关方面的 研究也活跃起来。根据研究，数个氨基酸结合存一起的短肽比氨基酸具有更高的 吸收速度，且营养及生理功能更好1 8 1 。这种短肽不仅易于发收，雨且还有抗过敏、 降低胆固醇、降低血压、增强免疫等生理功能。因此，水解蛋白质为有控水解产 物比全部水解为氨基酸更有意义。蛋白质有挖水解产物的研究与开发最初是以大 豆蛋白、乳蛋白、蛋清蛋白为主要原料，尤其是以乳蛋白的有控水解产物及其活 性肽的研究最为活跃。最近几年，人们开始了畜血和水产品的有挖水解蛋白产物 的研究，并取得了一定的成果。蛋白质有控水解产物及活性肽的研究以同本、西 欧和美国最为活跃，例如日本，以蛋白有控水解产物为基料的医药品市场规模每 年已经超过2 0 0 亿日圆，食品也达到8 0 亿h 剧。在这方面我国相对滞后，目前也 主要集中于大豆蛋白、乳蛋白、蛋清蛋白等的有控水解产物及其相关的生理活性 肽的研究，但对鱼蛋白的有控水解产物及活性肽的研究尚属起步阶段。 我国每年捕获的低值海产品产量十分丰富，f 1 前主要用来制作鱼粉等低值产 品，产品的得率和附加值没有得到有效的提高。长期以来，大部分低值负类( 如鱼 是鱼、小杂鱼虾等) 只是用于简单加工成为经济效益极低的饲料鱼粉，由于加工和 回收手段的落后，产品使用价值低，并造成大量营养成分流失，资源浪费严重， 且污染了环境。同时出于经济鱼类的衰退，加大对低值鱼的开发研究己势在必行 ”】。近儿年来，利用酶水解制取可溶性蛋白，进行海洋低值蚩白源高值化利用的 研究已有不少报道f l - 4 ，主要是对鲤鱼的研究。 国外对鱼蛋白水解产物的利用主要集中于近海鱼，这与当地的资源与条件有 关。1 9 8 7 年q u a g l a ”1 0 】在研究沙丁鱼时发现低水解度的鱼蛋白在不同离子强度的 溶液中都具有良好的溶解度；1 9 9 0 年q u a g l a 1 ”又发现随着水解度的增加，沙丁 鱼蛋白质水解产物乳化稳定性降低；1 9 9 7 年b e n j a k u l 2 j 以牙鳕废弃物为原料采用 中性蛋白酶和碱性蛋白酶在最优条件下水解制得的蛋白水解产物蛋向质含量达到 7 9 9 7 ，氨基酸组成与肌肉十分相似。 华南理工大学博士学位论文 国内对鱼蛋白水解的研究较早的有陈建华 13 】以去内脏鲢鱼为原料采用胰蛋 白酶水解法制造混合氨基酸；何建君】以去头去内脏鲢鱼为原料采用胰蛋白酶水 解法制造蛋白质含量为8 5 1 的水解产物；1 9 9 5 年王长云等【1 4 1 采用蛋白酶法从鳕 鱼废弃物中提取优良水解蛋白粉；1 9 9 7 年何建君等【1 纠以小杂鱼或鲢鱼下脚料为原 料采用加酶水解法和恒温发酵法制造淡水鱼鱼露。 青鳞鱼( h a r e n g u l az u n a s ib l e e k e r ) 属鲱科鲱亚科青鳞鱼属，义名青皮或柳叶 鱼。为暖水中上层小型鱼类，分布于菲律宾、日本、朝鲜和中国沿海。资源丰富， 年可捕量约为3 - 4 万t ，而且有很强的再生能力，不会囚捕获而使资源枯竭。但 是它个体小又多细小骨刺，脂肪及血合肉含量高放不宜鲜食，更不耐贮藏。目 前多加工成成干品或谈干品，少部分加工成罐头或鱼粉。这些加工方法都未从根 本上改变其食用上的缺陷，加工品的价格仍然较为低廉，附加价值很低。为了扩 大青鳞鱼的利用途径，提高其经济价值，利用其含蛋白质丰富的特点，采用现代 生物技术方法对青鳞鱼蛋白质进行改性是非常必要的。同时，为其它低值海洋生 物的蛋白质资源的高值化研究提供理论和技术的启迪。 1 1 国内外研究动态及趋势 1 1 1 鱼蛋白水解方式的研究进展 原料蛋白质的水解方法一般包括化学降解法和酶降解法2 类。化学降解浊是 利用酸碱在温度较高的条件下进行的，蛋白质经盐酸或，和强碱作用完全水解为氨 基酸和少量二肽，蛋白质水解度超过7 0 。化学降解法虽简单价廉、能使蛋白质 彻底水解，但存在许多缺陷：( 1 ) 反应条件剧烈，对设备要求高，环境污染严重； ( 2 ) 反应过程中氨基酸发生构型的转变，由l 一氨基酸转变为d 一氨基酸，l 刊时还 生成l y s a l a 等有毒物质；( 3 ) 在蛋白质被水解的同时，碳水化合物也被水解， 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生成黑腐物；( 4 ) 水解产物成分复杂，盐含量高，使 用范围受到限制；( 5 ) 脂肪含量较高时，易产生致癌物质：( 6 ) 反应进程难以控 制，难以实现产物的目标控制：此外，化学降解法使一些功能性因子( 如维生素、 功能肽等) 几乎完全被破坏。2 0 世纪9 0 年代中后期普遍采用条件较为温和的酶 法改性鱼类蛋白。它能在一定条件下实现蛋白质的定位水解产生特定的肽，水解 反应的进程易于控制，反廊产物与原料蛋白具有相同的氨基酸构成但功能特性得 到良好的改善，具有特殊的理化性质和生理活性，已经成为了蛋白质制品的主要 发展方向。 在酶法改性鱼蛋白过程中，酶的选择是关键。它不仅影响反应的速度、终产 物的得率，而且还卣接影响到产品的风味、理化特性和生理活性。蛋白质水解酶 可来源于植物( 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等) 、动物( 胰蛋白酶、 胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等) 和微牛物( 枯草杆菌中性蛋白酶、碱性蛋白酶等) 。 第一章引言 1 9 9 1 年r e b e c a 等人对鱼蛋白水解酶进行了选择，并研究了产物的营养价值，杉 山圭吉进行了三种碱性蛋白酶、两种中性蛋白酶和三种酸性蛋白酶对沙丁鱼蛋白 水解的比较研究，指出碱性蛋白酶改性的鱼蛋白溶解性好、营养价值高，同时对 产物肽的分布和脱苦进行了研究：1 9 9 2 年熊光权等人用胰蛋白酶、胃蛋白酶和木 瓜蛋白酶对鲢鱼水解，证明胰蛋白酶水解效果较好：1 9 9 4 年h o y l e 以鲱鱼为原料 认为水解前脂肪的抽提可降低水解度、但脱去脂肪的水解产物腥味比未脱去腊肪 的小得多：1 9 9 5 年b e a k 以c r a y f i s h 的废弃物为原料，分别采用5 种碱性蛋白酶 和5 种中性蛋白酶进行蛋白质的降解，确立了与水解度相关的二次同归方程；同 年s h a h i d i 对c a p e l i n 用中性、碱性蛋白酶水解，蛋白质回收率可达7 0 ，6 ；1 9 9 6 年邓尚贵等【l6 以去头去内脏青鳞鱼为原料采用枯草杆菌中性蛋白酶和胃蛋白酶 的双酶水解法制造了青鳞鱼h a p ，蛋白质水解度达到9 4 1 ，同时发现利用| 一j 样 的双酶法对全鱼和去内脏鱼蛋白质的水解度分别为6 2 5 和8 3 8 ，研究还发现 在h a p 的脱色与脱腥力面b c d 和活性碳的联合处理几乎可以完全脱除水解产 物的颜色和腥味；1 9 9 8 年邓尚贵等i 7 在研究双酶法在水产品水解动物蛋白制作工 艺巾的应，崩时又发现酵母粉对青鳞鱼水解蛋白的脱腥具有良好的效果，同时发现 风味酶对水勰产物的脱苦具有良好的作用；2 0 0 2 年邓尚贵等【t 8 创立了青鳞鱼下脚 料的多酶水觯法，并以卜脚料水解产物为基料制作了鱼露( f i s h g r a v y ) ，多酶浊包 括同时使用枯草杆菌中性蛋白酶和碱性蛋白酶，然后用风味酶对水解产物进行脱 苦与脱腥，取得了良好的效果。 综上所述，鱼蛋白的水解方式的研究具有几个明最的特点：从水解方法看， 传统的化学降解法已经完全被酶降解法所代替，而且由自溶法、单酶法、双酶法 向多酶法方向发展；从使用的原料看，由鱼肉向加工的废弃物发展，体现出综 合利用的特色；从使用的酶制剂看，由动植物蛋白酶向微生物酶发展，既克服 了动植物蛋白酶成奉高、难购买的缺点，又解决了水解产物的苦味问题：一般 认为降解酶的最适宜p h 在中性偏碱性范围内刚得到的改性鱼蛋白具有良好的溶 解性、较高的营养价值；如果鱼肉中胶元蛋白含量较高时，再使用胃虽白酶，可 列鱼肉蛋白进行j 良好的水解和功能性质的改善；从产品的功能性质和使用的范 围看，水溶性逐渐得到加强，水解产物的使用的范围不断扩人；从水解程度看， 由于生理活性肤具有特殊的生理功能和吸收利州机制，因而对蛋白质的水解度已 经从追求高水解度向蛋白质的有控水解的方向过度和发展。 1 1 2 改性鱼蛋白功能特性的研究进展 蛋白质的功能特性般是指除营养性外的影l 【它的利用的所有食品或食品 成分的特性。显然，琏i 可应用于鱼蛋白的水解产物改性鱼蛋白；此外，还j 越该 将改性鱼蛋白的功能特性进行拓展，如影响最终产品加上、储1 竽性能和营养以及 华南理工大学博士学位论文 生理活性等等。 改性鱼蛋白的主要功能特性如溶解度、粘性、乳化性、泡沫性、凝胶性和风 味特征是完整蛋白常见的，但由于酶的改性，这些特性与完接蛋白又有所区别， 主要表现在上述功能特性要取决于改性后产物分子的大小或蛋白质水解度，当然 也受到所使用的酶的种类及完整蛋白的理化本质和水解条件的影响。随着肽键的 水解，发生了三个主要的变化，即：( 1 ) 随着水解度的增加，可离解基团( 一c o o h 、 n h 4 ) 数目也增加；( 2 ) 随着抗原性的降低，多肽链分子数减少；( 3 ) 分子结构 的改变导致内部疏水中心暴露于溶液。 1 9 7 7 年j o s t 1 ”和1 9 8 4 年k e s t e r 2 0 1 以乳清蛋白为原料，1 9 8 8 年c h o b e r t 2 1 1 以 酪蛋白为原料，1 9 8 6 年a d l e r n i s s e n 2 2 1 以火豆蛋自为原料，1 9 8 7 年q u a g l i a ( ”j 以沙丁鱼为原料、1 9 9 5 年s h a h i d i l 23 】以毛鳞鱼为原料分别研究了其水解产物与母 本蛋门的溶解性的关系：1 9 9 6 年曲永洵24 1 、1 9 9 4 年冯志彪2 5 1 得出水解产物与母 本蛋白相比粘性急剧下降，显然是因为肽键的水解降低了蛋白质的疏水性，增加 了净电荷，使水解产物缺乏蛋白质胶凝时应有的疏水性和排斥与吸引力间的严格 平镛；2 0 0 1 年赵玉红等【2 q 以鲢鱼下脚料为原料采用酶水解制作了鲢鱼水解产物， 并研究了水解产物的溶解性、稳定性、粘性、发泡性及泡沫稳定性等功能特性， 发现水解产物具有很好的溶解性，在p h 2 o o 1 0 0 0 的范闹内溶解性均大于9 4 ； 具有优良的热稳定性和冷藏稳定性；水解产物的粘性较母本蛋白急剧下降，水解 产物较原蛋白具有更好的起泡性。 1 1 3 蛋白质深度水解与生理活性研究进展 生物活性肽( b i o a c t i v ep e p t i d e s ) 是指那些有特殊的生理活性的肽类 3 ”，按它 们的主要来源，可分为天然存在的活性肽和蛋白质酶解活性肽，后者是从蛋白质 的酶解产物一一深度水解产物产物分离而得到。近年来，许多具有生理活性的多 肽已通过蛋白酶解而生产出来。这些活性肽大多来自陆地蛋白源的深度改性产物， 包括： ( 1 ) 免疫刺激活性的多肽( i m m u n o s t i m u l a t i n gp e p t i d e s ) ，1 9 9 7 年m e i s e l 4 j 和1 9 9 8 年m i g l i o r e 等【3 5 1 从乳蛋白的胰蛋白酶水解物中分离得到了大量具有免疫 调节功能的活性肽，其中从酪蛋白的水解产物中得到一个六肽，在体外实验中有 明显促进人和绵羊淋巴细胞的增殖和提高巨嗜细胞的吞噬活性，在体内可以提高 试验鼠抵抗肺炎菌感染的作用。乳蛋白来源的免疫活性肽包括人乳蛋向来源的 v a l g l u p r o i l e p r o t y r 和g l y l e u p h e 及牛乳蛋白来源的l e u l e u t y r 和 t h r t h r m e t p r o l e u t r p 它们具有刺激鼠腹膜巨细胞吞噬绵羊红细胞的功能，可 使老鼠免受k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 的感染。另外还有b c a s o k i n i n 一1 0 和乳铁蛋向 及其多肽l a c t o f e r r i c i nb r 5 5 2 1 。人免疫球蛋白来源的免疫活性肽有 4 第一章引言 t h r b s p r o a r g 和g l y g i n p r o a r g 。大豆蛋白和大米蛋白来源的免疫活性肽有 o l n a r g p r o a r g ( 大豆球蛋白a l a 业基) 、h i s c y s g i n a r g p r o a r g ( 大豆蛋白胰蛋 白酶解物) 和g l y t y r 。p r o m e t t y r p r o l e u a r g ( 大米白蛋白) 等5 3 1 。 ( 2 ) 抗血栓肽，j o l l e s f 9 13 发现来源0 二k 。酪蛋白的1 l 肽可抑制a d p 诱导的 血小板凝集及其与纤维蛋白原结合的作用，即具有抑制血液凝圃及抗血栓形成的 作用，这种肽的结构是m e t a l a i l e p r o p r o l y s l y s a s n g i n a s p l y s ；另外，来 源于k 酪蛋白的5 肽( l y s a s p g i n a s p l y s ) 也具有抗血栓的作t l _ l j 【8 8 】：存在于 人乳铁蛋白中的四肽l y s a r g a s p s e r 也具有抑制a d p 诱导的血小板凝集作用 1 9 2 。 ( 3 ) 抗高血压活性肽( a n t i h y p e r t e n s i v e p e p f j d e s ) ，能抑制血管紧张素t 转化 酶的活性来体现降压功能3 6 】，许多蛋白源的酶觯广物中含有a c e 抑制性多肽。 乳蛋白的抗高血压肽4 2 1 有： cl2 肽：p h e p h e - v a l a l a p r o p h e p r o - g l u v a j p h e g l y l y s c 7 肽：a l a v a l p r o t y r - p r o - g l u a r g 和l y s v a l l e u p r o v a l p r o g l n c 6 肽：t h r t h r m e t p r o l e u t r p c 5 肽：p h e p h e v a l ，a l a p r o a l a c t o r p h i n ：t y r g l y l e u p h e b l a c t o r p h i n ：a l a l e u p r o m e t h i s - i l e a r g 来自酸奶的：c 3 肽v a l p r o p r o 和i l e p r o p r o 玉米蛋白，特别是n 、y = 氏米醇溶蛋白的深度改性产物都是有抗高血压作 用，如p r o ，p r o v a l h i s l e u ，l e u g i n g i n v a l s e r p r o ，v a l s e r p r o ，l e u g i n