RT-PCR原理及方法.ppt

RT-PCR原理及方法,09-10-15,背景,基因的表达,不同细胞或组织表达不同的基因,目的,通过反转录(reversetranscription，RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。,原理及方法,原理及方法,步骤1-提取总RNA,TRIzol法抽提总RNA1、细胞1107或组织100mg,加1mlTRIzol(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟。2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。3、4，离心12000g，15分钟。4、转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400l），混匀室温10分钟。5、4，离心12000g，10分钟。6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。7、4离心7500g，5分钟。8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20l（可在55-60水中，10分钟助溶）。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。,步骤2反转录(RT),逆转录反应：1、试剂浓度体积终浓度RNA23l(11.5l)Oligo(dT)150.05g/l4l(2l)0.005g/l混匀，离心，705min。2、立即冰水浴，稍离心试剂浓度体积终浓度M-MLVBuffer58l(4l)1dNTP10mM2l(1l)0.5mMRNasin40U/l1l(0.5l)20M-MLV200U/l2l(1l)200U总体积40l（20l）混匀，离心，4260-90min。3、9510min（破坏MLV），4保存。,步骤3聚合酶链反应(PCR),PCR反应：反应体系：总体积20l(50l)试剂浓度体积终浓度TaqBuffer102l(5l_)1dNTP10mM0.2l(0.5l)200uM上游引物10pmol/l0.3l(1l)10pmol下游引物10pmol/l0.3l(1l)10pmolcDNA模板(1-10l)Taq酶2.5U/l0.3l(1l)2.5U/lDEPC水20l-4.3l混匀反应条件：955分预变性9430秒变性X40秒退火7230秒延伸727分终末延伸28-36循环，4保温,步骤4琼脂糖凝胶电泳,加1-10lPCR产物与上样缓冲液（1-2.5l）混匀，加样，电泳。,所需材料及试剂,一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200l、20l、10l、2l2、吸头：1ml、200l、20l3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20l吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100l6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大,所需材料及试剂,二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1DEPC过夜，再高压）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤,所需材料及试剂,三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖,所需材料及试剂,四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5TBE（贮存液）再将5TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水-500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6缓冲液，4保存,所需材料及试剂,五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60时加入10mg/ml溴化乙锭(GoldenView)5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后进行电泳。2、1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g(分辨率要求高时使用),所需材料及试剂,六、需购置的Rt-PCR材料：Taq酶（含MgCl2Buffer）200udNTP:1支oligo(dT)18:1ODpromegaM-MLV:1支promega(Buffer)RNasin:1支-20DEPC5gTrizol100ml/1瓶Invitrogen-4Marker:10g0.2g/mlTIANGEN,所需材料及试剂,七、引物合成1、-actin:正义：5-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3反义：5-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-32、par-4:正义：5-GGGACCTCGGAACTCAAC-3反义：5-TGTATCTGCCTGGGACTG-33、退火温度计算2（A+T）+4（G+C）正反义平均数，再上下波动度（4，或5）4、引物各合成5OD，每OD一瓶分装好5、引物稀释：加DEPC水量为（l）=?nmol/OD管上所标OD数100是为10pmol/l浓度的引物溶液,所需材料及试剂,八、PCR产物电泳先将1-10l左右PCR产物，加已点在