（分析化学专业论文）基于三氧化钨纳米的活性氧传感器.pdf

摘要 摘要 纳米三氧化钨( w 0 3 ) 是一种比表面积大、价格低廉、化学和热稳定性高的 纳米半导体材料。本文通过简单方便的旋转涂膜法制备了纳米w 0 3 膜，通过 扫描电子显微镜( s e m ) ，x 射线衍射仪( x r d ) ，紫外可见分光光度计 ( u v - v i s ) ，电化学工作站( c h i6 6 0 ) 等仪器，对纳米w 0 3 膜的表面形貌和晶形 以及电化学性质进行了表征，并且在w 0 3 膜上修饰细胞色素c ( c y t c ) ，对吸附 在w 0 3 膜上的cy t c 的电化学行为进行了研究。实验结果表明：cy t c 可以在 这种纳米多孑l 的w 0 3 膜电极上实现直接、快速的电子传递，氧化还原峰的表 观电位为1 3 3 5m v ( 相对于银氯化银参比电极) ，异相电子传递速率常数为 5 5 7s ；电化学研究发现，c y t c 能够稳定地吸附在w 0 3 膜表面；通过紫外可 见光谱研究发现，吸附在w0 3 膜上的cy t c 保持了良好的生物催化活性。在此 基础上，成功地构建了过氧化氢( h 2 0 2 ) 生物传感器。研究了外加电位与传感器 选择性的关系，优化了选择的电位，分别在不同的电位下测定了cy t c 对h2 0 2 的催化还原响应以及氧气、抗坏血酸、尿酸等8 种生物体内共存物质的干扰实 验。这种h 2 0 2 生物传感器有着较宽的线性范围( 0 3 3 0 0g m ) ，较低的检测限 ( 0 2 4g m ) ，较高的灵敏度( 6 3 5lm ac m 之m d ) 、较快的响应时间( 5s ) 、较好 的选择性和稳定性。这些显著的分析优势加上纳米w 0 3 具有生物兼容性、易 制备、易微型化等优越的性质，为在病理生理条件下实现连续、在线检测h2 0 2 奠定了峰实的基础。 关键词：纳米三氧化钨，细胞色素c ，直接电子传递，过氧化氢，生物传感器 a b s t r a c t a b s t r a c t n a n o s t r u c t u r e dw 0 3i sas e m i c o n d u c t o rm a t e r i a lw i t hf a s c i n a t i n gp r o p e r t i e s s u c ha sh i g hr a t i os u r f a c ea r e at ov o l u m e ，l o w c o s t ，c h e m i c a la n dt h e r m a ls t a b i l i t y a n a n o p o r o u sw 0 3f i l mw a sp r e p a r e db ys i m p l es p i n c o a t i n gm e t h o da n dc h a r a c t e r i z e d b ys e m ，x r d ，u v - v i s ，e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o de t c t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r s o fc y t ca d s o r b e do nt h ew 0 3f i l mw e r es t u d i e d d i r e c ta n df a s te l e c t r o nt r a n s f e ro f c y t cw a sr e a l i z e da tt h en a n o s t r u c t u r e dw 0 3s u r f a c ew i t ht h er e d o xf o r m a lp o t e n t i a l o f 一1 3 3 5m vv e r s u sa g a g c ia n dh e t e r o g e n e o u st r a n s f e rr a t ec o n s t a n to f5 5 7s b y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o dw ec o u l dc o u f i r mt h a tc y t cw a sa d s o r b e ds t a b l yo nt h e n a n o p o r o u sm a t e r i a l s p e c t r u ms t u d i e si n d i c a t e dt h a tc y t cw a si m m o b i l i z e do n t ot h e w 0 3f i l ma n dk e p tb i o a c t i v i t y o nt h e s eb a s e s ，w es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e dh 2 0 2 b i o s e n s o r t oo p t i m i z et h eo p e r a t i n gp o t e n t i a lw ed e t e r m i n e dt h ee l e c t r o c h e m i c a l r e s p o n s e so fh 2 0 2a n de i g h tk i n d so fi n t e r f e r e n c e si n c l u d i n gu a ，a a ，d a ，d o p a c ， n 0 3 。，n 0 2 ，$ 0 3 z ，a n d0 2a td i f f e r e n ta p p l i e dp o t e n t i a l s t h eh 2 0 2b i o s e n s o rs h o w e d e x c e l l e n t a n a l y t i c a lp r o p e r t i e s s u c ha sw i d el i n e a rr a n g e ( o 3 3 0 0 p m ) ，h i g h s e n s i t i v i t y ( 6 3 51m ac m 吒m 叫) ，l o wd e t e c t i o nl i m i t ( o 2 4p m ) ，f a s tr e s p o n s et i m e ( - 5 s ) ，g o o ds e l e c t i v i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y t h er e m a r k a b l ea n a l y t i c a la d v a n t a g e s ，a sw e l l a st h en o t a b l ec h a r a c t e r i s t i c so fw 0 3n a n o p a r t i c l sf i l ms u c ha sb i o c o m p a t i b i l i t y ， f a c i l et op r e p a r a t i o na n dm i n i a t u r eg i v eas t r o n gb a s i sf o rc o n t i n u o u s ，o n l i n e d e t e c t i o no fh 2 0 2u n d e r p a t h o p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：w 0 3n a n o p a r t i c l s ，c y t c ，d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r , h 2 0 2 ，b i o s e n s o r i i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 导师签名： 妥谴酪 年岁月6 日 年月日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：夔溘酵 2 户夕年3 月l 日 第一章前言 1 1课题背景 1 1 1生物传感器概述 第一章前言 生物传感器是指由生物活性材料( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、激素、 细胞、生物组织) 作为敏感基元构成分子识别系统，对被测物进行高选择性的 识别，通过各种化学或物理转换器捕捉目标物与敏感基元之间的作用，并将作 用程度用离散或连续信号表达出来，从而得出被测物的种类和含量的装置，2 j 。 生物传感器是一类特殊形式的传感器，它能将被测物的浓度与可测量的电信号 关联起来。 与传统分析方法相比，生物传感器具有以下主要特点：多样性，根据生物 反应的特异性和多样性，理论上可以制成测定所有生物物质的酶传感器；无试 剂分析，除了缓冲液以外，大多数酶传感器不需要添加其他分析试剂；操作简 便、快速、准确、易于联机；可以重复使用、连续使用，也可以一次性使用。 生物传感器是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控方法，也是物质 在分子水平的快速、微量分析方法。 生物传感器是一个非常活跃的研究领域，它的研究结合了生物信息学、生 物芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机等多学科成果，处在生命科学和信 息科学的交叉区域。它们的共同特征是：探索和揭示出生命系统中信息的产生、 存储、传输、加工、转换和控制等基本规律，探讨应用于人类经济活动的基本 方法”】。生物传感器的研究起源于2 0 世纪6 0 年代，并经历了以下三个发展 过程： 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 6 j 提出了葡萄糖生物传感器的原理，他们表示用 一薄层葡萄糖氧化酶( g o d ) 覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧 的消耗量，间接测定葡萄糖的含量。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s1 7 j 根据此原理首 次将g o d 膜覆盖在铂电极上制成酶传感器，用于定量检测血清中葡萄糖的含 量，成功地制成了第一支葡萄糖生物传感器，这标志着第一代生物传感器的诞 第一章前言 生。第一代葡萄糖生物传感器对葡萄糖响应的机理为：0 2 在g o d 作用下，催 化氧化葡萄糖，生成h2 0 2 ，如图1 1 所示。由于还原态葡萄糖氧化酶( g o d 他d ) 的氧化还原活性中心在酶分子内部，被蛋白质包围，不易直接与常规电极交换 电子，因而得不到可测量的电信号，可以通过测量反应物中0 2 的减少量或生 成物中h 2 0 2 的产生量这两种方法获得电信号。第一代生物传感器在测量时受 诸多外部环境因素的制约，所以，其测量的准确度和灵敏度不够理想，但无论 如何，它的诞生推动了人们对传感技术的研究。 0 2 + 葡萄糖+ g o d o x h 2 0 2 + 葡萄糖酸+ g o d ，。d 0 2 + g o d r e d h2 0 2 + g o d o x 图1 1 第一代生物传感器示意图 第二代生物传感器是从2 0 世纪8 0 年代发展起来的，也称为介体型传感 器，此类生物传感器将生物成分直接吸附或共价结合到电子媒介体的表面，利 用氧化还原电子媒介体实现在酶的氧化还原活性中心与电极之间的电子传递瞵j ， 通过测定媒介体的氧化还原电流间接测定底物，无需非活性的基质膜，测定时 不必向样品中加入其他试剂，提高了灵敏度和线性范围，基本原理见图1 2 。 但同时也存在着介体流失及易受其他电活性物质干扰的问题。 这一时期，分子识别组件已不再局限于酶蛋白，抗原、抗体、d n a 片断、 生物组织等均在生物传感器中有了应用，同时换能器的选用也朝向多样化、微 型化发展，诸如场效应半导体( f e t ) ，光纤( f o s ) ，压晶体管( p z ) ，表面声波 器( s a w ) 等。 2 第一章前言 刊 _ m 例 图1 2 第二代生物传感器示意图 底物 产物 第三代生物传感器发展于2 0 世纪90 年代以后，由于酶与常规电极之间的 直接电子传递较为困难，考虑选择合适的接合剂，将酶共价键合到化学修饰电极 上或将酶固定到多孔电聚合物修饰电极上，使酶氧化还原活性中心与电极接近， 直接电子传递就能够相对容易地进行。第三代生物传感器是指在无媒介体存在 下，利用酶与电极间的直接电子传递设计制作的酶传感器。近年来，主要用以下 材料实现酶在电极上的固定化，以实现电极上的直接电子传递：有机导电聚合物 膜、有机导电复合材料膜、金属纳米颗粒或金属和非金属纳米颗粒。把生物成分 直接固定在电子元件上，实现了酶蛋白活性中心与电极之间的直接电子传递，从 而把生物识别和信号的转换处理结合在一起，直接感知和放大界面被测物质的变 化，实现实时测定，其原理见图1 3 。 迄今为止，直接电子传递蛋白质传感器还远未达到其潜在的能力，相关的研 究正处于生物传感器的前沿。 电 极 表 面 e o x 图1 3 第三代生物传感器示意图 底物 产物 第一章前言 从1 9 6 2 年生物传感器问世以来i9 1 ，生物传感器所具有的选择性好、易操作、 设备简单、测量快速准确、适用范围广等特点，使得其在发酵工艺、环境监测、 食品分析、临床医学、军事及军事医学等方面都得到了高度重视和广泛应用， 如：在食品工业生产中，生物传感器可对食品原料、半成品和产品质量进行检 测；在发酵生产中利用生物传感器进行在线监测；在临床应用上，可利用酶、 免疫等生物传感器检测体液中的各种化学成分，为医学诊断提供依据。随着固 定化技术的发展，生物传感器有望实现商品化，参与市场竞争，造福于人类。 1 1 2 活性氧 1 1 2 1 活性氧的概念 活性氧( r o s ) 是由氧形成、含氧且具有高度活跃的化学性质的一类物质的 总利1 0 】。活性氧包括超氧阴离子自由基( 0 2 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、羟基自由 基( o h ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 等，其中，h 2 0 2 是最稳定的。 1 1 2 2 活性氧分析的意义 正常情况下，生物体内有一套完整的抗氧化体系，可以维持自由基的代谢 平衡，细胞内r o s 的水平被控制在很低的范围，并在抗菌、消炎和抑制肿瘤等 方面具有重要意义。但在疾病或某些外源性药物和毒物入侵后，r o s 生成可以 快速地增加；进一步导致氧化应激和抗氧化防御间平衡失调，从而引起生物膜 和大分子物质发生脂质过氧化损伤。r o s 的产生和代谢失衡引起多种器官功能 异常或组织病变。r o s 与多种疾病有关，在动脉粥样硬化，糖尿病、冠心病、 皮肤病、呼吸道疾病等疾病中，r o s 都起着重要作用，尤其是在癌症和心血管 疾病等发病高的疾病中的作用，引起当今各国科学家的关注l l 。随着人们社会 生活的发展变化，心血管疾病同趋严重地危害着人类的寿命和生存质量，在许 多发达国家，心血管疾病已成为导致死亡的一个重要原因。近年来的研究发现， 在肿瘤细胞中，r o s 的含量明显高于正常的组织细胞，癌变细胞的r o s 促进 核d n a 的突变和细胞分裂，使肿瘤细胞获得选择性增生的优势。在艾滋病患 者中，艾滋病细胞产生的r os 减少，使免疫能力下降，容易感染其他各种疾病。 同时，少量的r o s 可刺激艾滋病毒复制，使患者病情恶化。基于上述对活性氧 的认识，许多国内外学者都纷纷开始开发和研制一些抗氧化的新型药剂，用以 4 第一章前言 清除过多的活性氧。活性氧与人体健康息息相关，因此构建检测方便快捷的活 性氧生物传感器对人类健康具有重要的意义。 1 1 3 w 0 3 纳米材料 1 1 3 1w 0 3 纳米材料的性质 纳米粒子一般是指尺寸在l 1 0 0 衄间的粒子。在纳米尺度下，物质中电 子的量子力学性质和原子的相互作用将受到尺度大小的影响，从而使其具有许 多与传统材料不同的物理、化学性质。作为纳米半导体材料的一员，纳米w o3 具有纳米材料的四大特性【l2 j ： ( 1 ) 表面效应：更容易吸附其他原子或与其它原子反应 表面效应是指纳米粒子的表面原子数与总原子数之比随粒子尺寸的减小而 大幅度地增加( 对于直径为1 0 啪的粒子，表面原子所占百分数为2 0 ；直 径为ln i t l 的粒子，表面原子所占百分数为1 0 0 ) ，粒子的表面能和表面张力 随之增加，材料的光、电化学性质发生变化。由于表面原子的周围缺少相邻的 原子，使得物质出现大量剩余的悬键而具有不饱和的性质。同时，表面原子具 有高度活性且极不稳定，它们很容易与外界的原子结合形成稳定的结构。 ( 2 ) 小尺寸效应：颗粒尺寸变小，导致物质的客观物理性质的变化 随着颗粒尺寸的变小，在一定条件下会引起颗粒性质的变化。对纳米颗粒 而言，尺寸变小的同时，其比表面积亦显著地增加，表面原子的电子能级离散 能隙变宽，品格改变，表面原子密度减小，在熔点、磁性、热阻、电学性能、 光学性能、化学性能和催化性能等都发生了较大的变化，从而产生一系列新的 性质。 ( 3 ) 量子尺寸效应：纳米尺度材料导致能级的量子化 当半导体材料从体相减d , n 某一临界尺寸( 如与电子的德布罗意波长、电子 的非弹性散射平均自由程和体相激子的玻尔半径相等) 以后，其中的电子空穴和 激子等载流子的运动将受到强量子封闭性的限制，同时导致其能量的增加，与 此相应的电子结构也从体相的连续能带结构变成类似于分子的准分裂能级，使 原来的能隙变宽，即光吸收谱向短波方向移动，这就是量子尺寸效应。量子尺 寸效应导致纳米颗粒的磁、光、电、声、热以及超导电性等特征与大块材料显 著不同。 第一章前言 ( 4 ) 宏观量子隧道效应：微观粒子穿越势能的能力 隧道效应是基本的量子现象之一，即当微观粒子的总能量小于势垒高度时， 该粒子仍能穿越这势垒。近年来，人们发现一些宏观量，例如微颗粒的磁化强 度、量子相干器件中的磁通量以及电荷等亦具有隧道效应，它们可以穿越宏观 系统的势垒而产生变化，故称为宏观的量子隧道效应。这一效应与量子尺寸效 应一起，确定了微电子器件进一步微型化的极限，也限定了采用磁带磁盘进行 信息储存的最短时间。 除了上述的四大特性外，纳米w o3 还具有很好的生物兼容性( 有利于保持 蛋白质的活性) 、易修饰、低等电点( i e p ) ( 有利于高等电点蛋白质的修饰) 、价 格低廉、化学稳定性等性质。这些性质为在w o3 纳米材料上修饰蛋白质，制 作第三代生物传感器创造了良好的条件。 1 1 3 2 w 0 3 纳米材料的制备方法 目前制备纳米三氧化钨薄膜的方法 1 3 , 1 4 】有：蒸发法、溅射法、溶胶凝胶法、 电子束蒸发法、化学蒸气沉积法、阳极氧化法、电沉积法、脉冲准分子激光沉 积法、离子镀法等。由于很多方法技术复杂、工艺条件苛刻，因此其应用受到 限制，使用较多的是蒸发法、磁控溅射法、溶胶凝胶法等，溅射法和蒸发法都 具有快速、稳定、薄膜纯度高的优点，但仪器庞大、昂贵，成本高，所以很多 小型实验室采用仪器简单、成本低、易大面积成膜的溶胶凝胶法。 溅射法是指高能粒子轰击固体表面( 靶) ，使固体原子( 或分子) 从表面射出， 并沉积到衬底或工件表面形成薄膜的方法。溅射法又分为直流溅射、射频溅射、 磁控溅射、离子束溅射等，其中磁控溅射技术具有沉积速度较快、工作气体压 力较低等独特优越性，成为应用最广泛的一种溅射沉积法。王豫【1 5 】等利用磁控 溅射法在石英玻璃基片上制备了w 0 3 薄膜，测量了薄膜的伏安特性和显微结 构。实验表明，通过该种方法制备了颗粒小于1 0 0r a m 的w 0 3 多晶膜，薄膜 具有良好的非线性电学行为。 真空蒸发法的原理是在高真空条件和高纯惰性气氛下( a r ，h e ) ，对蒸发物 质进行真空加热，利用物质在高温下的蒸发现象，以制备各种薄膜材料。蒸发 法包括蒸发冷凝法、电子束蒸镀法、电弧蒸发法、激光蒸发法、空心阴极蒸发 法、热蒸发法等等，其中热蒸发法是使用比较多的方法之一。谢广中【l6 j 等利用 热蒸发法制备了w 0 3 薄膜，并且讨论了不同的退火温度对薄膜结构和形态的 6 第一章前言 影响。 溶胶凝胶转变过程是指一个呈液态、分散高度均匀的体系( 溶液或液胶) 经 化学方式或物理方式的处理，整体转变成一个呈类固态分散高度均匀的体系。溶 胶凝胶法制备材料具有工艺简单、成本较低、低温合成、高度化学均匀性、材 料形状多样性等特点。制备溶胶的方法有：钨酸盐酸化法、钨粉过氧化氢钨酸 法、钨酸盐的离子交换法、钨的醇盐水解法、氯化钨的醇化法等。吴广吲17 j 等 利用过氧化氢与钨粉反应制备溶胶，采用旋转涂膜法在基片表面形成了气致变 色性能很好的w 0 3 纳米结构薄膜。 1 1 3 3 纳米半导体材料在生物传感器中的应用 由于组成纳米材料的纳米粒子具有小的体积和大的比表面，因而表现出独 特的电子、光学和异相催化特性，使其成为表面纳米工程和功能纳米结构制备 的理想对象。纳米粒子在固体表面的二维和三维有序组装，可制备多种复合纳 米光学和电子传感器件，对于保持蛋白质与酶等生物大分子在固体表面上的生 物活性、促进氧化还原蛋白质的直接电子传递和蛋白质或酶与底物间的电子传 递具有重要作用，因此得到电化学、生物电化学和分析化学工作者的广泛关注。 已经报道的应用于生物传感器中的纳米粒子，主要是a u 、a g 、p t 或者 它们的复合粒子等贵重金属 1 8 - 2 7 1 等。我们课题组对基于纳米金的生物传感器已 经进行了一系列的研究，刘海清 2 4 , 2 5 】分别研究了cy t c 和超氧化物歧化酶( s o d ) 在锥状、棒状和球状三种不同形貌纳米金修饰电极表面的电化学和电催化活性， 实现了c ”c 和s o d 直接可逆的电子传递，构建了灵敏度高、选择性好的第三 代活性氧生物传感器；夏陪陪【2 7 1 研究了肌红蛋白( m b ) 在锥状纳米金修饰电极 表面的电催化活性，实现了m b 在修饰电极表面直接可逆的电子传递，并且构 建了h 2 0 2 生物传感器。贵重金属纳米粒子虽然可提高响应灵敏度，但价格昂 贵，不适合将来工业化生产的目标，纳米半导体材料( z r 0 2 、t i 0 2 、z n o 、w 0 3 等) 由于具有较大的比表面积、价格低廉、易制作、良好的电子传递和光电催化 等性质，越来越受到人们的关注。 s o n g q i nl i u 28 j 将直径约为3 5n n l 的z r o2 粒子分散在二甲基亚砜( d m s o ) 溶剂中并与血红蛋白( h b ) 溶液混合，然后将此混合液滴在已抛光的热解石墨 ( p g ) 电极表面来固定h b 分子，在p h7 0 的磷酸盐缓冲液( p b s ) 中，h b z r 0 2 d m s o p g 电极在电位3 4 5 和3 7 8m v ( 1 2 0m vv sn h e ) 处出现一 7 第一章前言 对稳定、峰形对称的氧化还原峰，研究了z r 0 2 纳米粒子在蛋白质固定、直接 电化学与生物传感器方面的应用。 a i h u al i u l 2 9 j 证明了ti 0 2 纳米管( t n t ) 是用来固定m b 的很有效的支持 基体，通过对m b t n t 电极与m b t n p ( t i 0 2 纳米颗粒) 电极进行比较实验， 紫外可见吸收光谱、红外光谱以及电化学测定的结果表明，t n t 膜能够更好地 保持m b 的生物活性，并且促进m b 的直接电子传递，t n t 膜表面的羟基、管 状的形貌和表面电荷是固定蛋白质的重要因素。罗永平【3 0 】报道了s o d 在高导电 性的针状t i 0 2 纳米膜表面实现了直接的电子传递，纳米结构的t i 0 2 不仅促进 了s o d 的直接电子传递，还保持了s o d 的生物活性。 邓子掣3 1 3 2 j 报道了在物理气相沉积法制备的zn o 纳米膜表面，s o d 实现 了直接的电子传递。在p h7 2 5 的p b s 中，s o d 显示出了准可逆的电化学行 为，并能够很好地固定在z n o 纳米膜表面，保持其内在的酶活性。z n o 纳米 颗粒表面促进了s o d 的直接电子传递，另外，s o d 又对超氧阴离子( 0 2 “) 的 岐化具有双向催化活性，这些为构建第三代o2 “生物传感器奠定了基础。另外， 还报道了将电沉积法制备的六角形片状z n o 纳米膜用于构建0 2 “生物传感 器，并且在豆芽里进行了0 2 “的活体检测。 j i u j uf e n g 3 3 】研制了一种新的h b 电极，将hb 吸附在通过一步电沉积法制 备的介孔w o3 表面。在制备的膜上，h b 保持了它的天然构型，固定的h b 在 p h6 0 的缓冲溶液中，电位在2 8 4 和1 7 4m v 处出现了一对稳定以及峰形对 称的氧化还原峰，并且对h 2 0 2 、n 0 2 。和三氯乙酸的还原具有很好的电催化响 应。介孔w 0 3 膜的出现大大加强了蛋白质的固定，加快了界面电子传递和提 高了被吸附的蛋白质的热稳定性。 基于纳米半导体材料那么多的优点，生物兼容性好、可以促进蛋白质的直 接电子传递和化学稳定性等，但经查阅文献可知，关于cy t c 在w o3 纳米膜表 面实现直接电子传递，并构建h 2 0 2 生物传感器的文献尚未见报道。综上所述， 本课题具有一定的新颖性和研究价值。 1 2 本文研究目的及内容 本文旨在研究一种能够对h 2 0 2 进行准确、快速、方便的检测方法，为在 病理生理条件下实现连续、在线检测h 2 0 2 奠定基础。用于测定h 2 0 2 的方法 第一章前言 有很多，如滴定法、分光光度法，化学发光法和电化学法等，但由于电化学法 具有直接、实时测定和便于实际应用等优点，越来越受到国内外学者的广泛关 注。在电化学法中，主要是基于氧化还原蛋白质和酶直接电子传递的第三代生 物传感器用于测定h2 0 2 的研究【3 4 4 7 1 ，被用于研究的蛋白质和酶有：c y t c 、m b 、 h b 、辣根过氧化物酶( h r p ) 等，但在常见的被用于研究的生物大分子中，对于 c y t c 直接电子传递的研究2 5 ，4 8 - 5 2 】最多。由于c y t c 具有在c y t c 还原酶与 c y t c 氧化酶之间传递电子的特殊生物功能，因此c y t c 是用于研究典型酶的电 子传递的出色模型，另外，鉴于进一步的应用，基于c y t c 的h 2 0 2 生物传感器 在适合的外加电位下可以避免o2 的干扰，因为c y t c 不像m b 和h b 那样， 是生物系统中输送o2 的特定蛋白质。 本文的研究内容是：以导电玻璃为基底制作纳米w 0 3 修饰电极，利用 s e m 、x r d 、u v - v i s 、c h i6 6 0 等仪器对修饰电极的表面形貌、晶形和电化学 性质进行表征，随后在制备的电极表面修饰c y t c ，对吸附在w 0 3 膜上的cy t c 的电化学行为进行了研究，并且在此基础上构建性能优越稳定可靠的第三代 h 2 0 2 生物传感器。 1 3 本研究的创新点 纳米w o3 具有生物兼容性、易修饰、低等电点( 有利于高等电点蛋白质的 修饰) 、大的比表面、价格低廉、化学稳定性等性质。基于这些优点，本文首次 选用纳米w 0 3 作为第三代h 2 0 2 生物传感器的电催化材料，研究c y t c 在修 饰电极表面的直接电化学行为。在此基础上，构建一种具有灵敏度高，线性范 围宽，检测限低，选择性好等优越分析性能的h2 0 2 生物传感器，以便于对h2 0 2 进行可靠和持久地检测。因此，本文具有一定的创新性。 9 第二章实验部分 2 1仪器材料和试剂 2 1 1仪器 第二章实验部分 k q 2 2 0 0 d e 型数控超声波清洗机 数显p h 计 万用表 k w 型匀胶机 全自动分析天平 磁力搅拌器 马弗炉 紫外可见分光光度计( a g i l e n t8 4 5 3 ) q u a n t a 2 0 0 f 扫描电子显微镜 d 8x 射线衍射仪 c h i6 6 0 型电化学系统 2 1 2 材料及试剂 ( 昆山市超声仪器有限公司) ( 上海精密科学仪器有限公司) ( 上海精密科学仪器有限公司) ( 中国科学院微电子中心) ( 上海精密科学仪器有限公司) ( 上海精密科学仪器有限公司) ( 上海实研电路有限公司) ( 安捷伦公司，美国) ( f e ic o m p a n y ，美国) ( b r o k e r a x s ，美国) ( c hi n s t r u m e n t s 公司，美国) 材料：i t o 玻璃( 。1 0qc m ，深圳南玻显示器件科技有限公司) ；三氧化钨粉 木( 2 0 一5 0n m ) 试剂：无水乙醇( a r ，国药) ；氢氧化钾( a r ，国药) ；氯化钾( a r ，国药) ； 磷酸二氢钾( a r ，国药) ；三水磷酸氢二钾( a r ，国药) ；铁氰化钾( a r ，国 药) ；三水亚铁氰化钾( a r ，国药) ；3 0 过氧化氢( a r ，国药) ：马心细胞色 素c ( m w1 3 0 0 0 ，s i g m a ) ；抗坏血酸( a r ，国药) ；尿酸；苦杏仁酸；多巴胺； 亚硝酸钠( a r ，国药) ；硝酸钾( a r ，国药) ；亚硫酸钠( a r ，国药) ；实验用 水均为二次蒸馏水，电解液在使用前通氮气3 0 分钟。 l o 第二章实验部分 2 2w o 3 修饰电极的制备 ( 1 ) 导电玻璃( i t o ) 的清洗 在超声波清洗机中首先用洗洁精泡沫水清洗3 0m i n ，然后用无水乙醇清洗 3 0m i n ，接着用lm o l ln a o h 清洗4 5m i n ，最后用去离子水冲洗干净并吹干， 使i t o 具有良好的亲水性。 ( 2 ) w 0 3 纳米膜修饰电极的制备 称取1g 三氧化钨粉末于烧杯中，加入2 0m l 蒸馏水，用玻璃棒搅拌，为 了使粉末在蒸馏水中分散均匀，将烧杯放入超声波清洗机中超声2 小时，得到 w 0 3 溶胶，然后将溶胶滴到i t o 表面，在匀胶机上，用旋转涂膜法进行涂膜， 最后将w 0 3 薄膜覆盖的i t o 置于马弗炉中，于50 0o c 下，在空气氛围中热处 理1 小时。 ( 3 ) 细胞色素c 修饰电极的制备 将制备的w0 3 膜插入0 2mm o l l 细胞色素c 的溶液中于4 冰箱中 浸泡一定时间后，取出并用蒸馏水冲洗，置于p b s 缓冲溶液中待用。该修饰电 极记作：c y t c w 0 3 i t o 2 3 测量方法 测量方法包括电极表面的表征方法和电化学测定方法两部分。 对纳米修饰电极进行一系列物理化学性质的表征是研究的重要组成部分。 本研究的表征主要手段有扫描电子显微镜( s e m ) 、x 射线衍射( x r d ) 、紫外 可见分光光度法( u v o v i s ) 等。 ( 1 ) 扫描电子显微镜( s e m ) 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的 探测器收集，形成电信号送到显像管，在荧光屏上显示物体。由于观察试样的 景深大，图像富于立体感，而且样晶制备简便，适合于表征修饰电极的表面形 貌。 ( 2 ) x 射线衍射( x r d ) 晶体可以作为x 射线的空间衍射光栅，即当一束x 射线通过晶体时将发 生衍射，衍射波叠加的结果使射线的强度在某些方向上加强，在其他方向上减 第二章实验部分 弱。分析在照相底片上得到的衍射花样，便可确定晶体结构。x 射线衍射常用 于晶体结构分析、物相的定性及定量分析、结晶度的分析、晶粒大小及点阵畸 形分析、晶粒大小分布分析、颗粒度分析( 小角散射) 、残余应力分析、结构( 择 优取向) 分析等方面【5 3 。 ( 3 ) 紫外可见分光光度法( u v - v i s ) 由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而 产生的吸收光谱，它反映了分子中某些基团的信息。利用紫外可见光谱，可以 测定待测物质的特征吸收峰，从而对物质进行初步定性。由于蛋白质在可见光 区有特征吸收峰，因此可以通过测定蛋白质的紫外可见吸收光谱，根据吸收峰 的位置来判断蛋白质的生物活性。 电化学是内容非常广泛的科学领域，它涵盖了界面电化学、分析电化学、 生物电化学、腐蚀、电沉积和表面处理等方向1 53 。电化学的实验测定方法很多， 本研究中用的较多的是循环伏安法、交流阻抗法和计时电流法。 ( 1 ) 循环伏安法( c y c l i cv o l t a m m e t r y ，c v ) 循环伏安法可以得到的信息数据多，它是电化学测量中经常使用的一个重 要方法。循环伏安法【5 4 】是对工作电极施加三角波电位，起始电位开始沿某一方 向变化，到达终止电位后，又反方向回到起始电位，得到的电流电压曲线包括 两支。如果前半部扫描是反应物在电极上被氧化的阳极过程，那么后半部扫描 过程中是氧化产物又重新被还原的阴极过程，因此一次三角波扫描，完成一个 氧化和还原过程的循环，故称循环伏安法。示意图如图2 1 和2 2 所示： 1 0 u u - 1 0 6 f t 2 - 0 2 2 0加印 时间( ) 图2 1 三角波图 1 2 第二章实验部分 o x + l e r e d y 一一 i 图2 2 循环伏安曲线 循环伏安法可用来判断电极过程的可逆性，循环伏安法中电压的扫描过程 包括阴极与阳极两个方向，从所得的循环伏安图的氧化波和还原波的峰高和对 称性中可判断电活性物质在电极表面反应的可逆程度。若反应是可逆的，则曲 线上下对称，若反应不可逆，则曲线上下不对称。不同电极过程的判据见表 2 1 ： 表2 1 电极过程判据 c v 电极过程 崛，k ，玷。与l ，的关系 k ，i p , o v 1 陀 ( 1 ) 可逆过程 f p a i i p c 21 a e p 2 5 8 门m v i p c o v 舵1 p a = 0 ( i i ) 不可逆过程 e p = 6 + 詈时m v k ，i p a c 5 8 刀m v 第二章实验部分 ( 2 ) 电化学阻抗谱( e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ，e i s ) 电化学阻抗谱早期称为交流阻抗( a ci m p e d a n c e ) 【5 5 】，是一种以小振幅的 正弦波电位( 或电流) 为扰动信号，从得到的响应信号电流( 或电位) 求算等效 电路，推测电极反应机理的方法。将等效电路与其他电极过程结合，推测其电 极系统中包含的动力学过程的机制，同时可确定等效电路中有关元件的参数值， 计算出动力学参数。 电化学研究表明，一个电极系统在小幅度的扰动信号作用下，各种动力学 过程的响应与扰动信号之间呈线性关系，所以可以把每一个动力学过程用电学 上的一个线性元件或几个线性元件的组合来表示，例如电荷转移过程可以用一 个电阻来表示，双电层充放电过程可以用一个电容的充放电过程来表示等等。 这样就把电化学动力学过程用一个等效电路来描述，通过对电极系统的扰动和 响应，求得等效电路各个元件的数值，从而推断电极体系的反应机理。 等效电路法是电化学阻抗谱的主要分析方法。因为由等效电路来联系电化 学阻抗谱与电极过程动力学模型的方法比较具体，一些简单的电化学阻抗谱的 分析中可以用电阻参数尺。表示参比电极与研究电极之间的溶液电阻。尺。基本 上是服从欧姆定律的纯电阻，其阻值可由溶液电阻率以及电极间的距离等参数 计算或估计，也可以由试验测定。c d 表示电极与溶液界面的双电层电容。r n 表示电极过程中电荷转移所遇到的阻力( 电荷转移在很多情况下是电极过程的 速度决定步骤) 。z f 表示法拉第阻抗，由于它通常不是纯电阻或电容，在比较 简单的情况下，z f 通常包括电化学极化( 活化极化) 引起的阻抗r 。和浓度极 化引起的阻抗z 。等效电路图如图2 3 所示。 1 4 第二章实验部分 l f a b 图2 3 ( a ) 电化学电池等效电路图( b ) 法拉第阻抗组成 如果修饰膜的表面几乎不存在缺陷，则在交流阻抗所得到的n y q u i s t 圆的 低频区域，将出现一条直线，而在高频区域，则呈现出半圆形状，其高频区域 半圆直径的大小可以直接反映膜表面电阻的大小和异相电子转移速率的差异。 ( 3 ) 计时电流法( a m p e r o m e t r i cc u r r e n t t i m e ，i - t ) 在计时电流方法中，外加一个恒电压，电流作为时间的函数被记录下来。 图2 4 显示了电压波形作为时间的函数和样品的图解。 量 = ： ： = o 0 色 图2 4 计时电流法图解 t i m e ( s ) 第二章实验部分 以上三种电化学方法均在电化学工作站c hi6 6 0 进行，采用三电极体系， 修饰电极为工作电极，a g a g c i 电极为参比电极，p t 电极为辅助电极。 1 6 第三章w 0 3 纳米修饰电极的物理化学性质 第三章w o ，纳米材料的物理化学性质 31表面形虢及晶形表征 ( ”表面形貌 分别用s e m 对i t o 和通过旋转涂膜法制得的w 0 3 纳米膜的表面形貌 进行了表征，从s e m 的照片上可以清楚地观察到i t o 和w0 3 纳米微粒的表 面形貌，图3 1 为空白i t o 基底的s e m 图图32 为制得的放大6 万倍的 w 0 3 纳米膜的s e m 图。从圈32 可以看出，w 0 3 纳米微粒已经均匀地覆盖 在了i t o 的表面上，用旋转涂膜法制得的w 0 3 膜是一种多孔纳米膜，w 0 3 纳 米微粒的直径大约为1 0 0n m ，这为蛋白质的修饰提供了更大的表面积( 较 i t o ) ，从而更有利于蛋白质的修饰。 慧 图31i t o 的扫描电子显微镜图 第三章w o ，纳米修饰电极的物理化学性质 闰32 w 0 3 纳米膜的扫描电子显微镜图 ( 2 ) 晶形表征 本文对i t o 和制得的w 0 3 纳米膜分别进行了x r d 表征( 图3 3 ) 其 中a 为i t o 的x 射线衍射光谱，b 为修饰w0 3 纳米微粒的x 射线衍射光 谱。从a ，b 的对比可以看出，b 中出现了几个w 0 3 的特征衍射峰，其中三强 峰对应的2o 值分别等于2 3 1 25 。，2 36 4 8 。，2 42 6 2 。，表3 1 为根据图3 3 数据绘制的关于w o ，纳米微粒的2 0 值和标准值的比较，从表中可以明显地看 出本实验制备的wo 纳米膜的三强峰与j cp d sc a r dn o2 0 1 3 2 3 值非常相近。 该三强峰对应的晶面分别是( 2 0 0 ) 面、( 0 0 2 ) 面、( 0 2 0 ) 面强度大小为( 2 0 0 ) ( 0 0 2 ) ( 0 2 0 ) 。实验结果表明本实验制各的w0 3 纳米膜的主要结构是三斜晶 系【5 6 。5 8 1 的，而20 0 晶面对应的虽强衍射峰表明，w 0 3 是沿着2 0 0 晶面取向优 先生k 的。 第三章w 0 3 纳米修饰电极的物理化学性质 2 ld 一002 卅 、 b 。j - a -i 2 53 0弱加 勾，d 叼啪 图3 3 i t o ( a ) 和w 0 3 纳米膜( b ) 的x 射线衍射光谱 表3 1w 0 3 纳米微粒的20 值和标准值的比较 x r d 三强峰20 0 0 20 2 02 0 0 w 0 3 纳米微粒 2 3 1 25 o 2 3 6 48 。2 4 2 6 2 。 j c p d sc a r d 2 3 1 43 。 2 3 6 43 o 2 4 3 66 。 n o 2 0 1 3 2 3 ( 3 ) 紫外可见光谱表征 本文利用紫外可见分光光度计( a g i l e n t8 4 5 3 ) 测定了制备的w 0 3 纳米膜 的紫外可见吸收光谱，如图3 4 所示，以i t o 作为背景，从图中可见，该w0 3 纳米膜的吸收峰位于31 5n m 。 1 9 娜 舢 姗 伽 舌至 o =p、空isc3ul 第三章w 0 3 纳米修饰电极的物理化学性质 o u c 日 口 l o 丑 图3 4 纳米w 0 3 膜的紫外可见吸收光谱 根据公式( 3 1 ) ： e = h c a ( 3 1 ) h = 6 6 3 8 1 0 3 4 kjm o l 一一普朗克常量 c = 3 0 1 0 8m s 一光在真空中的传播速度 九= 5 1 5n n l w 0 3 吸收峰的切线与横坐标的交点所对应的波长 计算了w0 3 的室温禁带宽度，所得结果为e 2 4 1e v ，这与文献值2 7 0 e v 5 9 1 在数值上相近。 3 2 等电离点( p k a ) 的测定 本文测定了制备的w 0 3 膜的p k a 值。 董绍俊等提出了用电化学滴定的 方法可以测定自组装单层的表面pk a 值【6 0 ，文中指出在自组装单层中存在特定 的末端基团，如c o o h 、n h 2 、o h 。这些基团通过所带的电荷影响着自组 装单层的表面性质，因此可以通过测定不同p h 值下，k 3 f e ( c n ) 6 在研究电极 表面电化